专利名称：同步检测单纯疱疹病毒i型和ⅱ型的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种同步检测单纯疱 疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂盒，适用于单纯疱疹病毒I型和II型同步定性定量 检测。
背景技术：
单纯疱疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起人类 多种疾病的常见病原体。HSV有HSVl和HSV2两个亚型，两个亚型的核苷酸同源性达50%， 而感染方式和临床表现却不相同。HSVl主要通过口腔分泌物的接触而感染。人群感染率高达50% -90%，最常见的 感染部位是口腔和唇，可引起原发感染，且可造成潜伏感染和复发。HSVl原发感染常引起口 咽部疱疹、疱疹性角膜结膜炎、脑炎和皮肤疱疹性湿疹等；HSVl潜伏感染位于三叉神经节 和颈上神经节部位，潜伏病毒可被激活转为增殖性感染，病毒沿感觉神经纤维轴索下行返 回末梢，在局部上皮细胞内增殖，引起局部复发性疱疹。近年来随着口 -生殖器性行为的增 多，HSVl导致的生殖器疱疹正日益增多。HSV2则主要通过性接触而感染。常潜伏在骶神经根区，可引起生殖器疱疹和新生 儿疱疹，并与女性外阴癌和宫颈癌的发生有关；HSV2导致的生殖器疱疹容易复发，其复发 比HSVl率高5-15倍，是引起人们性心理障碍的主要原因之一，可显著降低感染者的生活 质量；HSV2是人类免疫缺陷病毒(HIV)性传播的重要协同辅助因素之一，其感染使HIV感 染的危险性提高三倍；我国育龄妇女HSV2的感染率约为2. 5%，孕妇感染HSV2后可导致流 产、早产、胎儿先天异常和新生儿疾病等，严重影响人类优生优育。因此准确及时地诊断和区分HSVl与HSV2对指导临床治疗、评估疾病的发展和预 后具有重大意义。临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费 力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产 生污染导致的假阳性等问题；因此实时荧光定量PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和 特异性，已逐步应用到临床中。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种同步检测单纯疱疹 病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒。本发明采用以下技术方案一、PCR 试剂盒本试剂盒包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSVl标准阳性模板 PMD18-T-HSVUHSV2标准阳性模板PMDl8-T-HSV2和阴性质控标准品；1、DNA 提取液
DNA提取液组成提取液I 配制 0. OlM PBS(28. 94g Na2HP04 · 12Η20，2· 6g KH2P04 · 2H20 加入 1000ml超净水混勻，调pH到7. 4)；提取液II 在 pH7. 4Tris-EDTA 缓冲液(ρΗ7· 610mM Tris. HCL，pH8. OlmMEDTA)中， 按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制，将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透明 管)内。分装量5ml/管。2、荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型和II型特异性引物对和荧光探针单纯疱疹病毒I型(HSVl)1)正向引物为 5' -GACGCCATATCCACCACCTTC-3‘，反向引物为5' -TGATGTGCGTCGCGTTGTAC-3‘；2)荧光探针序列为 5' -CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC-3‘；荧光探针5'端标记报告荧光基团HEX，3'端标记不发光的淬灭基团标记 Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰单纯疱疹病毒II型(HSV2)1)正向引物为 5 ‘ GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3 ‘，反向引物为5 ‘ -TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3 ‘；2)荧光探针序列为 5' -CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3‘；荧光探针5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记不发光的淬灭基团标记 Eclipse。3、HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1是含有单纯疱疹病毒I型高度保守基因_GB 基因的139个碱基对的核苷酸片段构成的PMDlS-TCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α
中增殖。HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2是含有单纯疱疹病毒II型高度保守基因GB基 因79个碱基对的核苷酸片段构成的PMDlS-TCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖。4、阴性质控标准品该阴性质控标准品为无菌双蒸水，用于阴性对照。二、PCR试剂盒的制备和检测方法PCR试剂盒的制备和检测方法包括下列步骤①配制DNA提取液；②配制荧光定量PCR反应液；③配制HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1和HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2 ；④配制阳性定量标准品；⑤配制阴性质控标准品；⑥判断未知样本的阴阳性。应用DNA提取液提取未知检测样本得到DNA，后再取HSVl阳性定量标准品、HSV2 阳性定量标准品和阴性质控标准品分别加入装有荧光定量PCR反应液的PCR反应管中，然 后置于PCR荧光定量仪中进行反应；其中，以阳性定量标准品反应曲线作为标准对照，阴性 质控标准品反应曲线作为阴性对照，以阳性定量标准品反应曲线判断阳性样本的浓度。从而判断未知样本的阴阳性及浓度。本试剂盒的工作原理在本发明提供的同步快速定量检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂 盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互 靠近，5'端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭， 故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引 物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这 样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定 量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对单纯疱疹病 毒I型和II型的定量可通过与标准品的循环域值(CT，ThreShold Cycle)相比较得出。CT 值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，CT值与起始模数呈一定比例 关系，CT值越小，起始模板数越多，相反，CT值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模 板的CT值制成标准曲线，再根据待测样品的CT值可准确测出该样品的起始拷贝数。在本发明提供的同步检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂盒中，针对 单纯疱疹病毒I型和II型检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针 浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统 相结合，将其用于单纯疱疹病毒I型和II型同步定量检测。通过优化方案，反复实验，建立 了同步检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR方法，并研制出同步检测单纯疱疹病毒 I型和II型荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出lOcopies， 可以满足快速诊断单纯疱疹病毒I型和II型的要求。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果1、特异性好，灵敏度高，定量准确；2、检测速度快，仅1. 5小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；3、使用步骤简单，可重复性高；4、可同步检测单纯疱疹病毒I型和II型；5、可同时进行高通量的样品检测。本试剂盒可对单纯疱疹病毒I、II型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用 的传统的培养法。
具体实施例方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克 等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社， 2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。一、关于制备和检测方法的实施例1、试剂盒组成与配制①DNA提取液
提取液I 配制 0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6g KH2PO4 ·2Η20 加入 1000ml 超净水混勻，调PH到7. 4)。提取液II 在 pH7. 4Tris-EDTA 缓冲液(ρΗ7· 610mM Tris. HCL，pH8. OlmMEDTA)中， 按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制。将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透 明管)内。分装量5ml/管。②荧光定量PCR反应液(50 μ 1体系)荧光定量PCR 反应液包含PCR IOXbuffer 10. 0 μ 1，10 μ mol/L HSVl 正向引 物和反向引物各1. 5μ l，10ymol/L HSV2正向引物和反向引物各1. 5 μ 1，5 μ mol/L HSVl 荧光探针 1. 0 μ 1，5 μ mol/L HSV2 荧光探针 1. 0 μ 1，25mmol/L MgCl27. 0 μ 1, lOmmol/L dNTPsl. 0μ 1,2. 5U/y 1 H0TSTART Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ 1，无菌双蒸水 23. 6 μ 1，反应液总 体积45 μ 1。其中荧光探针为所示的核苷酸序列，HSVl荧光探针5'端标记ΗΕΧ，3'端标记 不发光的淬灭基团标记Eclipse ;HSV2荧光探针5'端标记FAM，3'端标记不发光的淬灭基 团标记Eclipse。③HSVl 标准阳性模板 PMD18-T-HSV1HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1是含有单纯疱疹病毒I型高度保守基因gB基 因139个核苷酸片段构成的PMDlS-TCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5 α增殖 后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A26tl定量并稀释至IO9Copies/ ml，-20°C保存。贮存浓度为109COpieS/ml，使用前进行10倍梯度的系列稀释。④ HSV2 标准阳性模板 PMD18-T-HSV2HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2是含有单纯疱疹病毒II型GB基因79个核苷酸 片段构成的PMDlS-TCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5 α增殖后用碱裂解法提 取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A26tl定量并稀释至109COpieS/ml，-20°C保存。 贮存浓度为109COpieS/ml，使用前进行10倍梯度的系列稀释。⑤将阳性标准模板系列稀释为IO8拷贝/ml、107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ ml、IO4 拷贝 /ml、IO3 拷贝 /ml。⑥阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。二、关于试剂盒的应用实施例1、使用试剂盒同步检测单纯疱疹病毒I型和II型①在标本试管中加入Iml无菌生理盐水，充分震荡摇勻，转至1.5ml离心管中， IOOOOg离心lOmin，再重复洗涤1次。沉淀直接加50 μ 1 DNA提取液充分混勻，沸水浴 IOmin, IOOOOg离心2min,取上清液5 μ 1做PCR反应。②将阳性标准模板系列稀释为108Cop i es/ml、107Cop ies/ml、lO6Cop ies/ml、 105copies/ml、104cop ies/ml、103cop ies/ml ο③分别取荧光定量PCR反应液各45 μ 1，取第①步所得HSV1DNA和第②步稀释的 HSVl阳性标准模板各2. 5 μ 1，取第①步所得HSV2DNA和第②步稀释的HSV2阳性标准模板 各2. 5 μ 1，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检 测。循环条件为95°C预变性300s ；95°C 10s,58°C 40s，扩增40个循环。该双重试剂盒中 HSVl所用的荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm ；HSV2所用的荧光为R0X，其吸收波长588nm，发射波长608nm。2、实验结果荧光定量PCR反应结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为 HSVl 标准阳性模 108copies/ml、107copies/ml、106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、 103copies/ml 的 CT 值分别为 16. 11，19. 62,22. 33,26. 98,30. 59,34. 02 ；HSV2 标准阳性模 108copies/ml、107copies/ml、106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml 的 CT 值分别为 16. 71，20. 02，23. 16，27. 35，31. 14，34. 57 ；阴性对照为 40。反复重复试验3次，得到HSV2值进行统计学分析P > 0. 05，数据差异无显著意义， 说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。从上述实例可以说明，此发明实时TaqMan荧光定量PCR检测体系，可以用于HSVl 和HSV2的同步定量检测和快速鉴定。在提前处理好临床样品的前提下，实时TaqMan荧光 定量PCR检测只需要花1. 5小时，而常规PCR检测由于需要PCR产物凝胶电泳分析，大约需 要4小时，培养法则需要数天时间。而且实时TaqMan荧光定量PCR在扩增的同时以闭管 方式进行实时荧光信号监控与分析，从而降低了 PCR产物交叉污染导致假阳性结果的可能 性，大大加强了检测的特异性。TaqMan-MeB探针可以有效鉴别等位基因中单个碱基的变异。 我们使用阳性对照标准株，临床分离株，阴性对照标准株来验证了该反应体系，实验结果均 表现出极好的特异性。用本发明的方法同步检测单纯疱疹病毒I型和II型具有快速简单、灵敏度高、特 异性强的优点，具有更加重要的使用价值。
权利要求
一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV1标准阳性模板PMD18 T HSV1、HSV2标准阳性模板PMD18 T HSV2和阴性质控标准品；荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型和II型特异性引物对和荧光探针；①单纯疱疹病毒I型 HSV1正向引物为5′ GACGCCATATCCACCACCTTC 3′，反向引物为5′ TGATGTGCGTCGCGTTGTAC 3′；荧光探针序列为5′ CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC 3′；荧光探针5′端标记报告荧光基团HEX，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse。②单纯疱疹病毒II型 HSV2正向引物为5′ GCTTCCTCATCGCGTACCAG 3′，反向引物为5′ TCCTGCTCCCGCATGTACTC 3′；荧光探针序列为5′ CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG 3′；荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse。
2.按权利要求1所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于包括下列步骤①配制DNA提取液；②配制荧光定量PCR反应液；③配制HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1和HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2；④配制阳性定量标准品；⑤配制阴性质控标准品；⑥判断未知样本的阴阳性。
3.按权利要求2所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于步骤③ HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1包含的GB基因的核苷酸序列为 GACGCCATATCCACCACCTTCACCACCAACCTGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTNGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGGACCGCATMTTMGCCCGCAGGTACAACGCGACGCACATMA ； N:G或者T ;M:C或者T。HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列为 GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGA GCAGGA。
全文摘要
本发明公开了一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术。本发明由DNA提取液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板PMD18-T-HSV1、标准阳性模板PMD18-T-HSV2和阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型和II型特异性引物对和荧光探针。本发明特异性好，灵敏度高，定量准确；检测速度快；使用步骤简单，可重复性高；可同步检测单纯疱疹病毒I型和II型；可同时进行高通量的样品检测。本试剂盒可对单纯疱疹病毒I、II型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。
文档编号G01N21/64GK101979667SQ201010533949
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者唐景峰, 王业富, 王维旭, 赵友云 申请人:武汉百泰基因工程有限公司