专利名称：用于癌症治疗的dsg2拮抗剂的制作方法
用于癌症治疗的DSG2拮抗剂 本发明涉及用于治疗癌症的药剂。癌症是一种其中一组细胞显示不受控制的生长(分裂超过正常限度)、侵袭(侵袭并破坏相邻组织)并且有时显示转移(经由淋巴或血液扩散到身体其他位置)的疾病。癌症的这三个恶性特性使其区别于具有自身限制性且不会侵袭或转移的良性肿瘤。大多数癌症形成肿瘤，但有些癌症(如白血病)则不形成肿瘤。癌症由外部因素(烟草、感染性生物体、化学品及辐射)及内部原因(遗传突变、激素、免疫状况和自代谢发生的突变)造成。这些病因可以一起或相继起作用以引发或促进癌发生。癌症可以影响所有年龄段的人，甚至胎儿，但是大多数种类的风险随年龄增力口。所有人类死亡中的大约13%是由癌症导致。根据美国癌症协会(American CancerSociety)，在2007年期间全世界有760万人死于癌症。诊断通常需要病理学家对组织活体检查标本作组织检查，但恶性病症的初始征兆可以是症状或放射线照相成像异常。 几乎所有癌症都由转化细胞的遗传物质的异常所致。这些异常可能归因于致癌物(诸如烟草烟雾、辐射、化学品或感染物)的作用。其他促癌遗传异常可能因DNA复制错误而随机发生，或被遗传并因此自出生起存在于所有细胞中。癌症的遗传力通常受致癌物与宿主基因组之间复杂的相互作用影响。癌症发病机制的新的遗传学方面(诸如DNA甲基化和微RNA)愈加被认为重要。在癌症中发现的遗传异常通常影响两种普通类型的基因。促癌的癌基因通常在癌 细胞中被活化，从而赋予那些细胞新的特性，诸如极度活跃的生长和分裂，防止程序性细胞死亡，侵犯正常组织边界及在不同组织环境中产生的能力。肿瘤抑制基因则在癌细胞内失活，导致那些细胞丧失正常功能，诸如精确的DNA复制，对细胞周期的控制，组织内的定向及黏着及与免疫系统的保护细胞的相互作用。取决于特定类型、位置和阶段，大多数癌症可以被治疗且有些可以被治愈。一旦确诊，通常用手术、化疗和放疗的组合来治疗癌症。随着研究发展，治疗对不同类型的癌症变得更有特异性。特异性地作用于某些肿瘤的可检测的分子异常且使对正常细胞的破坏最小化的靶向治疗药物的开发已有重大进展。癌症患者的预后主要受癌症类型以及疾病的阶段或程度影响。此外，组织学分级及特异性分子标记的存在也可以用于建立预后以及确定个体治疗。转移是疾病(诸如癌症)从一个器官或部分扩散到另一个不相邻的组织或部分。癌细胞可以自原发肿瘤脱离、漏出或溢出，进入淋巴及血管，经由血流循环并沉降从而在身体其他位置的正常组织内生长。转移是恶性肿瘤的三个特点之一(与良性肿瘤相比)。大多数肿瘤和其他赘生物可以转移，但是程度不同(例如，神经胶质瘤和基底细胞癌很少转移)。当肿瘤细胞转移时，新的肿瘤被称为继发性肿瘤或转移性肿瘤，并且其细胞如同最初肿瘤中的细胞。例如，这意味着如果乳腺癌转移至肺部，则继发性肿瘤由异常乳房细胞而非异常肺细胞构成。肺部中的肿瘤则被称为转移性乳腺癌而非肺癌。治疗和存活取决于癌症是否是局部的还是已经扩散至其他位置。如果癌症扩散至其他组织和器官，则此可能降低患者的存活概率。然而，有一些癌症(即，白血病、脑癌)会根本不经扩散而致命。当癌症已经转移时，其可用放射外科术、化疗、放疗、生物疗法、激素疗法或这些的组合来治疗。对治疗的选择通常取决于原发癌症的类型、转移的尺寸和位置、患者的年龄和全面的健康状况及之前所用治疗的类型。在被诊断具有CUP的患者中，即使在不能定位原发性肿瘤时仍有可能治疗该疾病。目前可用的治疗选项很少能够治愈转移性癌症。在此背景下，显然需要鉴别可用于治疗癌症的新的药剂。桥粒是上皮、心肌及其他组织之间的细胞与细胞黏着接合的主要类型之一。这种桥粒包含被称为桥粒I丐黏着蛋白(cadherin)、桥粒芯胶黏蛋白(desmocollin,Dsc)和桥粒芯糖蛋白(desmoglein, Dsg)的跨膜糖蛋白。各自以显示组织特异性表达模式的至少三种不同的遗传同工型存在。Dsg2在形成桥粒的所有组织中广泛地表达。Dsg2的胞外结构域包含四个钙黏着蛋白重复结构域(EC1-4)，各自的长度为大约110个氨基酸。胞外重复结构域EC I包含细胞黏着识别(CAR)位点，其提供细胞-细胞黏着。因此，Dsg2已鉴别为跨膜细胞黏着分子。此外，目前的研究表明Dsg2不仅是简单的细胞-细胞黏着分子。Dsg2参与促进血管生成、凋亡信号传导，并且是MMP的底物。
本发明人现已确定Dsg2在调节细胞的上皮-间充质转变(EMT)中具有重要作用。EMT是细胞发育的程序，其特征为细胞黏着的丧失和细胞运动性的提高。EMT为包括中胚层形成和神经管形成的诸多发育过程所必需。EMT也在肿瘤发展、侵袭和转移期间起主要作用。癌细胞经历EMT从而丧失细胞黏着并且获得间充质特征，所述特征中的一些为侵袭和转移所必需。本发明的第一方面提供一种用作预防或治疗癌症的药物的Dsg2拮抗剂，其中该拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NOI)或其片段或变体的功能。如上所述，本发明人已确定Dsg2在调节EMT中具有重要作用。他们已经证实(I)使用肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)引发EMT显示除Dsg2以外的大多数桥粒黏着组分的下调。(2)经Dsg2转染的上皮细胞展示类间充质的形态并且在HGF/SF的处理下显示较大的迁移和侵袭能力。(3)针对Dsg2的EC2结构域的抗体在体外显著阻断HGF/SF诱导的EMT。此外，本发明人已确定针对Dsg2的EC2结构域的抗体抑制癌细胞(包括MCF7人乳腺癌细胞、LNCaP人前列腺癌细胞及KM12人结肠癌细胞)侵袭。尽管不希望受限于任何特定理论，但本发明人提出Dsg2可以在细胞中起作用从而促进EMT。国际专利公布WO 99/57149的作者暗示可以将源自Dsg2的EC2结构域的细胞黏着识别(CAR)位点用作治疗癌症和/或抑制转移的调节因子。该作者声称这种调节因子应当抑制I丐黏着蛋白-介导的细胞黏着。令人意外地，本发明人已确定Dsg2的EC2结构域中的CAR位点在介导Dsg的EMT促进活性中不起作用。相比之下，Dsg2的EC2结构域的非CAR序列调节Dsg2的EMT促进活性。源自Dsg2的EC2结构域的非CAR序列的肽片段在体外阻断EMT和细胞侵袭，针对无CAR序列的Dsg2的EC2结构域的抗体也如此。因此，本发明人已证明Dsg2的EC2结构域的非CAR序列调节Dsg2的EMT促进功能。在本发明之前，没有任何作用被归因于存在于Dsg2的EC2结构域中的非CAR序列。非CAR序列与CAR序列没有同源性。
源自Dsg2的EC2结构域的非CAR序列的肽片段及针对无CAR序列的Dsg2的EC2结构域的抗体拮抗Dsg2的EMT促进功能。因此，Dsg2的EC2结构域的非CAR序列的功能的拮抗剂显然极适用作预防或治疗癌症的药剂，尤其是通过降低癌细胞的EMT及相关的侵袭及转移可能性来实现。此无法从任何之前已知的关于Dsg2及其在EMT中的作用的信息获知且不能尤其推断。Dsg2(桥粒芯糖蛋白2)是人跨膜细胞黏着蛋白。图I提供该蛋白结构的示意图。将Dsg2的氨基酸序列的实例提供在实施例后的SEQ ID N0:2中；其他实例可从蛋白数据库中查到,例如NCBI登录号NP_001934. 2。Dsg2的EC2结构域(胞外结构域2)位于在SEQ ID NO 2中提供的序列的氨基酸位置 161 至 273，并且被提供在以下QDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDTGEIYTTSVTLDREEHSSYTLTVEARDGNGEVTDKPVKQAQVQIRILDVNDNIPVVE(SEQ IDNO 3)。所提出的Dsg2的EC2结构域中的CAR序列位于在SEQ ID NO 2中提供的序列的 氨基酸位置210至218，并且被提供在以下VFYLNKDTG(SEQ ID NO :4)。本发明人已鉴别出在调节Dsg2的EMT促进活性中起作用的Dsg2的EC2结构域内的非CAR序列。此区域位于在SEQ ID NO 2中提供的序列的氨基酸位置160至199，并且被提供在以下TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1) 本发明的第一方面涉及Dsg2的拮抗剂，其中该拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ IDNO 1)或其片段或变体的功能。使用“Dsg2 的 EC2 结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR (SEQ ID NO I)或其片段或变体”时，我们包括拮抗剂调节SEQ ID NO 1的氨基酸序列的功能从而调节Dsg2的EMT促进功能。使用SEQ ID NO : I的“其片段或变体”时，我们包括拮抗剂影响在SEQ ID NO :1或该序列的变体中限定的EC2结构域的部分。该肽的“片段”将优选地包含少于完整天然肽的全部氨基酸序列；优选地该片段保持其生物学活性在此情况中为其调节Dsg2的EMT促进功能的能力。肽的“变体”也指其中在一个或多个位置处已有氨基酸插入、缺失或置换(保守性或非保守性)的肽，其限制条件为这些变化产生基本性质无显著变化的蛋白质，所述基本性质例如调节Dsg2的EMT促进功能的能力；蛋白质相互作用；热稳定性；在特定pH范围内的活性(PH稳定性)。在此语境中，“显著”指本领域技术人员会认为相比最初蛋白质的性质，变体的性质仍然可能不同但不会是不明显的。使用“保护性置换”时，我们意欲包括诸如Gly、Ala ;Val、Ile、Leu ;Asp、Glu ;Asn、Gln ；Ser> Thr ；Lys> Arg ;和 Phe> Tyr 的组合。可以使用本领域技术人员所熟知的蛋白质工程和定点突变的方法来制得这种变体。所附实施例提供可轻易由技术人员使用以测量Dsg2对EMT和细胞侵袭的作用的测定“阻断EMT测定”及“细胞侵袭测定”。如由本发明人所示，可以将这些测定用于测量药剂对Dsg2介导的EMT和细胞侵袭的拮抗潜能。
使用“拮抗剂”时，我们包括干扰Dsg2多肽的生理学作用的任何物质；优选地通过影响EMT促进功能。优选地，本发明的优选方面提供治疗有效量的该拮抗剂。出于本说明书的目的，拮抗剂的“治疗有效量”是足以预防或治疗被给药以该拮抗剂的对象的癌症的该拮抗剂的量。本发明的第一方面的实施方案为其中该拮抗剂降低Dsg2的EMT促进功能；优选地通过降低 Dsg2 的 EC2 结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO I)或其片段或变体的功能。这可以通过Dsg2的EMT促进功能的降低来测量；优选地该拮抗剂使该功能降低 10%,20%,30%,40%, 50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%以上。可以将在所附实施例中所述的“阻断EMT测定”和“细胞侵袭测定”用于测量Dsg2的EMT促进功能，并且因此测量该拮抗剂对该活性的作用。 可以理解有拮抗剂可以调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体的功能的多种方式。例如，在本发明的一个实施方案中，拮抗剂特异性地结合SEQ ID NO :1的氨基酸序 列。这种拮抗剂可以阻止EC2的非CAR区域调节Dsg2的EMT促进活性。使用“特异性结合”时，我们包括拮抗剂结合SEQ ID NO: I的氨基酸序列中的一些氨基酸残基，即该拮抗剂不结合所有残基以阻止EC2的非CAR区域调节Dsg2的EMT促进活性。在本发明的另一实施方案中，拮抗剂包括部分或全部SEQ ID NO :1的氨基酸序列，或其衍生物或类似物。这种拮抗剂可以是EC2的非CAR区域所介导功能的竞争性抑制剂。本发明的另一实施方案为其中拮抗剂结合与EC2的非CAR区域相互作用的分子，作为其调节Dsg2的EMT促进活性的功能的部分。拮抗剂的实例包括结合该多肽并影响其功能的化学配体，并且在更广义的术语中，这也可以包括与所述多肽之一结合以使该多肽不能行使其正常功能的抗体或抗体片段。拮抗剂也可以改变多肽的亚细胞定位。以此方式，功能性多肽的量减少。优选地，本发明的第一方面的拮抗剂是抗体或抗体片段或衍生物；肽；肽模拟物；或小分子。优选地，抗体是单克隆或多克隆抗体。将抗体用作调节多肽活性的药剂是已知的。实际上，基于抗体的治疗药剂日益被用于医药(包括不同类型的癌症)中。作所附实施例中，本发明人提供可以结合缺少EC2中的CAR序列的Dsg2多肽的多克隆抗体的例证；因此此抗体是根据本发明第一方面的拮抗剂。可以通过将抗原注射到动物中来将抗体制备成多克隆血清。可以使用本领域中已知的技术通过用抗原接种动物(例如兔子)来培养优选的多克隆抗体。可以针对源自SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多个肽制备用于治疗人类个体的多克隆抗体。例如，如在所附实施例中所示，针对对应于无CAR区的Dsg2EC2结构域的部分的序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDC(SEQ ID NO 5)来制备多克隆抗体。备选地，抗体可以是单克隆的。可以将常规杂交瘤技术用于制备这种抗体。用于产生用作本发明的拮抗剂的单克隆抗体的抗原可与用于产生多克隆血清的抗原相同；即TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDC(SEQ ID NO 5)的全部或片段或变体。抗体或免疫球蛋白的最简单形式为Y形分子，其通常以IgG类抗体为例。该分子由四条多肽链组成各自分别为大约50kD和25kD的两条相同重(H)链和两条相同(L)链。各轻链经由二硫键及非共价键与重链结合(H-L)。两条相同的H-L链组合通过两条H链之间的类似非共价和二硫键彼此相连，从而形成基本的四链免疫球蛋白结构(h-l)2。轻链免疫球蛋白由一个V结构域(')和一个恒定结构域(CJ构成，而重链由一个V结构域和(取决于H链同种型)三或四个C结构域(CH1、Ch2、Ch3和Ch4)组成。在各个轻链或重链的N端区域处的是序列变化很大并且负责与抗体特异性结合的可变(V)结构域。抗体对抗原的特异性实际上由被称为高变环或互补决定区(CDR)的V区内的氨基酸序列决定。每个H链和L链V区具有3个这种⑶R，且所有6个⑶R的组合形成抗体的抗原结合位点。展现较少变化并支持高变环的剩余的V区氨基酸被称为框架区(FR)。

可变结构域以外的区域(C结构域)的序列相对恒定。将被理解的是根据本发明的抗体的特性化特征为Vh和\结构域。还将被理解的是Ch和Q结构域的确切性质总体上对于本发明并不重要。实际上，用于本发明的优选的抗体可以具有不同的C1^P Q结构域。此外，如下所充分讨论的，优选的抗体功能衍生物可以包含可变结构域而无C结构域(例如scFV抗体)。被认为适用作本发明第一方面的拮抗剂的优选抗体可以具有 '(第一结构域)和Vh(第二结构域)结构域。其衍生物可以具有75%序列同一性，更优选90%序列同一性并且最优选地具有至少95%序列同一性。将理解大多数序列变化可能发生在框架区(FR)中，而抗体的CDR的序列及其功能衍生物应当是最保守的。用于本发明的第一方面的拮抗剂的众多优选的实施方案涉及具有可变和恒定结构域两者的分子。然而，将理解，本发明也包括基本上包含抗体可变区而无任何恒定区的抗体片段(例如scFV抗体或FAb)。被认为是用于本发明的第一方面的拮抗剂的scFV抗体片段可以包含针对Dsg2的SEQ ID NO: I产生的抗体的整个V1^P'结构域。V1^P'结构域可由合适的连接肽隔开。已知一个物种中产生的抗体(且尤其是mAb)当用于治疗不同物种时具有若干严重缺点。例如当将鼠抗体用于人时，其倾向于具有血清中的短的循环半衰期，并且可能被所治疗患者的免疫系统识别为外来蛋白。此可能导致不想要的人抗小鼠抗体(HAMA)反应的发生。当需要频繁给药抗体时此尤其麻烦，因为频繁给药会增加抗体的清除，妨碍其治疗效果，并且诱导过敏反应。这些因素限制了小鼠单克隆抗体在人类疗法中的使用，并且已经促进了抗体工程技术的开发以产生人源化抗体。因此，如果欲将抗体用作预防或治疗人类对象的癌症的治疗药剂，则优选的是非人源抗体及其片段被人源化；这种抗体被认为是用于本发明目的的抗体衍生物。可以通过剪接V区序列(例如从非人杂交瘤中产生的单克隆抗体)与人类抗体的C区(及理想地来自V区的FR)序列来实现人源化。所得的“经工程改造的”抗体相较于其所源自的非人抗体在人类中具有较小的免疫原性，并且因此更适于临床使用。人源化抗体可以是嵌合单克隆抗体，其中(使用重组DNA技术)啮齿动物免疫球蛋白恒定区被人抗体的恒定区替换。然后可以将嵌合H链和L链基因克隆到包含合适调节元件的表达载体中并引入到哺乳动物细胞中以便产生完整的糖基化抗体。通过为此过程选择适当的人H链C区域基因，可以预先确定抗体的生物学活性。这种嵌合分子可用于治疗或预防青光眼。抗体进一步的人源化可以涉及抗体的⑶R嫁接或再成形。通过以下方式来产生这种抗体将非人抗体的重链和轻链CDR(其形成抗体的抗原结合位点)移植到对应的人抗体的框架区中。人源化抗体片段代表根据本发明使用的优选的药剂。可以通过筛选可变链人抗体的噬菌体文库来鉴别识别SEQ ID NO: I上的表位的人Fab。可以使用本领域中已知的技术(例如由Morphosys或Cambridge Antibody Technology开发的技术)来产生可以用作根据本发明的拮抗剂的Fab。简言之，可以通过将来自单链Fv文库的重链和轻链可变区转移至Fab展示载体中来产生人组合Fab抗体文库。此文库可以产生2. Ix IO10个不同的抗体片段。然后可以将该肽用作“饵”来鉴别文库中具有所需结合特性的抗体片段。结构域抗体(dAb)代表可根据本发明的此实施方案使用的另一优选的药剂。dAb 是抗体的最小的功能结合单元并且对应于人抗体的重链或轻链的可变区。这种dAb具有约13kDa的分子量(相当于完整抗体尺寸的约1/10 (或以下))。可根据本发明的此实施方案使用的其他优选药剂包括双特异性Fab-scFV( “双抗体(bibody) ”)和三特异性Fab-(scFv) (2)( “三抗体(tribody) ”)。对于双抗体或三抗体，将scFv分子融合到VL-CL (L)和VH-CH1 (Fd)链中的一个或两者，例如，为产生三抗体，将两个scFv融合到Fab的C端,而在双抗体中，将一个scFv融合到Fab的C端。可以由技术人员根据本领域中可用的信息以例行方式进行这种分子的制备。拮抗剂也可以是肽或肽模拟物，其包含部分或全部SEQ ID NO :1的氨基酸序列，或其氨基酸衍生物或类似物。在所附实施例中，本发明人提供包含以下SEQ ID NO 1的氨基酸序列的部分的肽的例证KINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :6)及 EELSAAHTLV(SEQ ID NO :7)。本发明人已证明这些肽可以拮抗Dsg2的EMT促进功能，并且因此其是本发明的拮抗剂的优选实施方案。除了 SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的肽，可以制备包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的部分的其他肽。可以使用在所附实施例中所述的“阻断EMT测定”及“细胞侵袭测定”来测量这种其他肽作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。肽的制备属于例行方法。例如,通过Peptide 2. OInc (Chantilly, VA, USA)来合成用于所附实验的肽；许多其他公司提供肽的商业合成。用于肽的制备的实验室技术也是已知的，这样的方法可由技术人员轻易地执行。因此技术人员可以制备包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列的部分或全部的肽，并使用本文中提供以及来自众所周知的知识的信息来测试其作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。根据本发明的肽拮抗剂可以包含具有或不具有任何氨基酸置换的SEQ ID NO :1的所有40个氨基酸残基。然而，如上所述，本发明人已确定具有10个氨基酸(EELSAAHTLV (SEQID NO 7))和 20 个氨基酸(KINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :6))的肽可以拮抗 Dsg2 的EMT促进功能。因此，根据本发明的优选的肽可以具有约10个氨基酸(例如，7、8、9、10、11或12)至约20个氨基酸(例如，18、19、20、21、22)的范围。
肽拮抗剂还可以包含并非来源于SEQ ID NO : I的氨基酸序列的其他氨基酸序列例如，提供肽的各自功能的其他氨基酸序列(诸如标签或催化结构域)。这样的肽也包含在本发明的拮抗剂中。同样，将理解，可以使用仍在由SEQ ID NO :I提供的氨基酸序列的定义内的这些优选肽的衍生物或类似物来实施本发明。使用术语“其衍生物或类似物”时，我们是指其中氨基酸残基被具有相似侧链或肽骨架性质的残基(无论是天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸模拟物)替换的肽。此外，这种肽的一端或两端可经N和C端保护基团来保护，所述N和C端保护基团例如具有与乙酰基或酰胺基相似性质的基团。将理解，一旦最终肽形成，氨基酸序列可以经改变、截短或修饰。如上所述，技术人员可以使用本文提供以及来自众所周知的常识的信息来测试衍生物或类似物作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。这样的衍生物可以增加或减小肽在体内的半衰期。能够增加根据本发明的肽和多肽的半衰期的衍生物的实例包括多肽的拟肽衍生物、多肽的D-氨基酸衍生物和肽-拟肽杂 交物。可以通过多种方式(诸如生物系统中的蛋白酶活性)来对根据本发明的肽和多肽进行降解。这种降解可能会限制多肽的生物利用度并且因此限制多肽实现其生物学功能的能力。存在可用于设计及产生在生物环境中具有提高的稳定性的衍生物的多种现有技术。这种多肽衍生物可以由于对蛋白酶介导的降解的抗性增强而具有改善的生物利用度。优选地，适于根据本发明使用的衍生物或类似物相较于其所源自的肽更具有蛋白酶抗性。优选地，可以通过保护N端和/或C端来使多肽更具蛋白酶抗性。例如，可以用乙酰基或用烷基或芳基或烷基-CO-或芳基-CO-来保护N端，其中每个可任选地被取代。可以用酰胺基或用经取代的酰胺基来保护C端。可以通过已知的蛋白质降解测定方法来评估多肽衍生物及其所源自的多肽的蛋白酶抗性。然后可以比较多肽衍生物和多肽的蛋白酶抗性的相对值。可以根据多肽的结构信息轻易地设计出本发明的多肽的拟肽衍生物。可以根据现有方案使用市售的软件来开发拟肽衍生物。反拟肽(retropeptoid)(其中所有氨基酸被拟肽残基以相反次序替换)也能够模拟来源于脱脂载脂蛋白的抗细菌多肽。相较于肽或包含一个拟肽残基的拟肽-肽杂交物，预期反拟肽在相反的方向上结合在配体结合沟中。因此，拟肽残基的侧链能够指向与最初的肽中的侧链相同的方向。根据本发明的肽的经修饰形式的另一个实施方案包括D-氨基酸形式的肽。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸来制备肽极大减少了由正常代谢过程所致的这种药剂的任何不想要的分解，减少需要给药的药剂的量以及其给药频率。本发明的肽、类似物或衍生物代表可有利地由生物细胞表达的产物。术语“肽模拟物”指模拟作为治疗药剂的特定肽的构象和所需特征但是避免了不想要的特征的化合物。例如，吗啡是可以经口给药且为肽内啡肽的肽模拟物的化合物。有许多不同的设计及合成肽模拟物的方法，如在本领域中已知的。本发明的拮抗剂还可以是小分子。术语“小分子”在药理学和生物化学中为人熟知为低分子量化学化合物。许多制药上的药物是小分子。这些拮抗剂可以作为对小分子文库进行高通量筛选的部分被鉴别。根据本发明的筛选方法(见下)代表识别这样的抑制剂的合适的手段。拮抗剂分子的其他类型也包括在本发明的第一方面中。例如，拮抗剂可以是适配体。适配体(Aptamer)是呈现特定的、序列依赖的形状并且基于适配体与配体之间的锁匙配合(lock-and-key fit)结合特定靶标配体的核酸分子。通常，适配体可以包括单链或双链DNA分子(ssDNA或dsDNA)或单链RNA分子(ssRNA)。可以将适配体用于结合核酸和非核酸靶标两者。因此，可产生识别并因此结合Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO:I)或其片段或变体并调节其功能的适配体。合适的适配体可以选自随机序列集合，自该集合可以识别以高的亲和性结合所选的靶标分子的特定适配体。用于制备和选择具有所需特异性的适配体的方法为本领域技术人员所已知，并且包括SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)方法。简言之，产生大的寡核苷酸文库，从而允许通过体外选择及随后的经由聚合酶链反应的扩增的迭代方法来分 离大量的功能性核酸。本发明的第二方面提供用作预防和治疗癌症的药物的Dsg2的拮抗剂，其中该拮抗剂是Dsg2多肽或其片段或变体，其中该多肽在Dsg2的EC2结构域的序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :I)或其片段或变体内具有一个或多个氨基酸残基置换、倒位和/或缺失。除通过调节氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQIDNO 1)的功能来影响Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂以外，用于本发明的另一种拮抗剂可以是其中SEQ ID NO :1的氨基酸序列被改变从而不具功能的Dsg2多肽。这种多肽可以通过充当天然Dsg2的竞争性抑制剂并因此降低天然Dsg2的EMT促进功能来充当拮抗剂。在本发明之前，SEQ ID NO 1的氨基酸区域调节Dsg2的EMT促进功能并非已知且不是显而易见的。如上所述，技术人员可以使用所附实施例中所述的“阻断EMT测定”和“细胞侵袭测定”来测试在序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)内具有一个或多个氨基酸残基替换、倒位和/或缺失的Dsg2多肽是否具有作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。本发明此方面的多肽可以包含SEQ ID NO :2或其片段，其中该多肽在序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)内具有一个或多个氨基酸残基置换，倒位和/或缺失。使用“片段”时，我们包括该多肽不包括Dsg2的所有氨基酸序列，但是可以充当Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂。多肽的“变体”指其中在一个或多个位置处存在氨基酸插入、缺失或置换(保守的或非保守的)的Dsg2多肽。例如，多肽可以包含SEQ ID NO :I的氨基酸残基的一部分或全部的缺失。制备本发明第二方面的多肽的方法在本领域中是已知的；例如使用如在Sambrook等(2001) Molecular cloning, a laboratory manual (分子克隆实验室手册)，3nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 中所述的重组DNA技术。
Dsg2的氨基酸序列的实例提供在实施例的最后在SEQ ID NO 2中；其他实例可以自蛋白质数据库中查得，例如NCBI登录号NP_001934. 2。编码Dsg2的氨基酸序列的核酸序列的实例可以于NCBI登录号NG_007072. 2处找到。根据此信息，技术人员可以容易地制备在序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR (SEQ ID NO I)内具有一个或多个氨基酸残基替换、倒位和/或缺失的Dsg2多肽。本发明第二方面的优选的实施方案为其中拮抗剂是包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO :8提供在以下实施例的最后。SEQ ID NO :8的多肽序列对应于具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列但是无EC2的非CAR序列的Dsg2多肽，如在SEQ ID NO :4中所示。本发明的第二方面的优选的实施方案为其中拮抗剂是包含SEQ IDNO 9的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO :9被提供在以下实施例的最后。SEQ ID NO :9的多肽序列对应 于具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列但是没有ECl和EC2CAR序列的Dsg2多肽。本发明的第三方面提供用作预防或治疗癌症的药物的Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂。如上所述，国际专利公布WO 99/57149的作者暗示源自Dsg2的EC2结构域的细胞黏着识别(CAR)位点可以被用作治疗癌症和/或抑制转移的调节因子。该作者声称这种调节因子应当抑制钙黏着蛋白介导的细胞黏着。然而，我们希望指出，来源自Dsg2的EC2结构域的CAR位点的调节因子并不充当Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂。可以从所附实施例中呈现的数据清楚地看到这一点。因此在TO 99/57149中公开的调节因子并不是本发明的第三方面的拮抗剂。此外，在本发明之前，Dsg2多肽的哪个区域负责调节Dsg2的EMT促进功能不是已知的并且也不是明显的。使用“Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂”时，我们包括以上关于本发明的第一和第二方面所讨论的那些拮抗剂；即其中该拮抗剂特异性地结合SEQID NO :I的氨基酸序列；其中该拮抗剂包括部分或全部SEQ ID NO :I的氨基酸序列，或其氨基酸衍生物或类似物；其中该拮抗剂结合与EC2的非CAR区域相互作用的分子，作为其调节Dsg2的EMT促进活性的功能的部分。优选地，本发明此方面的拮抗剂是抗体或抗体片段或衍生物；肽；肽模拟物；或小分子。优选地，本发明此方面的拮抗剂是单克隆或多克隆抗体；或肽或肽模拟物，其包含部分或全部SEQ ID NO: I的氨基酸序列，或其氨基酸衍生物或类似物；例如包含氨基酸序列KINATDADEPNTLNSKISYR (SEQ ID NO :6)和 EELSAAHTLV (SEQ ID NO :7)的肽。优选地，本发明此方面的拮抗剂是Dsg2多肽或其片段或变体，其中该多肽在Dsg2的 EC2 结构域的序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体内具有一个或多个氨基酸残基置换、倒位和/或缺失；优选地拮抗剂是包含SEQID NO 8的氨基酸序列的多肽；优选地拮抗剂是包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的多肽。可以使用在所附实施例中所述的“阻断EMT测定”和“细胞侵袭测定”来测量其他药剂作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。例如，可以根据本发明的筛选方法来鉴别拮抗剂。
如上所述，本发明各个方面的拮抗剂可以用于降低Dsg2的EMT促进功能。EMT是细胞发育的程序，其特征为细胞黏着的丧失和细胞运动性的提高。EMT包括诸多不同的发育过程。与Dsg2在癌症中的作用最相关的那些包括细胞转移和细胞侵袭。因此，优选地本发明各个方面的拮抗剂降低Dsg2的细胞转移和/或细胞侵袭促进功能。本文在所附实施例中所述的“阻断EMT测定”和“细胞侵袭测定”中提供了用于测定拮抗剂对Dsg2的细胞转移和/或细胞侵袭促进功能的方法。使用“癌症”时，我们包括所有类型的癌症；例如膀胱癌；乳腺癌(女性和男性)；结肠癌；直肠癌；子宫内膜癌；肾脏(肾细胞)癌；白血病；肺癌；黑色素瘤；非霍奇金淋巴瘤；胰腺癌；前列腺癌；皮肤癌；和甲状腺癌。在所附实施例中，本发明人已证实在前列腺癌、乳腺癌和皮肤癌细胞系中的Dsg2的EMT促进功能。因此本发明优选实施方案为其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌或皮肤癌。

本发明第一、第二和第三方面的拮抗剂被用于预防或治疗癌症。诊断癌症的方法在本领域中是已知的:见例如，http://www. cancer, gov/,其提供了不同类癌症的细节；其如何诊断；及可能疗法。本发明第一、第二和第三方面的拮抗剂被用作药物。配制药物的多种方法在下文提供。本发明的其他方面提供本发明第一、第二和第三方面的拮抗剂在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。本发明的另一方面提供治疗癌症的方法，所述方法包括向对象给药治疗有效量的本发明第一、第二和第三方面的拮抗剂。本发明的第四方面提供肽，其包含氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO I),KINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :6)或EELSAAHTLV(SEQ IDNO: 7)，或其片段或变体。在本发明之前，Dsg2多肽的哪个区域负责调节Dsg2的EMT促进功能并非已知并且并非显而易见。因此不可以预期本发明此方面的肽具有作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。优选地本发明此方面的肽是Dsg2的拮抗剂，其调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体的功能。使用“其片段或变体”时，我们包括以上关于本发明的第一方面讨论的肽的那些片段或变体。可以在例如以上给出的本发明的第一方面处找到关于制备本发明此方面的肽的其他信息。同样，实施例提供了关于如何制备本发明此方面的肽的细节。本发明的第五方面提供包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其片段或变体的多肽，其中该多肽在 Dsg2 的 EC2 结构域的序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO I)或其片段或变体内具有一个或多个氨基酸残基替换、倒位和/或缺失。本发明此方面的实施方案为其中该多肽包含SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 9的氨基酸序列。在本发明之前，Dsg2多肽的哪个区域负责调节Dsg2的EMT促进功能并非已知并且并非显而易见。因此不可以预期本发明此方面的多肽具有作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。优选地，本发明此方面的多肽是Dsg2的拮抗剂。使用“其片段或变体”时，我们包括以上关于本发明的第二方面讨论的多肽的那些片段或变体。可以在例如以上给出的本发明的第二方面处找到关于制备本发明此方面的多肽的其他信息。同样，实施例提供了关于如何制备本发明此方面的多肽的细节。本发明的第六方面提供抗体，其能够特异性结合氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO I)KINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :6)或EELSAAHTLV (SEQID NO :7)，或其片段或变体。在本发明之前，Dsg2多肽的哪个区域负责调节Dsg2的EMT促进功能并非已知并且并非显而易见。因此不可以预期本发明此方面的抗体具有作为Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂的效用。 优选地，本发明此方面的抗体是Dsg2的拮抗剂，其调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体的功能。使用“其片段或变体”时，我们包括以上关于本发明的第一方面讨论的多肽的那些片段或变体。可以在例如以上给出的本发明的第一方面处找到关于制备本发明此方面的抗体的其他信息。同样，实施例提供了关于如何制备本发明此方面的抗体的细节。本发明的第七方面提供用于医学方面使用的本发明的第四、第五或第六方面中任一个的肽、多肽或抗体。本发明的第八方面提供药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的拮抗剂、肽、多肽或抗体以及任选地包含药用载体。在一个实施方案中，拮抗剂、肽、多肽或抗体的量是约0. Olmg至约800mg的量。在另一个实施方案中，拮抗剂、肽、多肽或抗体的量是约0. Olmg至约500mg的量。在另一个实施方案中，拮抗剂、肽、多肽或抗体的量是约0. Olmg至约250mg的量。在另一个实施方案中，拮抗剂、肽、多肽或抗体的量是约0. Img至约60mg的量。在另一个实施方案中，拮抗剂、肽、多肽或抗体的量是约0. Img至约20mg的量。本发明提供制备包含治疗有效量的本发明的拮抗剂、肽、多肽或抗体及药用载体的药物组合物的方法。“治疗有效量”是本发明的拮抗剂、肽、多肽或抗体当其被给药于对象时提供癌症的预防和/或治疗的任何量。“对象”是脊椎动物、哺乳动物、家养动物或人类。
在本文中“药用载体”指本领域技术人员已知的可用于配制药物组合物的任何生理学载体。有许多不同的方法可以将用于本发明的拮抗剂作为药物使用。取决于(尤其是)组合物的使用方式，可以将拮抗剂组合在具有多种不同形式的组合物中。因此，例如，组合物可以是以粉末、片剂、胶囊、液体、膏剂、霜剂、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束、透皮贴剂、脂质体的形式或可给药于人或动物的任何其他合适的形式。将理解本发明的组合物的载体应当为被其所给药的对象充分耐受并且优选地使拮抗剂能够递送到靶标细胞、组织或器官。因此，优选的是，通过经合适保护的载体颗粒(例如胶束)来递送拮抗剂。可以多种方式使用抗体或其功能衍生物。例如，可能需要全身给药，在该情况中，抗体或其衍生物可以包含在组合物内，所述组合物可以例如以片剂、胶囊或液体的形式经口摄取。优选的是通过注射将抗体或其衍生物给药到血流中。注射可以是静脉注射(推注或输注)或皮下注射(推注或输注)。备选地，可以将抗体直接注射到肝。取决于(尤其是)组合物的使用方式，可以将多肽治疗实体组合在具有多种不同形式的药物组合物中。因此，例如，组合物可以是以粉末、片齐U、胶囊、液体、膏齐U、霜齐U、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束、透皮贴剂、脂质体的形式或可给药于人或动物的任何其他合适的形式。将理解本发明的组合物的载体应当为被其所给药的对象充分耐受并且优选地使治疗剂能够递送到靶标细胞、组织或器官。在优选的实施方案中，药物载体是液体而药物组合物以溶液的形式。在另一个实施方案中，药物载体是凝胶而组合物是以霜剂等的形式。也可以将拮抗剂整合到缓慢或延迟释放的装置中。这样的装置可以例如插在皮肤上或在皮肤下，而化合物可在数周或甚至数月的时间内释放。当需要用根据本发明的拮抗剂长期治疗并且其通常需要频繁给药(例如至少每日注射)时，这样的装置可能尤其有利。

将理解，需要的拮抗剂的量取决于其生物学活性和生物利用度，而其又取决于给药模式、采用的拮抗剂的物理化学特性及拮抗剂是作为单一疗法使用还是以组合疗法使用。此外，该量将取决于将治疗的靶标细胞的数量和状态。给药频率也将受上述因素以及尤其是拮抗剂在所治疗的对象体内的半衰期的影响。将被给药的最佳剂量可以由本领域技术人员决定，并且将随所用的特定拮抗剂、制剂强度、给药模式及疾病状态的进展而变化。取决于所治疗的特定对象的其他因素将导致需要调节剂量，所述其他因素包括对象年龄、体重、性别、饮食和给药时间。可以使用已知方法诸如由制药工业常规采用的那些(例如体内实验、临床试验等)来制备根据本发明的拮抗剂的特定制剂及准确的治疗方式(诸如拮抗剂的每日剂量和给药频率)。通常，取决于所用的特定拮抗剂，可以将在0. 01 V- g/kg体重至0. 5g/kg体重之间的根据本发明的拮抗剂的每日剂量用于预防和/或治疗癌症。更优选地，每日剂量在0. 01mg/kg体重与200mg/kg体重之间，并且最优选地,在大约lmg/kg至100mg/kg之间。每日剂量可以单次给药(例如每日单次注射)给予。备选地，所用拮抗剂可能需要每日给药两次或更多次。例如，根据本发明的拮抗剂可以两次(或更多次，取决于病症的严重性)在25mg至7000mg之间的每日剂量给药(即假定体重为70kg)。接收治疗的患者可以在醒来时服用第一剂，然后在夜晚或3或4小时的间隔之后服用第二剂(如果使用的是两剂方案)。备选地，可以将缓释装置用于向患者提供最佳剂量而无需给药重复的剂量。本发明的第九方面提供筛选Dsg2的拮抗剂的方法，其中该拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体的功能，所述方法包括(i)将具有Dsg2多肽的细胞暴露于测试化合物；(ii)并且测定该测试化合物对Dsg2的EC2结构域的SEQ ID NO : I的氨基酸序列的功能的作用。可以将本发明的方法用于鉴别可用于治疗癌症的化合物。本发明第九方面的实施方案为其中所述方法还包括选择使Dsg2的EMT促进活性降低的测试化合物的步骤。本发明第九方面的实施方案为其中所述方法还包括将所选的药剂(或其衍生物或类似物)与药物载体混合的步骤。本发明第九方面的方法涉及药物或先导(lead)化合物的筛选方法。测试化合物可以是类药化合物或用于开发类药化合物的先导化合物。术语“类药化合物”为本领域技术人员所熟知，并且可以包括以下含义具有使其适用于医学方面(例如作为药物中的活性成分)的特性的化合物。因此，例如，类药化合物可以是可以通过有机化学技术，次优地通过分子生物学或生物化学技术合成的分子，并且优选地是小分子，其可以低于5000道尔顿并且可以是水溶性的。类药化合物可另外显示与特定蛋白质或多种蛋白质选择性相互作用的特征并且是生物可用的和/或能够穿透靶细胞膜，但是将理解这些特征并非必要。术语“先导化合物”也类似地为本领域技术人员所熟知，并且可以包括以下含义化合物虽然自身并不适用作药物(例如因为它对其所欲目标仅具有弱的效力，其作用的非选择性，不稳定，可溶性差，难以合成或具有差的生物利用度)但却可以为设计可具有更想要的特性的其他化合物提供起点。

本发明的第七和第八方面的方法包括确定测试化合物对Dsg2的EC2结构域的SEQID NO 1的氨基酸序列的功能的作用的步骤。所有这些方法的共同点是都需要“参考样品”，即获取自尚未暴露于测试化合物的动物或细胞的蛋白或核酸的样品。通过将在获取自尚未暴露于测试化合物的动物或细胞的蛋白或核酸的样品中的Dsg2的EC2结构域的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的功能与在获取自已经暴露于测试化合物的动物或细胞的蛋白或核酸的样品中的Dsg2的EC2结构域的SEQID NO 1的氨基酸序列的功能相比，可能确定测试化合物对Dsg2的EC2结构域的SEQ IDNO 1的氨基酸序列的功能的作用。这将显示测试化合物对Dsg2的EC2结构域的SEQ IDNO 1的氨基酸序列的功能产生增强作用、抑制作用或无作用。可以使用众多不同的方法来进行评估Dsg2的EC2结构域的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的功能的步骤。可以将本发明的筛选方法用于“文库筛选”(此为本领域技术人员所熟知的术语)方法。因此，例如，可以将本发明的方法用于检测(并且任选地鉴别)能够影响Dsg2的EC2结构域的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的功能的测试化合物。可测试文库等分试样产生所需结果的能力。本发明的第七和第八方面的方法的其他实施方案为其中所选的化合物被制备成药用组合物。本文所述的所有特性(包括任何所附权利要求、摘要和附图
)和/或所公开的任何方法或过程的步骤可以任何组合与任何以上方面组合，除这些特性和/或步骤中的至少部分相互排斥的组合以外。现在将根据以下实施例和附图来进一步描述本发明。图I :CAR与非CAR位点之间的功能阻断差异。图2 :抗Dsg2EC2抗体抑制EMT。抗ECl和抗EC4抗体不抑制EMT。图3 :抗Dsg2EC2抗体抑制(A)人黑色素瘤A375细胞、(B)人乳腺癌MCF7细胞和(C)人前列腺癌LNCaP细胞的侵袭能力。图4 :使用无完整CAR结构域(VFYLNKDTG)的Dsg2EC2肽序列产生兔多克隆抗体。(A)EMT被所产生的抗体显著抑制；(B)细胞侵袭测定测量细胞生长及穿透由“Matrigel”制成的凝胶的能力。所产生的抗体抑制人乳腺癌MCF7细胞的侵袭能力。图5 :制备8种合成肽。(A)EMT被Dsg2EC2的非CAR序列(肽4和7)显著阻断；而CAR序列及其他非CAR序列不影响EMT。(B)人乳腺癌MCF7细胞的细胞侵袭能力被非CAR序列(肽4和7)抑制。实施例I :测定Dsg2调节上皮-间充质转变的功能。引言本发明涉及通过调节Dsg2的EC2结构域的非CAR序列的功能来抑制上皮-间充质转变(EMT)。桥粒是上皮、心肌及其他组织之间的细胞与细胞黏着接合的主要类型之一。这种桥粒包含被称为桥粒I丐黏着蛋白、桥粒芯月父黏蛋白(Dsc)和桥粒芯糖蛋白(Dsg)的跨U旲糖 蛋白。各自以显示组织特异性表达模式的至少三种不同的遗传同工型存在。Dsg2在形成桥粒的所有组织中广泛地表达。Dsg2的胞外结构域包含四个钙黏着蛋白重复结构域(EC1-4)，各自的长度为大约110个氨基酸。胞外重复结构域ECl包含细胞黏着识别(CAR)位点，其提供细胞-细胞黏着。因此，Dsg2已鉴别为跨膜细胞黏着分子。然而，目前的研究表明Dsg2不仅是简单的细胞-细胞黏着分子。Dsg2参与促进血管生成、凋亡信号传导，并且是MMP的底物。此外，之前已经证实，Dsg2可以在EMT中起作用。EMT是与细胞-细胞黏着非常不同的生理作用。在此背景下，本发明人研究了 Dsg2及该蛋白内的特定区域在调节EMT中的作用，以及是否可以调节Dsg2以抑制癌症细胞侵袭。结果和讨论之前已经提出Dsg2在EMT中起作用。然而不知道的是Dsg2的此活性如何被调节。图I显示Dsg2的示意图，以及已知及提出的该蛋白内的结构域的功能。胞外重复结构域ECl和EC2包含细胞黏着识别(CAR)位点，其提供细胞-细胞黏着。ECl结构域中的Dsg2CAR序列(LTGYALDARG ;SEQ ID NO :10)的细胞黏着功能是已知的，并且已经提出EC2结构域中的CAR序列(VFYLNKDTGE ;SEQ ID NO 4)在细胞黏着中具有相似功能。本发明人研究了与Dsg2的EC1、EC2和EC4结构域特异性结合的抗体对EMT的作用。如在图2和3中可见，抗EC2抗体抑制EMT并抑制人黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞的细胞侵袭，而抗ECl和抗EC4抗体不具有这种作用。因此似乎Dsg2的EMT调节活性由该蛋白的EC2结构域内的序列介导。已经提出Dsg2的EC2结构域包含CAR结构域。之前已经证明，Dsg2中的CAR结构域及其他桥粒芯胶黏蛋白(Dsc)和桥粒芯糖蛋白(Dscl、Dsc2、Dsc3、Dsgl、Dsg2和Dsg3)在细胞黏着中发挥作用。然而，已知经由CAR阻断桥粒黏着促进细胞迁移、细胞侵袭和转移。相反地，抗EC2抗体抑制EMT，导致保持细胞黏着并阻碍细胞迁移、细胞侵袭和转移。因此，Dsg2的EC2结构域中的CAR序列似乎不可能负责该蛋白的任何EMT促进活性。因此，本发明人决定确定Dsg2的EC2结构域中调节该蛋白的EMT促进活性的区域的位置。为此，本发明人制备了针对来源于Dsg2EC2但缺乏完整CAR结构域的肽的兔多克隆抗体TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDC(SEQ ID NO:5)。
随后将该抗体用于“阻断EMT测定”和“细胞侵袭测定”(以下详述)以确定其对细胞的作用。结果显示在图4中。可见EMT被所产生的抗体显著抑制(图A)，并且也可见所产生的抗体抑制人乳腺癌MCF7细胞的侵袭能力(图B)。因此，此数据清楚地表明Dsg2的EMT促进功能受到EC2中的非CAR区域的介导。随后本发明人制备了一系列来源于Dsg2的EC2结构域的肽肽I :对照肽(YTRLGANLAG) (SEQ ID NO :11)。肽2 EC1 的 CAR 序列(LTGYALDARG) (SEQ ID NO 10)。肽3 EC2 的 CAR 序列(VFYLNKDTGE) (SEQ ID NO 4)。肽4 EC2 的非 CAR 序列(KINATDADEPNTLNSKISYR) (SEQ ID NO :6)。肽5 EC2 的非 CAR 序列(YTTSVTLDREEHSSY) (SEQ ID NO :12)。 肽6 EC2 的非 CAR 序列(ARDGNGEVTDKPVKQ) (SEQ ID NO :13)。肽7 EC2 的非 CAR 序列(EELSAAHTLV) (SEQ ID NO :7)。肽8 EC2 的非 CAR 序列(IVSLEPAYPP) (SEQ ID NO :14)。随后将该肽用于“阻断EMT测定”和“细胞侵袭测定”(以下详述)以确定其对细胞的作用。结果显示在图5中。可见EMT和细胞侵袭被肽4和7显著抑制。此数据还清楚地显示Dsg2的EMT促进功能受EC2中的非CAR区域的介导。因此，本发明人已证明存在于Dsg2的EC2中的非CAR序列的抑制和拮抗能够在体外阻断EMT和侵袭，并且具有在体内阻断癌症侵袭和转移的潜力。实验方案抗体产生由Abgent(San Diego, CA, USA)来产生多克隆抗体。简言之,合成免疫性肽序列(TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDC ；SEQ ID NO :5)，将其与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)缀合并用于免疫兔子。给兔子放血并通过饱和硫酸铵沉淀并继之以对PBS透析来制备该抗体。肽通过Peptide 2. OInc (Chantilly, VA, USA)来合成实验中使用的肽。肽I :对照肽(YTRLGANLAG ；SEQ ID NO :11)。肽2 EC1 的 CAR序列(LTGYALDARG ；SEQ ID NO :10)。肽3 EC2的 CAR序列(VFYLNKDTGE ；SEQ ID NO :4)。肽 4 EC2 的非 CAR序列(KINATDADEPNTLNSKISYR ；SEQ ID NO 6)。肽 5 EC2 的非 CAR 序列(YTTSVTLDREEHSSY ；SEQ ID NO :12)。肽 6 EC2 的非 CAR 序列(ARDGNGEVTDKPVKQ ；SEQ ID NO :13)。肽 7 EC2 的非 CAR 序列(EELSAAHTLV ；SEQID NO 7)。肽 8 EC2 的非 CAR 序列(IVSLEPAYPP ；SEQ ID NO :14)。阻断EMT测定将抗体或肽添加到96孔板中的培养在含2. 5ng/ml HGF/SF的标准培养基中的10%近汇合(sub-confluent)MDCK细胞24h。在无任何抗体或肽处理的MDCK细胞中通过HGF/SF来诱导EMT。通过将不同浓度的不同的抗体和肽添加到培养在含2. 5ng/ml HGF/SF的标准培养基中的10 %近汇合MDCK细胞来研究其在阻断EMT方面的作用。细胞侵袭测定在使用前一日在冰箱中解冻生长因子减少的MatrigelTM基质(BD，BectonDickinson Biosciences, Bedford, MA, USA)。通过预冷却的移液管在冰上混合 Matrigel基质至均质。将4ul不含(对照组)或含有Iu I不同浓度的抗体或肽的在标准培养基中的细胞悬浮液(I X 106个细胞/ml)与95 u I Matrigel基质在冷Eppendorf管中混合。在使用冷却的移液管充分混合后，将在Matrigel混合物中的30 U I细胞加入到48孔板中。在37°C在C02培养箱中将该板培养Ih以使液滴混合物聚合。加入250 u I标准培养基以覆盖细胞/Matrigel液滴并培养数日。在细胞/Matrigel液滴内的四个区域中用Nikon4500CoolpiX数码相机在显微镜下记录盲选的细胞侵袭图像。序列表Dsg2 的 EC2 的非 CAR 序列(SEQ ID NO 1)TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKI SYR人 Dsg2(SEQ ID NO 2)mar spgraya Illllicfnv gsglhlqvls trnenkl Ipk hph I vr qkra witapvalregedIskknpi akihsdlaee rglkitykyt gkgi teppf g ifvfnkdtgelnvtsildreetpfflItgy aldargnnve kplelrikvl dindnepvft qdvfvgsvee
Isaahtlvmkinatdadepn tlnskisyri vs Iepayppv fylnkdtgei yttsvtIdreehssytltveardgngevtd kpvkqaqvqi rildvndnip vvenkvlegm veenqvnvevtrikvfdadeigsdnwlanf tfasgneggy fhi etdaqtn egivtIikev dyeemknldfsvivankaafhksirskykp tpipikvkvk nvkegihfks sv i s i yvse s mdrsskgqi ignfqafdedtglpaharyvk I edrdnwi sv dsvtseikla klpdfesryv qngtytvkivaisedyprktitgtvlinve dindncptIi epvqtichda eyvnvtaedl dghpnsgpfsfsvidkppgmaekwkiarqe stsvllqqse kklgrseiqf I i sdnqgf sc pekqvl11 tvceclhgsgcreaqhdsyvgl gpaaialmiI af11111vpI 11lmchcgkg akgftpipgtiemlhpwnnegappedkvvp sflpvdqggs lvgrngvggm akeatmkgs s sas i vkgqhemsemdgrweehrsllsgrat qftgatgaim ttettktara t gasrdmaga qaaavalneef lrnyftdkaasyteedenh takdcI Ivys qeeteslnas igccsf iege lddrfiddlglkfktlaevclgqkidinke i eqrqkpate tsmntashsI ceqtmvnsen tyssgssfpvpkslqeanaekvtqeivter svssrqaqkv atplpdpmas rnviatetsy vtgstmppttvi lgpsqpqslivtervyap as11vdqpya negtvvvter viqphgggsn plegtqhlqdvpyvmvreresflapssgvq ptlampniav gqnvtvterv lapastIqss yqiptensmtarnttvsgagvpgplpdfgl eesghsnsti ttsstrvtkh stvqhsysDsg2 的 EC2 结构域(SEQ ID NO :3)QDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDTGEIYTTSVTLDREEHSSYTLTVEARDGNGEVTDKPVKQAQVQIRILDVNDNIPVVEDsg2 的 EC2 的 CAR 序列(SEQ ID NO :4)VFYLNKDTGE无CAR 序列的 Dsg2EC2 结构域(SEQ ID NO :5)TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYRIVSLEPAYPPVFYLNKDCDsg2 的 EC2 的非 CAR 序列的片段(SEQ ID NO :6)KINATDADEPNTLNSKISYRDsg2 的 EC2 的非 CAR 序列的片段(SEQ ID NO :7)
EELSAAHTLV无EC2 的非 CAR 区域的人 Dsg2(SEQ ID NO :8)
权利要求
1.Dsg2的拮抗剂，其用作预防或治疗癌症的药物，其中所述拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体的功能。
2.权利要求I的拮抗剂，其中所述拮抗剂降低Dsg2的EMT促进功能。
3.权利要求I或2的拮抗剂，其中所述拮抗剂特异性地结合SEQID NO 1的氨基酸序列。
4.权利要求I或2的拮抗剂，其中所述拮抗剂包括部分或全部的SEQID NO 1的氨基酸序列或其氨基酸衍生物或类似物。
5.前述权利要求中任一项的拮抗剂，其中所述拮抗剂是抗体或抗体片段或衍生物，肽，肽模拟物或小分子。
6.权利要求5的拮抗剂，其中所述拮抗剂是多克隆抗体。
7.权利要求5的拮抗剂，其中所述拮抗剂是肽或肽模拟物，其包括部分或全部的SEQID NO:I的氨基酸序列，或其氨基酸衍生物或类似物。
8.权利要求7的拮抗剂，其中所述肽包含氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :1)、KINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :6)或EELSAAHTLV(SEQID NO :7)，或其氨基酸衍生物或类似物。
9.Dsg2的拮抗剂，其用作预防或治疗癌症的药物，其中所述拮抗剂是Dsg2多肽或其片段或变体，其中所述多肽在Dsg2的EC2结构域的序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR (SEQ ID NO I)或其片段或变体内具有一个或多个氨基酸残基置换、倒位和/或缺失。
10.权利要求9的拮抗剂，其中所述多肽包含SEQID NO 8或SEQ ID NO 9的氨基酸序列。
11.Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂，其用作预防或治疗癌症的药物。
12.权利要求11所述的Dsg2的EMT促进功能的拮抗剂，其中所述拮抗剂如权利要求I至10中任一项所定义。
13.前述权利要求中任一项的拮抗剂，其中所述拮抗剂降低Dsg2的细胞转移和/或细胞侵袭促进功能。
14.前述权利要求中任一项的拮抗剂，其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌或皮肤癌。
15.肽，其包含氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO:1)、KINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO :6)或EELSAAHTLV (SEQ ID NO :7)，或其片段或变体。
16.多肽，其包含SEQID NO :2的氨基酸序列或其片段或变体，其中所述多肽在Dsg2的EC2 结构域的序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO 1)或其片段或变体内具有一个或多个氨基酸残基替换、倒位和/或缺失。
17.权利要求16的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列。
18.抗体，其能够特异性地结合氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(seq id no : Dkinatdadepntlnskisyr(seq id no :6)或 eelsaahtlv (seq id no :7)，或其片段或变体。
19.用于医学中的权利要求10至13中任一项的肽、多肽或抗体。
20.药物制剂，其包含权利要求I至19中任一项的拮抗剂肽、多肽或抗体以及药用赋形剂。
21.筛选Dsg2的拮抗剂的方法，其中所述拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列 TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO:I)或其片段或变体的功能，所述方法包括(i)将具有Dsg2多肽的细胞暴露于测试化合物；(ii)和确定所述测试化合物对Dsg2的EC2结构域的SEQ ID NO : I的氨基酸序列的功能的作用。
22.权利要求21的方法，其还包括选择使Dsg2的EMT促进活性降低的测试化合物的步骤。
23.权利要求16至18中任一项的方法，其中所述方法具有将所选的药剂(或其衍生物或类似物)与药用载体混合的额外步骤。
全文摘要
本发明涉及用于治疗癌症的药剂。将被使用的药剂是Dsg2的拮抗剂，其中所述拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO1)或其片段或变体的功能。同样包括在本发明中的是特异性多肽和药物制剂。同样包括在本发明中的有筛选Dsg2的拮抗剂的方法，其中所述拮抗剂调节Dsg2的EC2结构域的氨基酸序列TQDVFVGSVEELSAAHTLVMKINATDADEPNTLNSKISYR(SEQ ID NO1)或其片段或变体的功能。
文档编号G01N33/68GK102791736SQ201080053161
公开日2012年11月21日 申请日期2010年9月22日 优先权日2009年9月23日
发明者陈铭哲 申请人:艾斯可勒皮恩有限公司