专利名称：食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及检测盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及检测盒。
背景技术：
众所周知，食源性寄生虫病(FOOD SOURCE PARASITEDISEASES)是一组可以通过食物传播的常见寄生虫病，主要包括猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫、旋毛虫四种寄生虫病。它们可以感染人体以及家畜，严重损害人类健康并造成畜牧业的经济损失。其中，猪囊虫可以引起癫痫、瘫痪、失明；肺吸虫可以导致肺囊肿、肺脓肿；肝吸虫可以引起胆道感染、胆结石、肝硬化；旋毛虫则可以引起严重的过敏反应及心脏损害。食源性寄生虫流行广泛，仅在中国广东省肝吸虫流行区人口就达到3000万以上。更值得注意的是，食源性寄生虫病的起病隐匿，症状不典型，易与其它疾病混淆，加之目前临床缺乏可靠实用的检测方法，因此，常常被漏诊误诊而贻误病情。
目前，食源性寄生虫病的检测方法有两大类一类是传统检测方法，即查找病原体，由于这四种寄生虫多寄生在深部组织内，如脑部、眼球、肝脏胆道、肺部、骨骼肌、心肌等脏器，要通过外科手段采集虫体，不仅损伤甚大而且往往虫体分布散在常难以检获。另外旋毛虫、猪囊虫不排虫卵，肺吸虫排卵很少甚至不排卵；肝吸虫虽可以随粪便排卵，但卵体积微小且排卵不规律，难以检出，临床上常用的粪便涂片法敏感度一般低于50％。因此，无论查虫卵或虫体都不是诊断该组寄生虫病的有效手段；另外一类就是近年来出现的常规酶免疫法等，但这类方法普遍存在以下不足1、操作时间长时间多在长达2-4小时以上，难以适应现场与临床门诊的快速诊断需要；2、试剂操作烦琐如酶结合物和底物液要临时配制，抗原需要过夜包被，样本稀释液体以及终止液体都需要用户自行配制，在应用中给用户带来了诸多不便；3、不稳定所提供的试剂稳定性不佳，一旦配制必须在1周内甚至1天内用完，造成经济损失，也影响了检测的可靠性；4、配套不完整迄今，在市场上尚未见到同时提供方法统一的四种食源性寄生虫成套试剂盒，所有试剂盒都只能测定一种寄生虫病。目前，所见到的供应单位供应品种不齐全，仅供应其中一种或两种，如中国某地一家公司仅提供囊虫检测试剂，同地区另一研究所则仅提供旋毛虫检测试剂。厂家的不同，方法的区别，性能的差异，不仅影响可操作性，更影响到结果的一致性和有效性，容易造成误诊或漏诊，成为食源性寄生虫病防治中一大隐患；5安全隐患常规酶免疫方法常使用具有致畸性作用的OPD作为显色剂，并用强腐蚀性的硫酸作为终止液，对操作人员和环境构成威胁。综上所述，现有的检测技术不能有效满足食源性寄生虫病的诊断需要，不利于疾病的诊断治疗和预防控制。

发明内容
本发明的目的在于提供食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及与本方法配套用的成套检测盒。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法，用于猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫和旋毛虫的酶免疫检测，该方法的酶免疫检测用试剂包括抗原包被板A、酶结合物液B、洗涤液C、底物D、显色剂E、样品稀释液F、终止剂G、阳性对照品H及阴性对照品I，检测过程使用多孔检测盒，具体过程包括(1)样本稀释用样本稀释液F将待检血清按体积比1∶50稀释，阴阳性对照血清同比例同步稀释，然后(2)加样反应每孔加已稀释血清100ul，同时设阴性、阳性及空白对照各一孔，空白对照孔加入100ul样品稀释液F，37℃静置10分钟，甩去，每孔加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水洗涤多次，甩去，拍干，再(3)加酶反应加酶结合物B二滴，37℃反应10分钟，甩去，加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水反复洗涤多次，甩去，拍干，最后(4)显色反应加底物D和显色剂E各一滴，混匀，室温下放置2-3分钟，待阴性对照孔微呈蓝色时，加终止剂G一滴混匀，终止反应，肉眼观察浅于近于阴性对照为阴性，呈明显深于阴性对照的蓝色为阳性，用仪器判断以空白对照调零于630nm读取O.D值，待检孔O.D值大于阴性对照2.1倍者为阳性，当阴性对照O.D值低于0.07时按0.07计算。
在具体检测过程中，必须注意如下问题1、试剂盒在2-8℃下保存，每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间切不可混用；2、洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放三十秒钟，甩去孔内液体，禁用自来水等其它水源。
本发明较好的技术方案可以是抗原包被板A采用快速包被工艺，预先在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗原，包被液为含适量抗原的碳酸盐缓冲液(由碳酸氢钠与碳酸钠组成，PH9.60，0.05M)，室温静止12小时，用1％牛血清白蛋白封闭2小时，冷冻真空干燥，真空装袋封口。采用快速包被工艺可以提高工作效率并提高检测的准确率。
本发明较好的技术方案也可以是酶结合物B液磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)，添加稳定剂分子量Mr为20000的聚乙二醇重量0.5％-5％，同时添加加速剂分子量Mr为6000的聚乙二醇重量0.5％-5％，加万分之一硫柳汞以及四种寄生虫病统一的抗人免疫球蛋白G辣根过氧化物酶标记结合物。
在实施本发明的过程中，其它检测用的试剂的成份或配置方法如下洗涤液C采用0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)，加万分之一硫柳汞；底物液D及显色剂E底物液为过氧化氢溶液，显色剂为对人体无害的TMB溶液；样本稀释液F磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.1M)，含吐温0.5％；终止液G1％十二烷基硫酸钠(SDS)；阳性对照H与阴性对照I阳性对照系将四种阳性病人血清灭活处理，混合，加万分之一硫柳汞分装，成为可以通用的混合阳性对照；阴性对照系若干正常人血清混合后，加万分之一硫柳汞分装保存。以上组分包括了检测所需要的全部试剂(蒸馏水除外)，其中液体组分均已调整到工作浓度并装入塑料滴瓶内，无须稀释可以直接使用；阴阳对照放入带盖的塑料管内，可以直接使用；包被板拆封后也可直接使用。
本发明较好的技术方案还可以是多孔检测盒是一种可以扣合的四合一化的试剂盒，盒内分为两个区，一个区放置多种寄生虫抗原预包被板，共多块紧邻液体试剂瓶，另一区设置一个开孔纸托或塑料基托立式并行放置多种通用的液体试剂瓶，试剂盒上方有开口，内侧盖上各有一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。实际使用中，用于协调四种抗原包被条件使包括酶结合物在内的其它液体组分可以成为四种寄生虫检测均可直接使用的通用试剂，因此仅一套液体试剂就可以满足四种寄生虫病的检测要求；盒内分为两个区，一个区放置四种寄生虫抗原预包被板，共四块紧邻液体试剂瓶，互相平行站立排列；另一区设置一个开孔纸托或塑料基托立式并行放置6种通用的液体试剂瓶。试剂盒开口设在上面，内侧盖上分别设计一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。
与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点1、提高了反应速度，整个反应时间不超过30分钟。比常规酶免疫方法提高了4倍以上；2、方便实用试剂盒不仅配备了检测所必须的试剂组分，而且均为即开即用型，用户不必另行配制或稀释，使操作简单易行。不仅可以用仪器定量判断结果，也可以肉眼直接判断，尤适合于条件受限的现场普查和门诊检测；3、提高了四种疾病检测的可靠性由于统一了操作方法和液体试剂，使得用户可以在同一时间和方法下进行操作，使得结果具有高度的一致性和可比性；4、安全环保；采用了无害的TMB试剂，避免了常规方法所带来的危害和污染。终止液采用无腐蚀性的SDS，消除了因使用硫酸终止液所带来的安全隐患；5、检测效果好(1)敏感性用本快速试剂盒检测经过确诊的肝吸虫病人血清453份，检测出阳性病例417例，敏感度达到92.10％(417/453)；(2)特异性用本快速试剂盒检测356例非流行区健康人血清，检测为阴性标本350例，特异性达到98.30％(350/356)；(3)真实性(约登指数，Youder’s Index)约登指数为0.904，显示了检测盒高度的真实性；(4)重复性同一操作者重复检测阳性血清56份和阴性血清50份，重复性达到96.20％；(5)稳定性将检测盒放置在4℃下，动态观察六个月，前后结果无显著性差异。


以下是本发明的检测盒图面说明图1是检测盒的结构示意图；图中1是四种寄生虫抗原包被板，2是对照血清，3是放置试剂瓶的基托，4是试剂瓶；参照图1，多孔检测盒是一种可以扣合的四合一化的试剂盒，盒内分为两个区，一个区放置多种寄生虫抗原预包被板，共多块紧邻液体试剂瓶，另一区设置一个开孔纸托或塑料基托立式并行放置多种通用的液体试剂瓶，试剂盒上方有开口，内侧盖上各有一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。
具体实施例方式
以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述实施例1 肝吸虫病快速酶免疫检测方法选用肝吸虫可溶性粗制抗原，分步通过辛酸法和DEAE52离子层析柱层析纯化制得精制抗原，采用紫外法测定蛋白含量；进行预试验，与其它三种抗原对比实验，测定并选择肝吸虫精制抗原的包被浓度；用碳酸盐缓冲液(由碳酸氢钠与碳酸钠组成，PH9.60，0.05M)稀释抗原，包被96孔聚苯乙烯微孔板，100微升/孔，室温过夜，甩去孔内液体，用同样剂量含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)室温封闭2小时，冷冻真空干燥，真空条件下装入塑料袋，袋上贴相应标示。包被板拆封后也可直接使用。
配制通用液体试剂，包括酶结合物液B、洗涤液C、底物D、显色剂E、样品稀释液F、终止剂G、阳性对照品H及阴性对照品I，酶结合物B液磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)，添加稳定剂分子量Mr为20000的聚乙二醇重量0.5％-5％，同时添加加速剂分子量Mr为6000的聚乙二醇重量0.5％-5％，加万分之一硫柳汞以及四种寄生虫病统一的抗人免疫球蛋白G辣根过氧化物酶标记结合物。其它检测用的试剂的成份或配置方法如下洗涤液C采用0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)，加万分之一硫柳汞；底物液D及显色剂E底物液为过氧化氢溶液，显色剂为对人体无害的TMB溶液；样本稀释液F磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.1M)，含吐温0.5％；终止液G1％十二烷基硫酸钠(SDS)；阳性对照H与阴性对照I阳性对照系将四种阳性病人血清灭活处理，混合，加万分之一硫柳汞分装，成为可以通用的混合阳性对照；阴性对照系若干正常人血清混合后，加万分之一硫柳汞分装保存。以上组分包括了检测所需要的全部试剂(蒸馏水需要另行准备)，其中液体组分均已调整到工作浓度并装入塑料滴瓶内，无须稀释可以直接使用；阴阳对照放入带盖的塑料管内，可以直接使用；将抗原包被板和液体试剂瓶依次装入多孔检测盒。多孔检测盒是一种可以扣合的四合一化的试剂盒，盒内分为两个区，一个区放置四种寄生虫抗原预包被板，共四块紧邻液体试剂瓶，另一区设置一个开孔基托立式并行放置多种通用的液体试剂瓶，试剂盒上方有开口，内侧盖上各有一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。检测盒需要在4℃下保存，不得冷冻，在此条件下有效期可以达到6个月。
检测过程使用多孔检测盒，具体过程包括(1)样本稀释用样本稀释液F将待检血清按体积比1∶50稀释，阴阳性对照血清同比例同步稀释，然后(2)加样反应每孔加已稀释血清100ul，同时设阴性、阳性及空白对照各一孔，空白对照孔加入100ul样品稀释液F，37℃静置10分钟，甩去，每孔加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水洗涤多次，甩去，拍干，再(3)加酶反应加酶结合物B二滴，37℃反应10分钟，甩去，加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水反复洗涤多次，甩去，拍干，最后(4)显色反应加底物D和显色剂E各一滴，混匀，室温下放置2-3分钟，待阴性对照孔微呈蓝色时，加终止剂G一滴混匀，终止反应，肉眼观察浅于近于阴性对照为阴性，呈明显深于阴性对照的蓝色为阳性，用仪器判断以空白对照调零于630nm读取O.D值，待检孔O.D值大于阴性对照2.1倍者为阳性，当阴性对照O.D值低于0.07时按0.07计算。
在具体检测过程中，必须注意如下问题1、试剂盒在2-8℃下保存，每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间切不可混用；2、洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放三十秒钟，甩去孔内液体，禁用自来水等其它水源。
实施例2 肺吸虫病快速酶免疫检测方法选用肺吸虫可溶性粗制抗原，分步通过辛酸法和DEAE52离子层析柱层析纯化制得精制抗原，采用紫外法测定蛋白含量；进行预试验，与其它三种抗原对比实验，测定并选择肺吸虫精制抗原包被浓度；用碳酸盐缓冲液(成分如上述，PH9.60，0.05M)稀释抗原，包被96孔聚苯乙烯微孔板，100微升/孔，室温过夜，甩去孔内液体，用同样剂量含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(成分如上述，PH7.0，0.05M)室温封闭2小时，冷冻真空干燥，真空条件下装袋，板袋上贴相应标示。包被板拆封后也可直接使用。
其它试剂配制方法、组装成盒方式及检测方案同实施例1。
实施例3猪囊虫病快速酶免疫检测方法选用猪囊虫囊液可溶性粗制抗原，分步通过辛酸法和DEAE52离子层析柱层析纯化制得精制抗原，采用紫外法测定蛋白含量；进行预试验，与其它三种抗原对比实验，测定并选择抗原包被浓度；用碳酸盐缓冲液(成分如上述，PH9.60，0.05M)稀释抗原，包被96孔聚苯乙烯微孔板，100微升/孔，室温过夜，甩去孔内液体，用同样剂量含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(成分如上述，PH7.0，0.05M)室温封闭2小时，冷冻真空干燥，真空条件下装袋，板袋上贴相应标示。包被板拆封后也可直接使用。
其它试剂配制方法、组装成盒方式及检测方案同实施例1。
实施例4旋毛虫病快速酶免疫检测方法选用旋毛虫肌肉期幼虫可溶性粗制抗原，分步通过辛酸法和DEAE52离子层析柱层析纯化制得精制抗原，采用紫外法测定蛋白含量；进行预试验，与其它三种抗原对比实验，测定并选择抗原包被浓度；用碳酸盐缓冲液(成分如上述，PH9.60，0.05M)稀释抗原，包被96孔聚苯乙烯微孔板，100微升/孔，室温过夜，甩去孔内液体，用同样剂量含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(成分如上述，PH7.0，0.05M)室温封闭2小时，冷冻真空干燥，真空条件下装袋，板袋上贴相应标示。包被板拆封后也可直接使用。
其它试剂配制方法、组装成盒方式及检测方案同实施例1。
权利要求
1.一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法，用于猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫和旋毛虫病的酶免疫检测，其特征在于酶免疫检测用试剂包括抗原包被板A、酶结合物液B、洗涤液C、底物D、显色剂E、样品稀释液F、终止剂G、阳性对照品H及阴性对照品I，检测过程使用多孔检测盒，具体过程包括(1)样本稀释用样本稀释液F将待检血清按体积比1∶50稀释，阴阳性对照血清同比例同步稀释，然后(2)加样反应每孔加已稀释血清100ul，同时设阴性、阳性及空白对照各一孔，空白对照孔加入100ul样品稀释液F，37℃静置10分钟，甩去，每孔加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水洗涤多次，甩去，拍干，再(3)加酶反应加酶结合物B二滴，37℃反应10分钟，甩去，加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水反复洗涤多次，甩去，拍干，最后(4)显色反应加底物D和显色剂E各一滴，混匀，室温下放置2-3分钟，待阴性对照孔微呈蓝色时，加终止剂G一滴混匀，终止反应，肉眼观察浅于近于阴性对照为阴性，呈明显深于阴性对照的蓝色为阳性，用仪器判断以空白对照调零于630nm读取O.D值，待检孔O.D值大于阴性对照2.1倍者为阳性，当阴性对照O.D值低于0.07时按0.07计算。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于抗原包被板A采用快速包被工艺，预先在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗原，包被液为含抗原的碳酸盐缓冲液(由碳酸氢钠与碳酸钠组成，PH9.60，0.05M)，室温静止12小时，用1％牛血清白蛋白封闭2小时，冷冻真空干燥，真空装袋封口。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于酶结合物B液磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.O，0.05M)，添加稳定剂分子量Mr为20000的聚乙二醇重量0.5％-5％，同时添加加速剂分子量Mr为6000的聚乙二醇重量0.5％-5％，加万分之一硫柳汞以及四种寄生虫病统一的抗人免疫球蛋白G辣根过氧化物酶标记结合物。
4.权利要求1的检测方法所使用的多孔检测盒，其特征在于多孔检测盒是一种可以扣合的四合一化的试剂盒，盒内分为两个区，一个区放置多种寄生虫抗原预包被板，共多块紧邻液体试剂瓶，另一区设置一个开孔纸托或塑料基托立式并行放置多种通用的液体试剂瓶，试剂盒上方有开口，内侧盖上各有一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。
全文摘要
本发明公开了一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及多孔检测盒，酶免疫检测用试剂包括抗原包被板A、酶结合物液B、洗涤液C、底物D、显色剂E、样品稀释液F、终止剂G、阳性对照品H及阴性对照品I，检测过程使用多孔检测盒，检测过程包括样本稀释、加样反应、加酶反应和显色反应，抗原包被板A采用快速包被工艺，预先在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗原，酶结合物B液添加分子量Mr为20000、6000的两种聚乙二醇，解决了现有检测方法操作时间长、操作繁琐、试剂不稳定和配套不完整等问题，具有速度快、操作方便、可靠性高和检测效果好等优点，用于猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫和旋毛虫病的酶免疫检测。
文档编号G01N33/535GK1424585SQ0311356
公开日2003年6月18日 申请日期2003年1月15日 优先权日2003年1月15日
发明者胡绍良 申请人:胡绍良