专利名称：三聚氰胺elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及三聚氰胺含量的试剂盒，特别是检测饲料中三聚氰胺含量的酶联 免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA (Enzyme LinkedlmmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附 剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)三聚氰胺简称三胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白 色结晶粉末，动物长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石， 亦在动物源食品中形成残留，威胁人们的健康，目前三聚氰胺检测方法有气相色谱质谱法 (GC-MS)，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)，液相色谱法等。这些方法操作复杂、成本较高， 推广使用受到限制。
(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的三聚氰胺含量检测试剂盒，其 操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次 连续多个样品中三聚氰胺含量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种饲料中三聚氰胺含量检测的酶联免疫试剂盒，包 括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的15个下凹瓶位、一 个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相 载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶 标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被三聚氰胺偶联抗原制成检测 板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖 板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固 定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于 携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml标准品溶液、Iml酶标二抗浓缩液、7ml三聚氰胺抗 体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶 液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多 个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可 以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的三聚氰胺将和酶标板微孔条上预包被 的三聚氰胺偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度 值与样本中所含三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即 可得出样品中三聚氰胺含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度饲料样本的最低检测限为500μ g/kg ； 相对于其他三聚氰胺检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机、振荡机和 微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于三聚氰胺含量的检测。

图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条2预包被三聚氰胺偶联抗原3固定于酶标板的外框支 撑架1上，酶标反应微孔条2可随要求拆卸；盖板膜4用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时 封盖酶标反应微孔条2，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试 剂瓶5用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶5用于封装50ml浓缩复 溶液；白色帽6的白色PE塑料试剂瓶7用于封装7ml显色液A液，红色帽6的黑色PE塑 料试剂瓶7用于封装7ml显色液B液，黄色帽6的白色PE塑料试剂瓶7用于封装7ml终止 液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶8用于封装Iml酶标二抗浓缩液，绿色帽的白色PE塑料试 剂瓶8用于封装7ml三聚氰胺抗体工作液，黑色帽的半透明PE塑料试剂瓶9用于封装Iml/ 瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具10有15个下凹瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶 位18，50ml浓缩复溶液11，7ml显色液A液瓶位14，7ml显色液B液瓶位13，7ml终止液瓶 位12，7ml三聚氰胺抗体工作液瓶位16，Iml酶标二抗浓缩液瓶位15，7个Iml/瓶各种浓度 的标准品溶液瓶位17，盒体为19是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液配液1:0. IM盐酸取4. 15ml浓盐酸加去离子水溶解定溶至500ml ；配液2:提取工作液称取2. Og氯化钾溶于IOOml 0. IM盐酸，混勻；配液3:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1进行稀释；配液4 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2.饲料样本处理步骤称取2. 0士0. 05g粉碎的饲料样本，至50ml聚苯乙烯离心管中；加入IOml提取工 作液，用振荡器振荡5min ；3000g以上，室温(20_25°C )离心IOmin ；移取Iml上清液加入三 聚氰胺饲料净化小柱，用2ml离心管收集，让其自由滴落30min，丢弃三聚氰胺饲料净化小 柱；移取上述收集滤液50 μ 1至950 μ 1复溶工作液中，充分混勻；取50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤[0028]1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本加标准品/样本50μ1到对应的微孔中，然后用抗体以10 1 的体积比进行稀释酶标二抗浓缩液，混合，立即加入混合液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖 板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、显色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用 盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。8、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双 波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止 液用目测法可进行判定)。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与三聚氰胺含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 351，样本2的吸光度值为0. 801，标准液吸光度值分别是 0 μ g/L 为 2. 014 ； 1 μ g/L 为 1. 518 ;3 μ g/L 为 1. 182 ；9 μ g/L 为 0. 648 ；27 μ g/L 为 0. 287 ； 81 μ g/L为0. 105。则样本1的浓度范围是45 μ g/L-135 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即 可得出样本中三聚氰胺含量的浓度范围；样本2的浓度范围是15 μ g/L-45 μ g/L再乘以其 对应的稀释倍数即可得出样本中三聚氰胺含量的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
权利要求一种三聚氰胺ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被三聚氰胺偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗浓缩液、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶标 二抗浓缩液用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液 用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色 PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料 瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔 预包被三聚氰胺偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/ 瓶；酶标二抗浓缩液1瓶，Iml ；抗体工作液1瓶，7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1 瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶，40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测饲料中三聚氰胺含量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗浓缩液、三聚氰胺抗体工作液、三聚氰胺7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的三聚氰胺将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中三聚氰胺的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在三聚氰胺的含量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK201740783SQ20102028418
公开日2011年2月9日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者万宇平, 何丽霞, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 汪善良, 王建霞, 罗晓琴, 赵正苗 申请人:北京望尔生物技术有限公司;北京望尔康泰生物技术有限公司