专利名称：一种Au-TiO₂-AChE复合体系及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于电化学分析技术领域，具体涉及一种可用于光电分析的Au-TiO2-AChE 复合体系及其制备方法，以及用于乙酰胆碱酯酶活性检测的应用。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是一种丝氨酸水解酶，是生物神经传导中的一种关键酶，它在神经信号传导过程中起着重要的作用[1-3]。有研究表明乙酰胆碱酯酶活性的异常变化与中枢神经系统损伤疾病密切相关[4-6]，如帕金森氏病 (Parkinson's disease) [7，8]，阿尔茨海默病(Alzheimer Disease) [9-15] 因此，探讨乙酰胆碱酯酶的活性变化有助于脑神经系统疾病的病理研究和药物筛选。近年来，有很多假设对帕金森氏病的发病机理进行了解释，包括氧化应急增加、毒性暴露和环境因素、兴奋性神经毒素作用、神经系统老化以及遗传因素等[16-23]，但是关于帕金森氏病的生理机制尚不完全清楚。自从在Science上发表了 1-甲基-4-苯基_1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)能引起人体产生帕金森氏病开始，人们就广泛关注神经毒素与帕金森氏病神经元损伤机制的关系，尤其是内源性神经毒素(R)-NMSal得到了人们的广泛关注[24-27]。据报道，帕金森氏病人脑脊液中的(R)-NMSal水平显著高于正常人[28，29]，而注射了(R)-NMSal的SD大鼠会表现出帕金森氏病综合症[30]。因此，探讨内源性神经毒素(R)-NMSal对AChE活性的影响在帕金森氏症的致病机理、治疗及预防等方面具有重要意义。目前，乙酰胆碱酯酶活性检测最常用的方法有以下几种测压法、分光光度法、荧光法以及电化学分析法[32-35]。这些方法都是基于乙酰胆碱酯酶能够水解不同的底物转化为一个可测信号的过程上面，产生的信号包括气压、吸光度、荧光、PH值以及电位或者电流等。这些方法虽然在乙酰胆碱酯酶的活性检测中发挥了巨大的作用，但是随着生物技术和生命科学的发展，传统方法在一定程度上已经不能满足现代检测的需要。本发明克服现有技术的以上缺陷，提供一种可用于乙酰胆碱酯酶活性检测的 Au-TiO2-AChE复合体系，具有灵敏度高，制备方法简单等优点。

发明内容
本发明为了满足生物技术和生命科学的发展，提出利用半导体复合纳米材料建立光电分析方法，应用于乙酰胆碱酯酶活性检测的研究。本发明的目的之一是提供一种Au-TiO2-AChE复合体系，其特征在于，包括嵌入Au 纳米颗粒的高序排列的二氧化钛纳米管阵列和乙酰胆碱酯酶；其中，所述乙酰胆碱酯酶是通过交联法固定在所述二氧化钛纳米管阵列上。其中，所述嵌入Au纳米颗粒的高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)是采用光电协同法催化制备得到。本发明的另一目的是提供一种Au-TiO2-AChE复合体系的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤⑴制备TiO2NTs电极；⑵在TiO2NTs电极中嵌入Au纳米粒子；⑶在Au 纳米粒子修饰的TiO2NTs电极上固定乙酰胆碱酯酶，得到所述Au-TiO2-AChE复合体系。
本发明所述步骤(1)中，钛片经清洗晾干，以0. 5%氢氟酸为电解质，以钼电极为阴极，外加电压为20V，置于电化学反应器里反应，氧化后的钛片在500°C干燥的有氧环境里煅烧1小时后制得TiO2NTs电极。所述步骤(2)中，以所述TiO2NTs电极为光电极，以饱和甘汞电极作为参比电极， 以钼电极作为对电极，以紫外灯为光源，在含有HAuCl4 · 6H20的H2SO4溶液中进行循环伏安法实验，将Au纳米粒子嵌入到所述TiO2NTs电极中，得到Au纳米粒子修饰的TiO2NTs电极。所述步骤(3)中，将乙酰胆碱酯酶的溶液滴涂在Au纳米粒子修饰的TiO2NTs电极的Ti片一侧，经晾干，得到所述Au-TiO2-AChE复合体系。其中，所述步骤(2)中，H2SO4溶液中HAuCl4 · 6H20的含量为0. Immol L-1，H2SO4溶液浓度为0.5mol L—1。所述步骤(3)中的乙酰胆碱酯酶溶液中含有l.Omg mL—1乙酰胆碱酯酶， 1. Zmgmr1BSA,和 2. 5%戊二醛。现详细说明本发明的技术方案。本发明采用光电协同法催化制备嵌入Au纳米颗粒的高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)，然后通过交联法来固定乙酰胆碱酯酶，制备成Au-TiO2-AChE复合体系，并应用于内源性神经毒素(R)-NMSal对AChE活性抑制作用的研究。本发明Au-TiO2-AChE复合体系的制备方法，具体操作步骤第一步=TiO2NTs电极的制备；第二步=Au-TiO2NTs电极的制备；第三步=Au-TiO2-AChE复合体系的建立。本发明的另一目的是提供Au-TiO2-AChE复合体系在乙酰胆碱酯酶活性检测中的应用。本发明的应用，是在以所述Au-TiO2-AChE复合体系为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以钼丝为辅助电极的光电化学电池中，工作电极的电压设定为+0. 6V，在pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法测量流过工作电极的电流，检测加入不同浓度的硫代乙酰胆碱后的光电流响应值。本发明的应用为确定硫代乙酰胆碱与Au-TiO2-AChE复合体系的光电流的依从关系，具体操作步骤包括在以Au-TiO2-AChE复合体系为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为辅助电极的光电化学电池中，工作电极的电压设定为+0.6￥，在？!1 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，根据光电化学电池中每次增加一定浓度的硫代乙酰胆碱而产生的光电流变化做出光电流_硫代乙酰胆碱浓度曲线将硫代乙酰胆碱浓度及其对应的工作电极响应的光电流值所对应的坐标点描绘在直角坐标纸上，直角坐标的两个坐标分别为Au-TiO2-AChE复合体系的响应光电流的电流值和硫代乙酰胆碱浓度，依次逐点连接直角坐标纸上的所有坐标点，得到响应光电流-硫代乙酰胆碱浓度曲线，该曲线为直线，确定硫代乙酰胆碱浓度与Au-TiO2-AChE复合体系的响应光电流的依从关系为线性关系。本发明的应用，所述Au-TiO2-AChE复合体系可用于考察内源性神经毒素 (R)-NMSal对乙酰胆碱酯酶AChE的抑制情况。本发明采用技术方案以所述的Au-TiO2-AChE复合体系为工作电极，采用计时电流法测量流过工作电极的光电流，检测内源性神经毒素(R)-NMSal在加入Au-TiO2-AChE 体系前后光电流值的变化，所述Au-TiO2-AChE复合体系应用于检测内源性神经毒素((R) -NMSal)对乙酰胆碱酯酶AChE活性抑制情况。本发明还利用Au-TiO2-AChE复合体系考察石杉碱甲(HupA)对AChE活性抑制的动力学研究，结果显示，HupA对AChE的抑制作用与内源性神经毒素(R)-NMSal的相似，表现为可逆性混合型的，说明本发明所述方法可用于乙酰胆碱酯酶酶的活性研究的可行性。


图1 (a)表示电化学阳极氧化法制备的TiO2NTs15图1 (b)表示沉积了 Au纳米颗粒后的TiO2NTs。图 1 (c)表示修饰了 AChE 后的 Au-TiO2NTs。图2为实施例2中响应光电流对不同浓度的硫代乙酰胆碱的光电流图。图3为实施例3中Au-TiO2-AChE复合体系在有无内源性神经毒素(R) -NMSal的体系中对硫代乙酰胆碱的光电流响应图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明进行详细说明。本发明的以下实施例并不是对本发明的限制。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以权利要求书作为保护范围。实施例1 制备Au-TiO2-AChE复合体系第一步利用电化学阳极氧化技术制备TiO2NTs电极。在阳极氧化之前，钛片首先用不同的砂纸打磨，接着把它浸在蒸馏水中超声十分钟，然后把干净的钛片浸在氢氟酸和硝酸的混合液中一分钟(混合的体积比例HF HNO3 H2O = 1 4 5)，之后钛片用丙酮和蒸馏水冲洗，在室温下晾干。TiO2NTs电极是在柱状的电化学反应器里制备(半径为 30mm，高为70mm)。在整个过程中0. 5%的氢氟酸用作电解质，钼电极用作阴极，外加电压为20V。氧化以后的钛片在500°C干燥的有氧环境里煅烧1小时。加热和冷却速率保持在 2. 50C mirT1，制得 TiO2NTs 电极，待用；第二步采用电化学辅助光催化法即光电催化法将Au纳米颗粒嵌入TiO2NTs 中。在光电催化过程中，采用传统的光电化学电池，以TiO2NTs为光电极，饱和甘汞电极和钼电极分别用作参比电极和对电极，紫外灯为光源，在含有0. Immol L-1HAuCl4 · 6H20的 H2SO4 (0. SmolL-1)溶液中进行循环伏安法实验，将Au纳米颗粒嵌入到TiO2NTs中。第三步利用交联法将AChE固定在修饰了 Au纳米粒子的TiO2NTs上。将制得的酶溶液(1. Omg Iiir1AChE, 1. 2mg mL^BSA, 2. 5%戊二醛)滴涂到 Au-TiO2NTs 修饰的 Ti 片一侧，晾干，得到Au-TiO2-AChE复合体系。图1所示为TiO2NTs在修饰前后的SEM图。图Ia为用电化学阳极氧化法在纯的钛片上制得的高密度、有序的、整齐的TiO2纳米管，管径大约为75nm。图Ib为沉积了 Au纳米颗粒后的TiO2NTs, Au颗粒直径从40到50nm不等。图Ic是修饰了 AChE后的Au-TiO2NTs 的SEM图，通过戊二醛交联剂，AChE被成功地固定在Au修饰的TiO2NTs上。实施例2 =Au-TiO2-AChE复合体系对硫代乙酰胆碱的光电流响应以实施例1中制备的Au-TiO2-AChE复合体系为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH 7. 4的磷酸盐缓
5冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，记录加入不同浓度的硫代乙酰胆碱后的光电流响应值。根据硫代乙酰胆碱的浓度及测得的光电流响应的光电流值为横纵坐标进行作图。图2所示为响应光电流对不同浓度的硫代乙酰胆碱的光电流图，随着硫代乙酰胆碱浓度的增加，光电流响应也随之上升。实施例3 检测内源性神经毒素(R) -NMSal对AChE的抑制情况以实施例1制备的Au-TiO2-AChE复合体系为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0. 6V，在pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，根据Au-TiO2-AChE复合体系中有无(R)-NMSal，即内源性神经毒素1(1 )，2-二甲基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉 [(R)-NMSal],对硫代乙酰胆碱产生的光电流变化来考察内源性神经毒素(R)-NMSal对 AChE的抑制情况。第一步在无(R)-NMSal的Au-TiO2-AChE体系中，加入0. IOmM硫代乙酰胆碱，测
定光电流值。第二步将(R)-NMSal加入Au-TiO2-AChE体系中后，加入0. IOmM硫代乙酰胆碱，
测定光电流值。第三步将Au-TiO2-AChE重新置于一个无(R)-NMSal存在的环境中，加入0. IOmM 硫代乙酰胆碱，测定光电流值。图3所示为Au-TiO2-AChE复合体系在有无内源性神经毒素(R) -NMSal的体系中对硫代乙酰胆碱的光电流响应图。数据显示(R)-NMSal对AChE活性的抑制作用是可逆性的。
权利要求
1.一种Au-TiO2-AChE复合体系，其特征在于，包括嵌入Au纳米颗粒的高序排列的二氧化钛纳米管阵列和乙酰胆碱酯酶；其中，所述乙酰胆碱酯酶是通过交联法固定在所述二氧化钛纳米管阵列上。
2.—种权利要求1所述的Au-TiO2-AChE复合体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备TiO2NTs电极；(2)在TiO2NTs电极中嵌入Au纳米粒子；(3)在Au纳米粒子修饰的TiO2NTs电极上固定乙酰胆碱酯酶，得到所述Au-TiO2-AChE 复合体系。
3.如权利要求2所述Au-TiO2-AChE复合体系的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，钛片经清洗晾干，以0.5%氢氟酸为电解质，以钼电极为阴极，外加电压为20V，置于电化学反应器里反应，氧化后的钛片在500°C干燥的有氧环境里煅烧1小时后制得TiO2NTs电极；所述步骤⑵中，以所述TiO2NTs电极为光电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以钼电极作为对电极，以紫外灯为光源，在含有HAuCl4 · 6H20的H2SO4溶液中进行循环伏安法实验，将Au纳米粒子嵌入到所述TiO2NTs电极中，得到Au纳米粒子修饰的TiO2NTs电极；所述步骤(3)中，将乙酰胆碱酯酶的溶液滴涂在Au纳米粒子修饰的TiO2NTs电极的Ti 片一侧，经晾干，得到所述Au-TiO2-AChE复合体系。
4.如权利要求3所述Au-TiO2-AChE复合体系的制备方法，其特征在于，所述步骤(2) 中H2SO4溶液中HAuCl4 · 6H20的含量为0. Immol L-1，H2SO4溶液浓度为0. 5mol L-1 ；所述步骤(3)中的乙酰胆碱酯酶溶液中含有1. Omg πιΓ1乙酰胆碱酯酶，1. 2mg ml^BSA，和2. 5%戊
5.一种权利要求1中所述的Au-Ti02-AChE复合体系在乙酰胆碱酯酶活性检测中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，以所述Au-Ti02-AChE复合体系为工作电极， 以饱和甘汞电极为参比电极，以钼丝为辅助电极，工作电极的电压设定为+0. 6V，在pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，检测加入不同浓度的硫代乙酰胆碱后的光电流响应值。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Au-TiO2-AChE复合体系用于考察内源性神经毒素对乙酰胆碱酯酶的抑制情况。
全文摘要
本发明提供了一种Au-TiO2-AChE复合体系，其特征在于，包括采用光电协同法催化制备嵌入Au纳米颗粒的高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)和乙酰胆碱酯酶；其中，所述乙酰胆碱酯酶通过交联法来固定在所述二氧化钛纳米管阵列上，得到Au-TiO2-AChE复合体系。本发明还提供了所述Au-TiO2-AChE复合体系的制备方法及其在乙酰胆碱酯酶活性检测中的应用，可用于考察内源性神经毒素对乙酰胆碱酯酶的抑制情况。
文档编号G01N27/26GK102375006SQ20101025254
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者唐琳琳, 安雅睿, 张文, 张新爱, 朱伟, 江小丽, 滕瑛巧, 符莹, 金利通, 陈华 申请人:华东师范大学