专利名称：奶粉中l-肉碱含量和纯度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法；特别涉及一种柱前衍生 高效液相色谱法测定乳粉中L-肉碱含量和纯度的方法。
背景技术：
L-肉碱在婴儿体内的合成能力较弱，必须外源摄取。因此世界上已有多个国家和 地区在婴儿乳粉中加入L-肉碱，国内也有添加L-肉碱的婴儿乳粉上市。而肉碱在自然界 有两种存在形式(L型和D型)，右旋肉碱对人体健康存在负作用，而化学合成的左旋肉碱一 般是左旋和右旋肉碱混合物，然后分离除去右旋肉碱生产出的。国内保健品中左旋肉碱的检测一般采用直接高效液相色谱法，而直接高效液相色 谱法不能区分左旋和右旋肉碱。冷桃花等《D-和L-肉碱对映体的毛细管电泳分离研究》提 出用毛细管区带电泳分离肉碱对映体，并用紫外检测器检测，毛细管电泳操作要求较高，不 利于实验室普及；祝伟霞等《保健品中左旋肉碱的反相高效液相色谱法测定》中用L-丙氨 酸-β -萘胺为衍生试剂，HPLC紫外检测器检测保健品中左旋肉碱的含量；徐娟娟等《手性 高效液相色谱法测定左旋肉碱中光学异构体的含量》中用α -溴代苯基乙基酮为衍生试剂， HPLC紫外检测器检测左旋肉碱的含量。在乳粉中L-肉碱的检测方面，专利号02100582. 6《一种利用酶-比色法测定乳粉 中L-肉碱含量的方法》提出的分析方法不能区分肉碱对映体。用柱前衍生高效液相色谱法测定婴儿乳粉中L-肉碱的方法尚未见报导。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种测定奶粉中L-肉碱含量和纯度的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法， 依次包括以下步骤1)、样品处理先将奶粉10 20g用去离子水溶解后定容至100ml，再分别进行去除乳脂肪和乳 蛋白的处理(即分别用盐酸溶液和氢氧化钠溶液沉淀乳脂肪和乳蛋白)，过滤，所收集的滤 液为样品溶液；2)、制备标准溶液称取50mg L-肉碱标准品，以去离子水溶解，并定容至IOml ；所得溶液经0. 45 μ m 滤膜过滤，得到L-肉碱标准溶液；称取50mg D-肉碱标准品，以去离子水溶解，并定容至IOml ；所得溶液经0. 45 μ m 滤膜过滤，得到D-肉碱标准溶液；3)将步骤2)所得的L-肉碱标准溶液和D-肉碱标准溶液分别进行如下操作取30 μ 1的L-肉碱标准溶液放于容量瓶中，加入80 μ 1的0. 05Μ碳酸缓冲液和 80μ1的1-(9_芴基)-氯甲酸乙酯(即(+)-FLEC试剂)，塞上容量瓶的瓶塞，并缓慢旋转3 5秒；将容量瓶放入45°C水浴中放置lh，然后取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶 中加入去离子水定容至IOml ；将定容后的溶液用去离子水稀释，得到L-肉碱浓度分别为 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0、2. 5μ g/ml的L-肉碱的系列衍生溶液；同理，取30 μ 1的D-肉碱标准溶液放于容量瓶中，加入80 μ 1的0. 05Μ碳酸缓冲液 和80 μ 1的(+)-FLEC试剂，塞上容量瓶的瓶塞，并缓慢旋转3 5秒；将容量瓶放入45°C水 浴中放置lh，然后取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定容至IOml ； 将定容后的溶液用去离子水稀释，得到D-肉碱浓度分别为0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5 μ g/ml的 D-肉碱的系列衍生溶液；将所得的L-肉碱的系列衍生溶液和D-肉碱的系列衍生溶液分别用0. 45 μ m微孔 滤膜过滤；分别得梯度浓度的L-肉碱衍生溶液和梯度浓度的D-肉碱衍生溶液(用于下述 步骤的用高效液相色谱检测)；4)、样品溶液衍生化反应取60 μ 1步骤1)所得的样品溶液于容量瓶中，再加入30 μ 1的0. 05Μ碳酸缓冲液 和30 μ 1的(+)-FLEC试剂，塞上容量瓶的瓶塞，并缓慢旋转3 5秒；将容量瓶放入45°C 水浴中放置lh，然后从水浴中取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定 容至IOml ；将定容后的溶液用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得进样液；5)、高效液相色谱法检测对步骤3)所得的梯度浓度的L-肉碱衍生溶液和梯度浓度的D-肉碱衍生溶液以 及步骤4)所得的进样液分别进行高效液相色谱检测；检测条件如下选用C18色谱柱，色谱条件为流动相为三乙胺磷酸缓冲液乙腈=73 27的 体积比；流速:lml/min ；检测波长发射波长269nm，检测波长3IOnm ；进样量:10μ 1 ；分别得梯度浓度的L-肉碱衍生溶液的响应峰面积、梯度浓度的D-肉碱衍生溶液 的响应峰面积、进样液的响应峰面积；6)、分别获得L-肉碱的浓度cL和D-肉碱的浓度cD 以步骤5)所得的梯度浓度的L-肉碱衍生溶液的响应峰面积对浓度作图，得L-肉 碱的标准曲线；以步骤5)所得的梯度浓度的D-肉碱衍生溶液的响应峰面积对浓度作图，得D-肉 碱的标准曲线；将步骤5)所得的进样液的响应峰面积分别与上述L-肉碱的标准曲线和D-肉 碱的标准曲线对比，所得的结果乘以样品溶液在步骤4)的衍生反应中的稀释倍数 10*1000/60，从而分别得样品溶液中L-肉碱的浓度cL和D-肉碱的浓度cD ；7)、获得奶粉样品中L-肉碱含量和纯度
cLxlOOxlOO
样品中L-肉碱的含量(mg/100g)=-
mX 1000式中CL——样品溶液中L-肉碱的浓度，μ g/ml ；m——奶粉的质量，g。cL
样品中L-肉碱的纯度(％) = —~~
c L + c D式中CL——样品溶液中L-肉碱的浓度，μ g/ml ；cD——样品溶液中D-肉碱的浓度，μ g/ml。作为本发明的奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法的改进0. 05M碳酸缓冲液的制备方法如下将338mg无水碳酸钠和152mg碳酸氢钠溶解 于IOOml水；三乙胺磷酸缓冲溶液的制备方法如下将6. 8ml的三乙胺用950ml水溶解，然后用 体积分数为84%的磷酸水溶液调节pH至2. 5，最后用水定容至1000ml。作为本发明的奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法的进一步改进步骤1)为先将奶粉用去离子水溶解后于50°C水浴15min，再超声波处理lOmin，接着用去离 子水定容至IOOml ；然后加入0. lmol/L的盐酸溶液调节pH至1.8 2. 2，静置IOmin后用自然滤纸过 滤；在所得的滤液中加入lmol/L的NaOH溶液调节pH至5. 8 6. 2，静置IOmin后用自然 滤纸进行第二次过滤，第二次过滤所得的滤液为样品溶液。本发明以1-(9_芴基)_氯甲酸乙酯，S卩(+)_FLEC为衍生试剂，在肉碱对映体上 接上一个荧光基团，从而在色谱柱上分离，并用荧光检测器进行分析，大大提高了检测灵敏度。在本发明中，所用试剂均为市购产品。例如，L-肉碱标准品、D-肉碱标准品、 (+) -FLEC试剂可购自Sigma公司。本发明的方法首先排除了乳粉中脂肪和蛋白的干扰，然后手性拆分左旋和右旋肉 碱对映异构体，并以高效液相色谱法分析检测，提供一种柱前衍生高效液相色谱法检测乳 粉中L-肉碱含量和纯度的方法。本发明利用手性衍生化方法，对肉碱对映异构体进行拆分，并进行高效液相色谱 检测，以测定婴幼儿配方食品中左旋肉碱的含量和纯度，对婴幼儿配方食品和乳粉的质量 控制和安全检测具有重要意义。采用本发明的方法测定奶粉中L-肉碱的含量和纯度，具有如下优点1、本发明与传统分析方法相比，能够手性拆分L型和D型肉碱，达到分离和检测的 目的，且高效液相色谱仪在实验室中使用较普遍；2、本发明采用的高效液相色谱荧光分析法准确度好，分离能力好，灵敏度高，检测 下限大约是紫外检测器的1/10 1/100，仪器操作简单；3、能够排除乳粉中脂肪和蛋白的干扰，有效检测L-肉碱的含量和纯度。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是L-肉碱标准曲线；图2是D-肉碱标准曲线图3是实施例1的奶粉样品色谱图。
具体实施例方式下面结合本发明柱前衍生高效液相色谱法测定乳粉中L-肉碱含量和纯度的实 例，说明本发明的具体实施方式
。实施例1、一种奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法，其特征是依次包括以下步 骤1)、样品处理精确称取市售普通奶粉样品16. 65g，溶于30ml去离子水中，50°C水浴15min，超声 波(频率30kHz) lOmin，使奶粉充分溶解，然后加入去离子水定容至100ml。然后用0. lmol/L的盐酸溶液调节pH至2，静置IOmin后用自然滤纸过滤。在所得 的滤液用lmol/L的NaOH溶液调节pH至6，静置IOmin后用自然滤纸进行第二次过滤，第二 次过滤所得的滤液为样品溶液。2)、制备标准溶液称取50mg L-肉碱标准品，以去离子水溶解，并定容至IOml ；所得溶液经0. 45 μ m 滤膜过滤，得到L-肉碱标准溶液；称取50mg D-肉碱标准品，以去离子水溶解，并定容至IOml ；所得溶液经0. 45 μ m 滤膜过滤，得到D-肉碱标准溶液；3)、将步骤2)所得的L-肉碱标准溶液和D-肉碱标准溶液分别进行如下操作取30 μ 1的L-肉碱标准溶液放于容量瓶中，加入80 μ 1的0. 05Μ碳酸缓冲液和 80 μ 1的(+) -FLEC试剂，塞上容量瓶的瓶塞，并缓慢旋转3 5秒；将容量瓶放入45°C水 浴中放置lh，然后从水浴中取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定 容至IOml ；将定容后的溶液用去离子水稀释，得到L-肉碱浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、 2. 5 μ g/ml的L-肉碱的系列衍生溶液；同理，取30 μ 1的D-肉碱标准溶液放于容量瓶中，加入80 μ 1的0. 05Μ碳酸缓冲 液和80 μ 1的(+)-FLEC试剂，塞上容量瓶的瓶塞，并缓慢旋转3 5秒；将容量瓶放入45°C 水浴中放置lh，然后从水浴中取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定 容至IOml ；将定容后的溶液用去离子水稀释，得到D-肉碱浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、 2. 5 μ g/ml的D-肉碱的系列衍生溶液；将所得的L-肉碱系列衍生溶液和D-肉碱系列衍生溶液分别用0. 45 μ m微孔滤膜 过滤(可适当加压)；分别得梯度浓度的L-肉碱衍生溶液(共5种)和梯度浓度的D-肉 碱衍生溶液(共5种)；4)、样品溶液衍生化反应先进行测定试剂的制备三乙胺磷酸缓冲溶液6. 8ml的三乙胺用950ml水溶解，用体积分数为84%的磷酸 水溶液调节其PH至2. 5，最后用水稀释定容至1000ml。0. 05M碳酸缓冲液338mg无水碳酸钠和152mg碳酸氢钠溶解于IOOml水。取60 μ 1步骤1)所得的样品溶液于容量瓶中，再加入30 μ 1的0. 05Μ碳酸缓冲液 和30 μ 1的(+)-FLEC试剂，塞上容量瓶的瓶塞，并缓慢旋转3 5秒；将容量瓶放入45°C 水浴中放置lh，然后从水浴中取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定 容至IOml ；将定容后的溶液用0. 45 μ m微孔滤膜过滤(可适当加压)，得进样液。
5)、高效液相色谱法检测对步骤3)所得的梯度浓度的L-肉碱衍生溶液和梯度浓度的D-肉碱衍生溶液以 及步骤4)所得的进样液分别进行高效液相色谱检测；检测条件如下选用C18色谱柱。色谱条件为流动相为三乙胺磷酸缓冲液乙腈(73 27，体 积比)；流速:lml/min ；检测波长发射波长269nm，检测波长3IOnm ；进样量10 μ 1。分别得梯度浓度的L-肉碱衍生溶液的响应峰面积、梯度浓度的D-肉碱衍生溶液 的响应峰面积、进样液的响应峰面积。6)、获得L-肉碱含量和纯度以步骤5)所得的梯度浓度的L-肉碱衍生溶液的响应峰面积对浓度作图，得L-肉 碱的标准曲线；如图1所示L-肉碱，c(y g/ml) = 2*10_7A+0. 0978 ；式中A为峰面积值；以步骤5)所得的梯度浓度的D-肉碱衍生溶液的响应峰面积对浓度作图，得D-肉 碱的标准曲线；如图2所示=D-肉碱，c(y g/ml) = 2*10_7A+0. 1185 ；式中A为峰面积值。将步骤5)所得的进样液的响应峰面积分别与上述L-肉碱的标准曲线和D-肉 碱的标准曲线对比，所得的结果乘以样品溶液在步骤4)的衍生反应中的稀释倍数 10*1000/60，从而分别得样品溶液中L-肉碱的浓度cL和D-肉碱的浓度cD ；具体为进样液的检测结果图见图3，L-肉碱衍生物峰面积值为158390，D-肉碱衍生物 峰面积为0。因而样品溶液中L-肉碱浓度cL = (158390*2*10〃+0. 0978)*10*1000/60 = 21. 58 μ g/ml ； cD = 0。7)、获得奶粉样品中L-肉碱含量和纯度
权利要求
一种奶粉中L 肉碱含量和纯度的测定方法，其特征是依次包括以下步骤1)、样品处理先将奶粉样品10～20g用去离子水溶解后定容至100ml，再分别进行去除乳脂肪和乳蛋白的处理，过滤，所收集的滤液为样品溶液；2)、制备标准溶液称取50mg L 肉碱标准品，以去离子水溶解，并定容至10ml；所得溶液经0.45μm滤膜过滤，得到L 肉碱标准溶液；称取50mg D 肉碱标准品，以去离子水溶解，并定容至10ml；所得溶液经0.45μm滤膜过滤，得到D 肉碱标准溶液；3)、将步骤2)所得的L 肉碱标准溶液和D 肉碱标准溶液分别进行如下操作取30μl的L 肉碱标准溶液/D 肉碱标准溶液放于容量瓶中，加入80μl的0.05M碳酸缓冲液和80μl的1 (9 芴基) 氯甲酸乙酯；将容量瓶放入45℃水浴中放置1h，然后取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定容至10ml；将定容后的溶液用去离子水稀释，得到L 肉碱/D 肉碱浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/ml的L 肉碱系列衍生溶液/D 肉碱系列衍生溶液；将所得的L 肉碱系列衍生溶液和D 肉碱系列衍生溶液分别用0.45μm微孔滤膜过滤；分别得梯度浓度的L 肉碱衍生溶液和梯度浓度的D 肉碱衍生溶液；4)、样品溶液衍生化反应取60μl步骤1)所得的样品溶液于容量瓶中，再加入30μl的0.05M碳酸缓冲液和30μl的1 (9 芴基) 氯甲酸乙酯；将容量瓶放入45℃水浴中放置1h，然后从水浴中取出容量瓶自然冷却至室温后，向容量瓶中加入去离子水定容至10ml；将定容后的溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，得进样液；5)、高效液相色谱法检测对步骤3)所得的梯度浓度的L 肉碱衍生溶液和梯度浓度的D 肉碱衍生溶液以及步骤4)所得的进样液分别进行高效液相色谱检测；检测条件如下选用C18色谱柱，色谱条件为流动相为∶三乙胺磷酸缓冲液∶乙腈＝73∶27的体积比；流速lml/min；检测波长发射波长269nm，检测波长310nm；进样量10μl；分别得梯度浓度的L 肉碱衍生溶液的响应峰面积、梯度浓度的D 肉碱衍生溶液的响应峰面积、进样液的响应峰面积；6)、获得L 肉碱的浓度cL和D 肉碱的浓度cD以步骤5)所得的梯度浓度的L 肉碱衍生溶液的响应峰面积对浓度作图，得L 肉碱的标准曲线；以步骤5)所得的梯度浓度的D 肉碱衍生溶液的响应峰面积对浓度作图，得D 肉碱的标准曲线；将步骤5)所得的进样液的响应峰面积分别与上述L 肉碱的标准曲线和D 肉碱的标准曲线对比，所得的结果乘以样品溶液在步骤4)的衍生反应中的稀释倍数10*1000/60，从而分别得样品溶液中L 肉碱的浓度cL和D 肉碱的浓度cD；7)、获得奶粉样品中L 肉碱含量和纯度式中cL——样品溶液中L 肉碱的浓度，μg/ml；m——奶粉的质量，g。式中cL——样品溶液中L 肉碱的浓度，μg/ml；cD——样品溶液中D 肉碱的浓度，μg/ml。FSA00000259899600021.tif,FSA00000259899600022.tif
2.根据权利要求1所述的奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法，其特征是0. 05M碳酸缓冲液的制备方法如下将338mg无水碳酸钠和152mg碳酸氢钠溶解于 IOOml 水；三乙胺磷酸缓冲溶液的制备方法如下将6. 8ml的三乙胺用950ml水溶解，然后用体积 分数为84%的磷酸水溶液调节pH至2. 5，最后用水定容至1000ml。
3.根据权利要求2所述的奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法，其特征是所述步骤 1)为先将奶粉用去离子水溶解后于50°C水浴15min，再超声波处理lOmin，接着用去离子水 定容至IOOml ；然后加入0. lmol/L的盐酸溶液调节pH至1. 8 2. 2，静置IOmin后用滤纸过滤；在所 得的滤液中加入lmol/L的NaOH溶液调节pH至5. 8 6. 2，静置IOmin后用滤纸进行第二 次过滤，第二次过滤所得的滤液为样品溶液。
全文摘要
本发明公开了一种奶粉中L-肉碱含量和纯度的测定方法，依次包括以下步骤1)以奶粉为样品进行样品处理；2)分别以L-肉碱标准品和D-肉碱标准品制备标准溶液；3)将步骤2)所得的L-肉碱标准溶液和D-肉碱标准溶液分别对应地制成梯度浓度的L-肉碱衍生溶液和梯度浓度的D-肉碱衍生溶液；4)样品溶液衍生化反应；5)对步骤3)和4)的所得物分别进行高效液相色谱检测；6)获得L-肉碱的浓度cL和D-肉碱的浓度cD；7)获得奶粉样品中L-肉碱含量和纯度。采用本发明的方法测定奶粉中的L-肉碱，能大大提高检测灵敏度。
文档编号G01N30/88GK101975837SQ20101027457
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者冯盘, 朱加进, 朱方, 童玲 申请人:浙江大学