专利名称：使用hplc-dad同时测定丹红注射液中6种有效成分含量的方法
技术领域：
本发明属于中药质量检测领域，具体是一种使用HPLC-DAD同时测定丹红注射液中6种有效成分含量的方法。
背景技术：
丹红注射液是由传统的活血化瘀中药丹参、红花提取的复方制剂，具有活血化瘀，改善微循环，降低血液黏度，加快血液流速，清除氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，抑制动脉粥样硬化等作用。在临床上广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、急性脑梗死、慢性肺心 病、血栓闭塞性脉管炎、萎缩性胃炎以及高血压肾病等。丹红注射液的君药丹参主要含丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等水溶性成分。《国家中成药标准汇编、内科、心系分册》中关于丹红注射液的国家药品标准(试行)颁布件中仅对丹参素钠和原儿茶醛2种有效成分进行质量控制。由于丹红注射液中所含成分比较复杂，难以将6种有效成分与其他成分很好的分离，达到HPLC定量测定的要求。鉴于这一原因，故建立一种同时测定丹红注射液中6种有效成分含量的方法具有重要的现实意义。

发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种使用HPLC-DAD同时测定丹红注射液中6种有效成分含量的方法。可以有效解决以丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A作为指标性成分，同时进行含量测定，为丹红注射液质量标准奠定基础的问题，实现本发明的具体技术方案是
一种使用HPLC-DAD同时测定丹红注射液中6种有效成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤
1)精密吸取丹红注射液，加超纯水稀释，摇匀，经滤膜滤过，即得供试品溶液；
2)精密称取对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，分别置容量瓶中，加超纯水溶解，稀释，混匀，作为对照品储备溶液，于4°C冰箱内冷藏备用；
3)再分别精密吸取6种对照品储备溶液，加超纯水稀释，准确配制丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的混合对照品溶液；
4)用以下色谱条件进行HPLC-DAD法检测色谱柱EclipseXDB-C18 4.6X 150 mm, 5U m ;流动相包括流动相A 乙腈和流动相B :体积百分含量0. 05% - 0. 1%的磷酸水溶液；采用梯度洗脱方式，乙腈占流动相的体积比在下述范围内随着时间的增加而增加0-6 min,5%-5% ；6-16 min, 5%-15% ； 16-30 min, 15%-26% ；35-40 min, 26%_27% ;DAD 检测器检测波长检测丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用270-290 nm，检测咖啡酸、迷迭香酸使用 320 -340nm ;柱温25_35°C ;流速:0. 7-1. 2 mL mirT1 ；
5)取混合对照品溶液，分别用超纯水稀释不同的倍数，取上述稀释混合对照品溶液与原混合对照品溶液各进样10 u 1，记录色谱图和峰面积，分别以6种有效成分色谱峰的峰面积Y为纵坐标，以浓度X，y g mL-1为横坐标进行线性回归，得标准曲线的回归方程和相关系数； 6)分别取不同批号的丹红注射液，按供试品溶液的制备方法配制样品溶液，分别进样10 u L，测定峰面积，每批样品测定3次，计算得到不同批号丹红注射液中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量。所述的方法，其特征在于步骤I)中精密吸取丹红注射液2mL，置IOmL容量瓶中，力口超纯水稀释至刻度，摇匀，经0. 45 um滤膜滤过，即得供试品溶液。所述的方法，其特征在于步骤2)中精密称取对照品丹参素钠6. 55mg、原儿茶醛
5.05mg、咖啡酸I. 55mg、迷迭香酸5. 45mg、丹酚酸BIO. 95mg、丹酚酸A5. 60mg，分别置5mL容量瓶中，加超纯水溶解，稀释至刻度，混匀，作为对照品储备溶液，于4°C冰箱内冷藏备用。所述的方法，其特征在于步骤3)中再分别精密吸取一定量的6种对照品储备溶液，加超纯水稀释，准确配制丹参素钠I. 310 mg mL'原儿茶醒0. 101 mg mL'咖啡酸
0.0041 mg .mL'迷迭香酸0. 109 mg .mL'丹酌 酸B 0. 219 mg .mL'丹酌 酸A3. 360 mg .mL-1的混合对照品溶液。所述的方法，其特征在于步骤4)中流动相B磷酸水溶液的体积百分含量为0. 1%。所述的方法，其特征在于步骤4)中DAD检测器检测波长检测丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用280 nm，检测咖啡酸、迷迭香酸使用330nm。所述的方法，其特征在于步骤4)中柱温是30°C。所述的方法,其特征在于步骤4)中流速是I. 0 mL mirT1。所述的方法，其特征在于步骤5)中取混合对照品溶液，分别用超纯水稀释I. 25，5，10，20，100倍，取上述5种稀释混合对照品溶液与原混合对照品溶液各自进样10 yl，记录色谱图和峰面积，分别以6种有效成分色谱峰的峰面积Y为纵坐标，以浓度X，y g mL—1为横坐标进行线性回归，得标准曲线的回归方程和相关系数。本发明采用HPLC - DAD法，运用梯度洗脱测定了丹红注射液中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A 6种有效成分的含量。计算得丹红注射液中6种有效成分的线性关系，结果见表I。表I 6种有效成分的线性关系fc=6)
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本发明的方法简便、灵敏度高，重现性好，解决了目前丹红注射液的质量评价不能全面地反映丹红注射液质量的问题，以对丹红注射液的质量进行多指标的控制，为科学评价和有效控制丹红注射液的质量提供更科学的依据。


图1是丹参素钠对照品的紫外可见吸收光谱 图2是原儿茶醛对照品的紫外可见吸收光谱 图3是咖啡酸对照品的紫外可见吸收光谱 图4是迷迭香酸对照品的紫外可见吸收光谱 图5是丹酚酸B对照品的紫外可见吸收光谱 图6是丹酚酸A对照品的紫外可见吸收光谱 图7是混合对照品溶液在280nm的色谱 图8是混合对照品溶液在330nm的色谱 图9是供试品溶液(No. 110934)在280nm的色谱 图10是供试品溶液(No. 110934)在330nm的色谱 图7至图10中，I.丹参素钠；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；4.迷迭香酸；5.
丹酚酸B ;6.丹酚酸A。
具体实施例方式材料
Agilent 1200型高效液相色谱系统(包括G1311A四元梯度泵、G1316A柱温箱、G131 二极管阵列检测器、G1315D DAD检测器、G1322A在线脱气机和化学工作站)。超纯水仪(美国Milipore公司)；XS105DualRange分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。丹红注射液(菏泽步长制药有限公司，规格10 mL/支)；丹参素钠对照品(批号110855-200809)、原儿茶醛对照品(批号110810-201007)、咖啡酸对照品(批号20120211)、迷迭香酸对照品(批号111871-201102)购于中国药品生物制品检定所；丹酚酸B对照品(批号20110822)、丹酚酸A对照品(批号20120207)购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈(批号102489)、甲醇(批号101437)购于美国Fisher公司，均为色谱纯；磷酸，(批号76643827，国药集团化学有限公司)为分析纯；水为超纯水。方法与结果
2.I供试品溶液的制备精密吸取丹红注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，经0. 45 um滤膜滤过，即得供试品溶液。混合对照品溶液的制备精密称取对照品丹参素钠6.55 mg、原儿茶醛5.05 mg、咖啡酸1.55 mg、迷迭香酸5.45 mg、丹酚酸B 10.95 mg、丹酚酸A 5. 60 mg，分别置5 mL容量瓶中，加超纯水溶解，稀释至刻度，混匀，作为对照品储备溶液，于4°C冰箱内冷藏备用。再分别精密吸取一定量的6种对照品储备溶液，加超纯水稀释，准确配制丹参素钠 I. 310 mg ml/1、原儿茶醒 0. 101 mg mL4、咖啡酸 0. 0041 mg mL'迷迭香酸 0. 109mg mL'丹酹酸B 0. 219 mg mL'丹酹酸A 3. 360 mg mL-1的混合对照品溶液。色谱条件 Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6X150 mm, 5 u m);流动相采用二元体系，A为乙腈，B为0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脱方式为0-6 min，5%A ;6_16 min，5%A_15%A ；16-30 min, 15%A-26%A ；30-40 min, 26%A-27%A ;柱温为 30°C ;流速为 I. 0 mL .mirT1 ;结果得到如图I-图6所示的6种对照品的紫外-可见光谱，由图I及供试品溶液色谱图确定检测波长为280 nm (测定丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A)，330 nm (测定咖啡酸、迷迭香酸)。在所选择的色谱条件下，样品液中6种成分与其他共存峰得到很好的分离，混合对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图7-图10。
2.4线性关系考察取混合对照品溶液，分别用超纯水稀释1.25，5，10，20，100倍。取上述5种稀释混合对照品溶液与原混合对照品溶液各进样10 yl，记录色谱图和峰面积，分别以6种有效成分色谱峰的峰面积⑴为纵坐标，以浓度(X，y g mL-1)为横坐标进行线性回归，得标准曲线的回归方程和相关系数，结果见表I。表I 6种有效成分的线性关系(/7=6)
权利要求
1.一种使用HPLC-DAD同时测定丹红注射液中6种有效成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤 · 1)精密吸取丹红注射液，加超纯水稀释，摇匀，经滤膜滤过，即得供试品溶液； ·2)精密称取对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，分别置容量瓶中，加超纯水溶解，稀释，混匀，作为对照品储备溶液，于4°C冰箱内冷藏备用； ·3)再分别精密吸取6种对照品储备溶液，加超纯水稀释，准确配制丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的混合对照品溶液； ·4)用以下色谱条件进行HPLC-DAD法检测色谱柱EclipseXDB-C18 4.6X 150 mm, 5U m ;流动相包括流动相A :乙腈和流动相B 0. 05% - 0. 1%(体积百分含量)的磷酸水溶液；采用梯度洗脱方式，乙腈占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加0-6min，5%-5% ;6-16 min，5%_15% ; 16-30 min，15%-26% ；35-40 min, 26%_27% ;DAD 检测器检测波长检测丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用270-290 nm，检测咖啡酸、迷迭香酸使用 320 -340nm ;柱温25_35°C，优选 30°C ;流速:0. 7-1. 2 mL mirT1 ； ·5)取混合对照品溶液，分别用超纯水稀释不同的倍数，取上述稀释混合对照品溶液与原混合对照品溶液各进样10 u 1，记录色谱图和峰面积，分别以6种有效成分色谱峰的峰面积Y为纵坐标，以浓度X，y g mL-1为横坐标进行线性回归，得标准曲线的回归方程和相关系数； ·6)分别取不同批号的丹红注射液，按供试品溶液的制备方法配制样品溶液，分别进样10 u L，测定峰面积，每批样品测定3次，计算得到不同批号丹红注射液中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤I)中精密吸取丹红注射液2mL，置IOmL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，经0. 45 um滤膜滤过，即得供试品溶液。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)中精密称取对照品丹参素钠6.55mg、原儿茶醒5. 05mg、咖啡酸I. 55mg、迷迭香酸5. 45mg、丹酹酸BIO. 95mg、丹酹酸A5. 60mg,分别置5mL容量瓶中，加超纯水溶解，稀释至刻度，混匀，作为对照品储备溶液，于4°C冰箱内冷藏备用。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤3)中再分别精密吸取一定量的6种对照品储备溶液，加超纯水稀释，准确配制丹参素钠I. 310 mg 、原儿茶醛0. 101 mg 、咖啡酸 0. 0041 mg mL'迷迭香酸 0. 109 mg mL—1、丹酚酸 B 0. 219 mg mL—1、丹酚酸 A3. 360mg ml/1的混合对照品溶液。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤4)中流动相B磷酸水溶液的体积百分含量最佳为0. 1%。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤4)中DAD检测器检测波长检测丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用280 nm左右，检测咖啡酸、迷迭香酸使用330nm左右。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤4)中流速最佳是I.0 mL mirT1。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤5)中取混合对照品溶液，分别用超纯水稀释I. 25，5，10，20，100倍，取上述5种稀释混合对照品溶液与原混合对照品溶液各进样·10 u 1，记录色谱图和峰面积，分别以6种有效成分色谱峰的峰面积Y为纵坐标，以浓度X，u g mL-1为横坐标进行线性回归，得标准曲线的回归方程和相关系数。
全文摘要
本发明涉及一种HPLC-DAD同时测定丹红注射液中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A6种有效成分含量的方法。实现本发明的具体技术方案是分别制备供试品溶液和对照品溶液，采用HPLC-DAD法进行梯度洗脱，同时测定丹红注射液中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A6种有效成分的含量，本发明方法简便、灵敏度高，重现性好，解决了目前丹红注射液中仅控制2种有效成分的含量，不能全面地反映丹红注射液质量的问题，以对丹红注射液的质量进行多指标的控制，为科学评价和有效控制丹红注射液的质量提供更科学的依据。
文档编号G01N30/02GK102621246SQ20121010725
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者万海同, 付巍, 何昱, 周惠芬, 张恒义, 张茹萍, 盖玉权, 赵涛, 邢攀科, 黄翔 申请人:浙江中医药大学