专利名称：一种抗生素耐药ndm-1基因的荧光检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
NDM-I 全称 New Delhi metallo-β -lactamase 1 (新德里金属-β -内酰胺分解 酶)，因为最初发现在印度和巴基斯坦等南亚地区，NDM-I的名称里包含它的发现地。这种 酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使任何含β-内酰胺环结构的蛋白质失效。近期一种 可抗绝大多数抗生素的耐药性超级细菌NDM-I在英美印度等国家小规模爆发，这种细菌其 实是一种特殊的酶，它能够进入大多数细菌的DNA线粒体中存活，从而使细菌产生广泛的 耐药性。由于目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素 类、硫霉素类、单环内酰胺类等其他非典型内酰胺类抗生素，都含有内酰胺环 结构，因此携带这种酶的细菌可以使几乎所有抗生素失效。超级细菌是指携带编写NDM-I 酶基因的细菌。大多数NDM-I超级病菌出现在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中。NDM-I基因存 在于DNA的结构中，被称为质体。研究人员称，质体可以在细菌中自由复制和移动，从而使 “超级细菌”的菌种有多种可能，具有传播和变异的惊人潜能。目前，NDM-I基因已经从南亚扩散到欧美等国家，如英国、美国、加拿大、澳大利亚、 荷兰等，全球已经报道有170多人被感染，光是英国就已经有超过50例患者；而8月14日 比利时一名男子的死亡，则成为世界上首例由它引起的死亡病例。科研工作者在印度、巴 基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-I肠杆菌科细菌占所监测细菌的 1.2% _13%，主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆 菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等。这些细菌主要引起尿路、 血流、伤口、肺部和导管相关感染等。在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我 国香港、台湾地区等都已经有感染病例报道。

发明内容
本发明目的是根据抗生素耐药NDM-I基因设计引物和TaqMan探针，提供一种检测 抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒及其检测方法，可实现对细菌体内携带的NDM-I 基因进行快速、准确、特异检测。本发明采用的技术方案是一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物 和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探 针序列如下上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘荧光探针5'-FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本 领域常规进行选择，该试剂盒可用作抗生素耐药NDM-I基因的定性检测，也可加入标准品 进行定量检测。优选的，所述试剂盒中还可包括抗生素耐药NDM-I基因标准品，所述标准品序列 如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg age ggg cca。以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标 准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样 品DNA的拷贝浓度。本发明还涉及一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测方法，所述方法包括(1)提取待测样本DNA;(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩 增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘荧光探针5‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因(NDM-I)和对多 种抗生素敏感的非靶细菌，如副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌等。(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线 刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈 良好的对数增长，则判断为阳性。为达到定量检测的要求，所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品 DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品 Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷 贝浓度；所述标准品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg age ggg cca。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，优选的，所述PCR扩增 反应条件如下95°C变性2分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)PCR buffer终浓度为1Χ、0·3 0. 5 μ M的引物、0. 1 0. 3 μ M的荧光探针、1 2. 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs， 通常取2 μ L (约50ng/ μ 1)的模板，反应总体积通常为20 50 μ L。PCR buffer终浓度 为IX，是指缓冲液中各组分终浓度与IXPCR buffer相同，通常采用市购2XPCR buffer, 体积用量为PCR反应液体系总体积的1/2。IXPCR buffer组成如下KC1 50mM, Tris-HCl IOmM, TritonX-1000. 1%, MgC12 1. 5mM。
本发明建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测抗生素耐药NDM-I基因的方法， 并经检测人工全基因合成的标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR扩增技术， 使得抗生素耐药NDM-I基因的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特 异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足 够的监测信息。本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏 感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR 模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果 经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR 产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定 量水平，因为即使PCR条件已优化到最佳程度，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给 结果分析带来影响，从而影响定量这的结果。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以 真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特 异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。本发明的有益效果主要体现在使用本发明检测试剂盒，抗生素耐药NDM-I基因 的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对抗生素耐药NDM-I 基因快速、准确、特异检测。


图1为实时荧光定量PCR标准品检测抗生素耐药NDM-I基因实时荧光定量PCR 标准品检测结果，从左至右分别为107、IO6、105、IO4、103、IO2UO1Copies/ μ L标准品。图2为实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y = -3. 559XlgX+36. 34;Υ:对 应的CT值；X 抗生素耐药NDM-I基因的copies。图3为不同浓度的5例人工合成全基因标本荧光定量PCR检测结果，CT值 分别为 24. 78,25. 90,27. 26,27. 29 和 28. 05，拷贝数分别为 1. 307 X IO5Copies/μ L、 4. 72Χ IO4Copies/μ LU. 17X IO4Copies/μ L、1· 13X 104copies/μ L 和 4. 70X 103copies/ μ L0
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 特异性引物、荧光探针和标准品的获得1、材料细菌基因组DNA提取试剂购自大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶购自美国 LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系统、Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，测序试剂、 377 型测序仪、Bio-Rad icycler PCR 仪、Rotor Gene Q 5-plex 型定量 PCR 仪(Qiagen 公 司)。2、引物及探针设计与合成
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以抗生素耐药NDM-I基因序列(注册号为AB571289)为模板，使用Primer Express (V2. 0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。标准品PCR序列上游引物5，-TGGCCTTGCTGTCCTTGATC-3，，下游引物5，-TGGCCCGCTCAAGGTATTTT-3，，检测用PCR序列为上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘荧光探针5'-FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。均由上海辉睿生物科技有限公司合成。3、检测标准品制备采用ABI394寡核苷酸合成仪根据抗生素耐药NDM-I基因序列中标准品PCR序列 的位置，全基因合成123bp的寡核苷酸片段。用标准品上下游引物在Bio-Rad icycler PCR 仪上进行PCR扩增PCR反应液组成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L标准品上游引物(10 μ Μ)IuL标准品下游引物(10 μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 6 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水补足至20 μ L。PCR条件为94°C 5分钟变性，94°C 20秒、55°C 20秒、72°C 20秒进行35个循环扩 增，最后于72°C延伸5分钟后置4°C。PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆 经测序验证。回收123bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。4、结果经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccgtcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg agcggg cca(SEQ ID No. 4)。实施例2 荧光定量PCR法检测人工模拟样本1、标本检测5例人工模拟标本，采用基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取LOyL做模 板，用检测用上下游引物在Rotor Gene Q 5-plex型定量PCR仪(Qiagen公司)上进行PCR 扩增。PCR反应液组成如下
2 X PCR buffer10. 0 μ L检测用上游引物(10 μ Μ)IuL检测用下游引物(10 μ Μ)IuL检测用荧光探针(10 μ Μ)0. 5uLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水补足至20 μ L。PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。以非靶细菌肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)为阴性对照于相同条件下进行PCR检 测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过 阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的抗生素耐药 NDM-I基因的数量。以副溶血性弧菌(ATCC 17802)、志贺菌(ATCC 12022)、沙门菌(ATCC 50035)、金 黄色葡萄球菌(ATCC 25933)、鲍曼不动杆菌(ATCC25004)和空肠弯曲菌(ATCC 33560)菌株 按照上述方法进行PCR检测，检测结果均呈阴性，说明本发明方法特异性好。2、样品检测结果标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。5例人工模拟标本检出抗生素耐药NDM-I基因阳性，检测结果参见图3 :5例 阳性标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为24. 78,25. 90,27. 26,27. 29和28. 05， 拷贝数分别为 1. 307 X IO5Copies/μ L、4. 72 X IO4Copies/μ L、l. 17 X IO4Copies/μ L、 1. 13 X 104copies/ μ L 和 4· 70 X IO3Copies/ μ L。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
权利要求
1.一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和 荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物 和荧光探针序列如下上游引物5 ‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘ 下游引物5 ‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘ 荧光探针5 ‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘ 其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括抗生素耐药NDM-I基 因标准品，所述标准品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctgtcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttgtca ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg age ggg cca。
3.一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测方法，所述方法包括(1)提取待测样本DNA;(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反 应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下 上游引物5 ‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘ 下游引物5 ‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘ 荧光探针5 ‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘ 其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线刚好 超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好 的对数增长，则判断为阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶 液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横 坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得 样品DNA的拷贝浓度；所述标准品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg atcagg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtgtgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg age ggg ccb。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下95°C变性2 分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。
全文摘要
本发明提供了一种抗生素耐药NDM-1基因的荧光检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5′-CAG CCA CCA AAA GCG ATG T-3′，下游引物5′-CGG CCACAC CAG TGA CAA TA-3′，荧光探针5′-FAM-TGC CGT CGA TCCCAA CGG TG-TAMRA-3′，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在使用本发明检测试剂盒，抗生素耐药NDM-1基因的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对抗生素耐药NDM-1基因的快速、准确、特异检测。
文档编号G01N21/64GK102002528SQ201010554690
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者张政, 程苏云, 罗芸, 金大智 申请人:浙江省疾病预防控制中心