专利名称：一种致癌基因C-myc蛋白的荧光光谱测定方法
技术领域：
本发明属于肿瘤细胞中蛋白含量检测技术领域，具体涉及一种用于检测致癌基因 C-myc重组蛋白的荧光光谱方法。
背景技术：
C-myc蛋白是最早被发现与肿瘤细胞增殖活性相关的原癌基因产物之一，定位于 胞核中，在调节DNA合成、细胞增殖、凋亡、分化及细胞周期进程等生命活动中有极其重要 的作用，而且还密切参与了细胞肿瘤的转化。C-myc蛋白的表达与很多癌组织和细胞肿瘤的 启动及癌性程度密切相关。目前针对C-myc蛋白的检测有传统生物学酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等，而传统的方法仅能做到定性或半定量。这些方法操作繁 琐、精度低，使其应用受到限制，因此需要寻找一种能够快速定量检测C-myc蛋白的方法。 本发明提供了一种基于纳米金溶胶引起蛋白荧光淬灭的光谱分析技术，可快速检测癌变组 织中C-myc蛋白的含量。

发明内容
本发明的目的是提供一种C-myc蛋白荧光光谱检测方法，利用该方法对本身具有 荧光性的蛋白质与金纳米溶胶相互作用而产生荧光猝灭的效应，可快速定量地检测癌变组 织中C-myc蛋白的含量，具有应用效果好、检测范围宽、检测限低等优点。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案提出一种C-myc的快速检测方法，所检测的蛋白本身具有荧光性，并与金溶胶相 互作用产生荧光粹灭，该方法包括以下步骤金溶胶的制备；用荧光光谱仪采集C-myc蛋白 的激发光谱与发射光谱；根据C-myc蛋白与金纳米溶胶相互作用后的荧光猝灭现象得到的 荧光光谱，建立C-myc蛋白的不同浓度与荧光淬灭强度(AF)的对应关系；获得标准曲线， 确定所测样品的C-myc蛋白含量。其中，所述荧光光谱为激发光谱和发射光谱，所述荧光光谱仪为分子荧光光谱仪， 激发波长扫描范围为200-900nm，所用金溶胶采用柠檬酸钠还原法制备。同时，建立不同浓度蛋白质与荧光淬灭强度(AF)的对应关系后，通过 Stern-Volmer 曲线、Lineweaver-Burk 双倒数曲线和 lg[(IF°/IF)-l] IgCq 曲线对其作用 机理进行分析，即荧光蛋白物质与猝灭剂金溶胶之间形成复合物时发生静态猝灭，从另一 方面证明了本方法的可行性。其中，AF = Ftl-F, Ftl为试剂空白的荧光强度，F为加入猝灭 剂后的荧光强度，Cq为猝灭剂的浓度。对本方法的稳定性、重现性、回收率进行测定，证明了本发明方法的可靠性。本发明具有操作简单、快速和通用性强等特点。


下面结合附图对本发明进一步说明。附图1为C-myc蛋白的荧光光谱图。附图2为C-myc蛋白与金纳米溶胶的荧光粹灭图。附图3为荧光淬灭强度AF与不同浓度C-myc蛋白(87. 5-875pmol/L)的检测标 准曲线图。附图4为荧光淬灭强度AF与不同浓度C-myc蛋白(0. 175-17. 5pmol/L)的检测 标准曲线图。图1中曲线a为最佳激发光谱曲线，曲线b为最佳发射光谱曲线；图3中标准曲线 的线性方程为γ = 0. 36472X+393. 32，R = O. 9974，η = 6 ；图4中标准曲线的线性方程为Y =14. 503Χ+98. 310, R = O. 9990, η = 5。
具体实施例方式本发明是基于荧光光谱原理而提出的，结合附图和实施例说明如下本发明所述的检测方法的实施主要包括标准曲线的建立和样品的测定，涉及到的 硬件设置包括荧光光谱仪，另外需要有比色皿；软件设施包括化学计量软件，常用绘图软 件，计算机等部分；利用本发明可以进行定量分析。具体技术方案是采用柠檬酸钠还原法制备金溶胶纳米颗粒(5-50nm，10-600pmol/ L)，采用PBS缓冲液(lOmmol/L，pH = 7. 40)配制C-myc蛋白溶液测定其荧光光谱，然后将其 与一定粒径的金纳米溶胶相互作用后测其荧光淬灭强度，建立C-myc蛋白浓度检测的标准曲 线。在相同条件下进行样品测定，通过已得的标准曲线计算C-myc蛋白的含量。实施例1对C-myc标准样品进行扫描条件选择，确定激发波长和发射波长。用PBS缓冲液做溶剂，以1 μ L —定粒径的金溶胶(12nm，64pmol/L)为基体，配制 一系列浓度的C-myc标准溶液。设置扫描范围200-600nm。按浓度由低到高往比色皿中加 入一定量标准溶液进行测定，以C-myc浓度为横坐标，荧光猝灭强度AF为纵坐标，绘制测 定C-myc样品浓度的标准曲线(见图3和4)。实施例2在ImL 的比色皿中，配制 Au-C-myc-PBS 混合液(C。_my。= 437. 5pmol/L，CAu = 128pmol/L, ΦΑι1 = 21nm)，设置扫描范围300-500nm，在4°C条件下，固定激发波长，每5分钟 测一次荧光发射强度，测定30分钟，结果表明在设置的实验条件下获得的荧光强度的相对 标准偏差为0. 38%，说明本方法测定的稳定性好。实施例3在ImL 的比色皿中，配制 Au-C-myc-PBS 混合液(ΦΑι1 = 32nm, CAu = 256pmol/L)， 设置扫描范围300-500nm，固定激发波长，重复测定两种不同浓度的C-myc样品(87. 5pmol/ L和437. 5pmol/L)的荧光强度12次(间隔为2分钟)，结果表明在设置的实验条件下的相 对标准偏差只有0. 50%和0. 87%，说明该方法有着良好的重现性，确保了所测实验数据的 准确性。实施例4
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在ImL 的比色皿中，配制 Au-C-myc-PBS 混合液(ΦΑι1 = 12nm，CAu = 256pmol/L)， 设置扫描范围300-500nm，固定激发波长。在已知浓度为87. 5pmol/LC-myc溶液中加入已 知量的C-myc标准溶液，然后测得待测样品的荧光强度，计算AF，对照工作曲线找出浓度， 比较测得的加入量和实际加入量，所得回收率在94. 29% -107. 14%范围，平均回收率为 100. 19%，说明本发明方法具有实用性。实施例5在ImL的比色皿中，加入10 μ L金溶胶(12nm，256pmol/L)，用PBS缓冲液作溶剂， 配制含355pmol/L C-myc的溶液，测定其荧光光谱图。由图可计算出C-myc的荧光猝灭强度 Δ F为523. 56，对照C_myc的工作曲线找出355pmol/LC-myc的荧光猝灭强度Δ F为522. 80， 两者吻合，说明此方法有较好的可行性。实施例6肝癌组织中c-myc蛋白含量的测定。取0. Ig组织标本，在4°C的环境下，用预冷的PBS冲洗干净除去组织异物。用剪刀 剪成0. 5mm3小块并加入配置好的ImL裂解液，再用PBS稀释备用。在ImL的比色皿中，加入10 μ L金溶胶(12nm，256pmol/L)，用PBS作溶剂，制得 Au-样品-PBS混合液，设置扫描范围300-500nm，在一定的激发波长下测定其荧光光谱图得 到AF，对照C-myc的工作曲线找出其相对应的C-myc蛋白浓度值。检测结果表明致癌基因 C-myc高表达，优于ELISA的检测结果，说明该方法能对癌变组织中的Ciyc蛋白含量进行 准确测定，具有通用性。
权利要求
一种快速测定致癌基因C myc蛋白含量的方法，其特征是C myc蛋白本身具有荧光性并且与金纳米溶胶结合后发生荧光猝灭现象，该荧光猝灭强度(ΔF)与C myc蛋白浓度变化之间呈线性对应关系，达到测定C myc蛋白含量的目的。
2.根据权利要求1所述，其特征在于C-myc蛋白本身具有荧光性，且与金纳米溶胶结合 后发生荧光猝灭现象，其荧光激发波长范围为250-350nm，发射波长范围为400-550nm。
3.根据权利要求1所述，其特征在于所使用的金溶胶纳米颗粒作为C-myc蛋白的荧光 淬灭剂，其最佳粒径范围为5-50nm，其最佳浓度范围为10-600pmol/L。
4.根据权利要求1所述，其特征在于荧光猝灭强度(AF)与C-myc蛋白浓度变化之间 呈对应关系，C-myc蛋白浓度的检测范围为0 lOOOpmol/L，线性范围为87. 5-875pmol/L 和 0. 175-17. 5pmol/L，检出下限为 0. 01 0. 08pmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种致癌基因C-myc蛋白的荧光光谱测定方法，其测定依据是C-myc蛋白本身具有荧光性并且与金纳米溶胶结合后发生荧光猝灭现象，该荧光猝灭强度(ΔF)与C-myc蛋白浓度变化之间呈线性对应关系，达到测定C-myc蛋白含量的目的。应用本发明对C-myc蛋白样品进行准确测定，其回收率为94.29～107.14％，可检测的C-myc蛋白浓度范围为0～1000pmol/L，线性范围为87.5～875pmol/L和0.175～17.5pmol/L，检出下限为0.01～0.08pmol/L。本发明所述的测定方法具有操作简便、线性范围宽、灵敏度高、检出限低、稳定性和重现性好等优点。
文档编号G01N33/53GK101893573SQ20101022658
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者吕品, 戴云林, 曹忠, 王明星, 谭淑珍, 马贵福, 龙姝 申请人:长沙理工大学