专利名称：甲型h1n1流感病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种流感病毒检测试剂盒及检测方法，尤其涉及甲型Hmi流感病毒 检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
2009年3月底至4月中旬，墨西哥、美国等地接连爆发新型甲型Hmi流感疫情。 在不足一个月的时间里，疫情已经蔓延至全球34个国家或地区，确诊感染人数达到了 6044 例，其中63例死亡(截止至2009年5月13日)。目前，中国已经发现和确诊了输入性甲型 HlNl流感病患，由此可见，快速灵敏的甲型Hmi流感病毒检测技术成为了保护人民生命健 康、防控疫情在国内大范围流行的第一道屏障。流感病毒属于正粘病毒科。按照病毒的核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的特征，可以 分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三个类型。感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒，其核蛋白的抗 原性与人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感 病毒的，因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。甲型流感 病毒根据血凝素(HA)不同，分为16个亚型，即Hl H16 ；根据神经氨酸酶(NA)不同分为9 个亚型，Nl N9。甲型Hmi流感病毒是单股负链RNA病毒，含有8个基因片段；聚合酶 Bl (polymerase Bi, PBl)、聚合酶 B2 (polymerase B2, PB2)、聚合酶 A (polymerase A, PA)、 血凝素(hemagglutinin, HA)、核蛋白(nucleoprotein, NP)、神经氨酸酶(neuraminidase, ΝΑ) (matrix protein, MP)(nonst ructural protein, NS)。HA由病毒RNA第4区段编码，全长1742 1778nt，是甲型流感病毒主要抗原基因 之一。其合成首先是在内质网中合成HA蛋白前体ΗΑ0，HAO可以水解成为HAl和HA2两个 多肽。这个分解对于流感病毒成功感染宿主细胞至关重要。HA蛋白的胞外区头部具有病 毒受体结合部位，可以识别细胞表面的N-乙酰神经氨酸。HA2多肽的氨基末端为融合肽， 可以插入细胞膜内，介导病毒包膜与细胞膜的融合从而使病毒核酸释放进入细胞质内。HAO 能否被分解成为HAl和HA2两条多肽是决定病毒有无感染能力的先决条件。HA不仅可以 诱导特异性中和抗体的产生，而且还可以刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)反应。HA抗原具有免疫原性，能使人体产生保护性抗体，但其容易变异， 是流感流行的主要原因之一。NP由病毒RNA第5基因片段的NP基因编码，为单体磷酸化蛋白，与3种RNA多聚 酶成分一起形成核糖核蛋白体(RNP)，RNP与病毒的RNA片段形成病毒的核衣壳，而NP是与 RNA结合的主要成分。NP参与病毒复制周期的多个阶段，影响病毒的转录、复制、装配及转 运功能此外，NP也是CTL识别的主要抗原，CTL通过识别MHC-I类分子递呈的核蛋白抗原 肽而清除感染的流感病毒，因而能对不同亚型的病毒株产生交叉保护性。目前国内外检验确诊的方法主要有(1)甲型Hmi流感病毒的核酸扩增，即用 RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)来扩增出此病毒的特异性核酸片段，按照核酸片段的大小加以鉴定，可在取样后3个小时得出结论。但此方法需要多次开盖及凝胶电泳，容易造成 检验环境的污染，凝胶电泳对条带大小的区分率低，易造成判读。( 细胞培养的方法分离 鉴定甲型Hmi流感病毒。这种方法需要的时间较长，技术要求也高，但这是最可靠的确诊 方法。(3)甲型Hmi流感抗原检查，即用免疫学技术，以已知的抗体，来检查标本中的病毒 抗原，但病毒变异如此之快，很难找到与之相匹配的已知的抗体。(4)血清学检查，但患者发 病初期血液中甲型Hmi流感病毒抗体多为阴性或抗体滴度很低，经两周后抗体滴度才有 明显的提高。很显然以上现有的方法都不适用于甲型Hmi流感患者的快速检验诊断。而目前对于流感病毒最快速、最有效、最灵敏的方法就是实时荧光定量PCR，美国 CDC在流感爆发初期已公布了检验甲型Hmi流感病的实时荧光定量PCR的引物和方法。为 了避免专利知识产权的纠纷，我国也急需开发出具有自主知识产权的实时荧光定量PCR检 查方法及试剂盒。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan荧光探针的工作原理为PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特 异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光 基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq聚合酶的 5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测 系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的 累积与PCR产物形成完全同步。现有技术中，存在以下方法甲型Hmi流感病毒荧光定量检测试剂盒及检测方 法(中国专利号200910101243. 3)、一种甲型Hmi流感病毒RNA检测试剂盒(中国专利 号20091016 . 5)、荧光定量PCR检测新型甲型Hmi病毒试剂盒及检测方法(中国专 利号200910089668. 7)、流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒方法(中国专 利号20091008M75. 4)、流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法(中国专利号 200910085476. 9)、一种检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序列(中国专利 号200910087632. 5)。然而，他们存在以下缺点检测位点少，灵敏度低，假阳性率高。对于甲型Hmi流感病毒检测技术的需求不仅仅限于对可能的病患人群进行诊 断，可能携带或感染病毒的动物类入境货品同样需要有效的检测手段。因此，本发明的产品 将针对医疗诊断、卫生检疫和动物检疫等诸多环节。

发明内容
针对现有技术中的不足，根据疫情的发生规律，本发明人在完成新发人猪流感病 毒实时荧光定量PCR检测技术研发的同时，对能收集到的病原样本进行全基因组测序，补 充和丰富本项目的数据收集，并对HlNI流感病毒开发快速检测技术和试剂。通过对截止至2009年5月4日所公布的甲型Hmi流感病毒共计M株病毒的HA 基因和NP基因进行的核酸序列比对分析，得到其保守性区域，并分析所有甲型流感病毒的 六千余条HA基因和三千余条NP序列，寻找甲型Hmi流感病毒的特异性位点，设计实时荧 光定量PCR引物和TaqMan探针，以及涵盖有靶序列位点的核酸片段序列。因此，本发明的一个目的是提供一种甲型Hmi流感病毒检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种甲型Hmi流感病毒检测方法。根据本发明的一个目的，本发明提供的一种甲型Hmi流感病毒检测试剂盒是对 甲型Hmi流感病毒的HA基因上的2个不同区域(HA-1和HA-2)和NP基因上的2个不同 区域(NP-1和NP-幻分别进行特异性检测，即平行检测其4个位点，降低了由于病毒突变而 造成的假阴性率，以达到提高检出率的目的。本发明的平行检测上述4个位点的引物和探 针序列如下表1所示。表 权利要求
1. 一种甲型Hmi流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对甲型Hmi流感病 毒的HA基因上的2个不同区域HA-I和HA-2以及NP基因上的2个不同区域NP-I和NP-2 分别进行特异性检测，从而平行检测其4个位点，平行检测上述4个位点的引物和探针序列 如下
2.根据权利要求1所述的甲型Hmi流感病毒检测试剂盒，其特征在于，其包括以下各项
3.根据权利要求2所述的甲型Hmi流感病毒检测试剂盒，其特征在于，其包括以下各项
4. 一种甲型Hmi流感病毒检测方法，其特征在于，该方法对甲型Hmi流感病毒的HA 基因上的2个不同区域HA-I和HA-2以及NP基因上的2个不同区域NP-I和NP-2分别进 行特异性检测，从而平行检测其4个位点；平行检测上述4个位点的引物和探针序列如下
5. 一种甲型Hmi流感病毒检测方法，该方法包括以下步骤(1)检测样本的制备；(2)使用权利要求1 3中任一项所述的试剂盒对上述检测样本进行检测；(3)结果分析。
全文摘要
本发明提供一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒对甲型H1N1流感病毒的HA基因上的2个不同区域(HA-1和HA-2)和NP基因上的2个不同区域(NP-1和NP-2)分别进行特异性检测，即平行检测其4个位点，降低了由于病毒突变而造成的假阴性率，以达到提高检出率的目的。
文档编号G01N21/64GK102140539SQ20111003036
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者于军, 任鲁风, 单广乐, 张猛, 朱文斯, 王丽, 王绪敏 申请人:中国科学院北京基因组研究所