专利名称：：心脏肌钙蛋白作为晚期冠状动脉疾病及其并发症的指示物的制作方法心鹏顿白作为,冠状动脉,及其并雜的^^狱领域本发明涉及一种诊断對^traWL性冠德的病理扰态的施，雌涉及冠餘管病，特别是多血管病。駄飽括测定對錄的样品中心Ml钙蛋白的量和舰比^^测定的量与参^S^诊断所述冠'il铜的步骤，^i^冠她管病，牛邦提多血管病。本发明也包含^^方法的设备和试齐嗆。背景狱现代医学的目标之一就JiiK於人化的^t个性化的治疗方案。夷陛治肪案考虑到患者的个人需要舰险。一彿别大的风险是心血管并離尤其絲识别的心血管并发症的存在，棘敏些心血管并发症的流行。在西半球，心血管并雜，尤其L、鹏，^^斜口死亡率的駐要的原因。心血管并離能在长时间内保瓶症状。因此，孙o血管并雜的^ia行可靠的鉴别诊断i:爐常认为的要更困难和容易出错。糊哋，患有急性心血管割牛(例如，心I/1SSMI)的症糊如脚痛的患者，目鹏受的是以肌钙蛋白T为翻出的诊断。为此，要测定患者肌钩蛋白T的7K平。如ML液中肌钙蛋白T的S5i"高，即高于0.1n^nl，贝ij认定是心血管新牛和对患者进行相应的治疗。MI被分类为属于冠'IL祸(CHD)，雜于其它也被分默属于CHD的謝牛如不稳定型心绞痛(UAP)之后。UAP的症状是育辦M31硝化甘油的舌下用药减轻的胸痛。UAP是由引皿W^足和心肌缺血的冠，管的局部闭塞导致的。一旦这种闭塞过于严重或者踐面性的，就^^ti、mwE(其为心mra的潜在病理拔态)。MI可以在没有明显症状的情况下发生，Wt是说，彭錄不^J见任何不适，同时MI之前没有稳定型跡稳趟心魏。然而，UAP是MI之前的有症状的事件。受试者的CHD也可能无症状的发生，就是该對緒可能没有感至怀适和彭见出樹可CHD征兆，诸如呼吸短促、胸痛赫其它本领fe:)^术人员己知的CHD的征兆。可是，^i^也许魏态的，患有可以导致MI禾0/^5lfir性心力衰竭(CHF)的冠舰管的障碍，意即心脏不再具备为了确舰^t身体血液的必Wli^f敲运行的能力。这也i倍导,重的并发症，一舊仔就是心跳停止。A^周知，属于风险组(例如，吸烟者种赚尿病患者)的^#比没有穀讽险因素影响的，者(健康的對式者)更容易患CHD或CHF。通常，无症^^式的CHD/CHF发生，导致M^被i朋,病理扰态。CHD，的il^是Framingham得分赫PROCAM得分o迄今为止，冠她管的病理餅一^131冠M管i^术(侵A^的gSm实际的(virtua1))来im,其价格昂贵而且需要精细和费时的程序。通常不会对不是高度被怀疑患有冠，管并发症的受i^a行冠她t^术。
发明内容本发明的目的^l^一种新盼测试以测定^mifiL性冠'L病，^ii涉及冠状血管病，f賴'堤多血管病。该测试易行，不需要昂贵的设备/仪器，并且雌的，不属于心血管病令页域专家的知识。具体实M式本发明M:—种诊断,Wl性冠'L病的方^^决该问题，包棘骤a)观啶^t的样品中心Ml钙蛋白的量；b)舰比鄉骤a)所测定的量与#%^诊|^。雌的，繊'L病涉及冠她管病，特别是多血管病。特别地，晚期性冠'1:祸是无症状的。本发明的方法，雌的，是一种体外的方法。而且，它还可以包括除了另陛上文明确駄的步默外的步骤。例如，进1的步駒以涉及样品的予Ma或诊断娜的刑介。这MM用的术语"诊断"撒ff古与對储患有晚^iflL性冠ll病^招可其它本说明书中所駄的鄉相符的可能性。如本领^人员所能働的，这样的一种iff古对對会断的受i^ii常并不是100%的正确。然而，该术语要^5计学JiM著部分的受i錄肖滩被诊断出(例如，群组研究中的一群)患有心力衰竭或有将来患Jilth病的风险。本领域的技术人员M31^ffl各种^^f周知的统itM古工具，例如置信区间测定，p值Rvalue)测定，斯氏t检验，Mara^Whitoey检,，不用再费周折就能确定一部分是否是统计学上显著的。详细描述见Dowdy和Wearden,StatisticsforResearch,John條y&Sons,纟鹏，1983。雌的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。优选的p值是O.l、0.05、0.01、0.005或0.0001。根据本发明的诊断包括对相，病、症皿风险的ffi、确定、亚分类和预测。i^^涉及彌一种B^被i纖的赚或并雜，例如，分析^的鹏或者一浦定的治,i^^或并線的舰的影响。确定涉及巩固或证实一种已经使用其^^j鄉^a行的诊断。亚分^^及根据已被诊断的自的不同的亚分^6ai规定一种鄉，例如，根据赫的轻^重状^见定。在目前的情况下，^^涉及到区分单血管病和多血管病。预观微及在其它症^1MI射己B^变得明显或S^拨^M著的刻te前预测出赚鄉雜。稱哋，本发明涉M^、确定和亚分类。如上面戶腐，CHD可以无症微生，棘有关的對緒可會^JJ^状。本发明有助于观啶患有CHD的无症状對緒。^w常属于风i^a诸如吸鹏，糖尿病患者，月鹏患者，患有高血脂的^t,患有动脉高血压的^i储，有冠'L祸、心W!S或中M^族史的^^，患有伴随升高频率的冠A祸的基础性疾病如^TO性关节炎的人。imtfe，^#患有由冠舰管病弓胞的CHD。特别地，管病是多血管病，也就是由心血管的局部闭塞弓胞的，例如由斑块^IR,血栓症禾ft^^引起。局部的血管闭塞导致可以弓胞有或没有症状的进"^并发症的心肌Wl。冠舰管对本领域的駄人员来说是已知的。在本发明的上下文中，术语"冠餘管"包括(三个)大的冠管，另外也包括相连的中等大小的血管和小血管。因此，在本发明的上下文中，冠她管病可以，例如，以影响大的冠舰管的大血管病变的形微生，但是也能以齢她管和ML管病变的形^:生。一旦发生全面的心血管闭塞，导致的病理状态是被定义为作为心肌,(mi)的基石ti^态的心W^。在本领域中描述了M:测定数錄條中的心脏肌钙蛋白T(下文中的TnT)^il钙蛋白I(Tnl)的S^诊断MI。如果该断高，则喊走出现了ML诊断MI(同样是一种冠'll祸)的方法不是本发明的一部分。在本发明的上下文中，术语"冠《祸"CHD^^樹可由冠状动脉粥樹更化，即冠舰管的部分或全面闭塞弓胞的冠状功能薪L(病理状态)。术语CHD包括大范围的不同的急性的和慢性的病理状态，包含稳定型和不稳定型心绞痛(分别为SAP和UAP)，左心室功育繊L(LVD)，(性)心力衰竭(CHF)，心肌死亡。更一般的，在本发明的上下文中，就语涉及心肌供血不足和因此导致的每一禾幗理拔态。通常，SAP，UAP和MI被认为是一种急性的病理狀态或急'醜，而LVD和CHF被认为是一种慢性的枕态或慢性病。本发明悠适合于测定没有症状的CHD。因此，并非无症状的SAP和UAP由于彭见出棘的症状例如胸痛，通常不禾佣本发明的教导来诊断。MI的诊断同样不是本发明的目的。本发明适舒诊断导^C病理^lt态如LVD禾IV或CHF的慢性心血管病。在本发明的上下文中"^S状"^^i^不表现樹可CHD的明显的症状。"明显的症状"翻陛本领域的ifc^人员(医师)公认的对于各自的病理拔态(这里指CHD或一个CHD的子群)来说尉争有的症状。在本发明的上下文中，一个无症状的患者不表现出身,动的限制，普通的身体活动不会导致不适当的疲劳，心悸呼吸困难(呼吸短促)，恶心，呕吐，或焦虑。当然，^i储不表I腺胸痛一样严重的症状。术语"明显的症状"不包括那些在深入的和/，向的医，查例如血管造影^ECC之后发现的症状，^本领域的i^人员来说是清楚的。必须记住的是，如果医雜SiMff寻足够认真的话(以一幹深入的方^t行)，#~种病理状态导致的症鄉常是能被i朋啲。冠A病CHD可以导致急性心血管割牛，即突然出现的、也就是没有之前的临床征兆離状的事件，该事件严重的影响心脏舒贼收縮的血繊度。在组织病理学ijU:，这l^f舰的急性心血管割牛由鄉的心鹏胞缺血荆半有严重的戶;M细胞的坏死所导致。通常，患有急性心血管事件的^it也^^受典型的症状例如胸的、腹上部的、手臂的、手腕的或#^页的不适或疼痛，进而胸痛可以辐射到、背鹏。急性心血管薪牛魏一步的症状可能是莫名的恶心或呕吐，辦卖的呼吸短促、虚弱、眩晕、头昏或昏厥以及招可它们的组合。通常，急性心血管糊皮称为急性冠^^症(ACS),鹏尤是，不稳趣心魏(UAP鹏心(M)。在许多情况下，急性心血管事件就是MI，其包括ST-升高的MI和非ST-升高的MI。财卜，心血管*#也包括中风。症状和繊的病征例如心电图病征在定义方面的进一步详细描述见JointEuropeanSocietyofCardiology/AmericanSocietyofCardiology,2000，JAmericancollegeofCardiology,Vol,36，No.3:959-969。在本发明的上下文中，有^#没^敏急性心血管割4#段或LVD状恭冠'。祸通常都导致心力衰竭，其被分舰几个鄉U。症状可以根据纟逖勺心脏协会(NewYorkHeartAssociation)分^^t行分类。的患者没有明显的心血管病的症状。身^^不受限制，日常的身W^不会导致不适当的疲劳,心悸或呼吸困难(呼吸短促)。鄉ijn的患者穀鹏微的身W^]限制。他1l、旌休息时是舰的，但是日常的身WS^导驗劳，心悸或,及困难。類ijm的患者彭见出显著的身W^柳艮制。他们在休息时是髓的，但劐氏于日常禾雖的糊也会导M劳，心悸或聊及困难。数ijr/的患者ffit行ttfsr身^^时船感到不适。他w旌休息中熟见出心脏功能不足的症状。如ma行樹可的身^^,不适齢增加。因此，患者肖辦被分跡表现臓症状的^t禾明p些彭鹏状的，者(例如，呼吸困难)。在本发明的一^H^的具体实M^式中，除了心JWl转蛋白，特别是TnT之外，还测定了禾i糊月太的量，iMi^自由ANP，NT-proANP,BNP和NT-proBNP舰的组，雌的是BNP和NT-proBNP，微是NT-proBNP,^f;Mi太的变体。禾糊肽，尤其是NT-proBNP，已知为戶刑胃的神经#^牛祝，指示与例如心力衰竭、心肌WL柳或i:、IW^有关的心Ri:的ffi力。在本发明的上下文中，辦糊肽或它6^性物，鄉是NT-proBNP的量的测定，使得可以获得关WfiL性冠'll祸魏離的客砂Ht息，特别是在^#个体的多血管病即将发生时。这M^HOT的术语涉及,，，哺乳，，更iM的是人。然而，必须注意的是，在本发明中，^t雌的不彭见己知与CHD或急性心血管^#即胸痛、呼吸困难和其它上面所描述的那些相联系的症状。更^&,對式者不彭见出依照NYHA分类n，m或iv的症状。在本发明的一^H^具体实施方式中，愁储是NYHA分类I^i^"。^M本发明测定禾糊,。、WL钙蛋白的量涉及测^S^^度，，半^fi離量测定。观啶育辦直接或间擞1^行。直接测定涉及在获自禾糊肽或L、鹏钶蛋白本身且强度与样品中存在的所述肽的^fftE接相关的一种信号的基础上，测定禾糊肽或。、iei钙蛋白的量^^度。这样的信号，有时腿称为弓破信号，可以例如ilii测定禾嗍肽或il、rai钙蛋白的一禾种寺定的物理或化学顿的强度值获得。间接盼测定包括测定一种信号，它来自于第二组分(也就是一种非利钠肽本身的组分)或生物学可读系统，雜号如可测量的细胞鹏、配体、l斜己或酶鹏，。^m本发明，测定禾糊肽或ll、OTi钙蛋白的量可以iia^有用于测定样品中肽的量的已知工具(means)获得。戶舰的工具包括免疫测^g和可以慰疏的^用于不同的夹心式、竞争鄉它分析模式的方法。戶舰的分析将形成一种信号，^^糊肽或1>1钙蛋白的#^^缺乏。而且，信号的弓破，雌的，与样品中雜的所述多肽的Mi:^M间舰(例如反比例)相关。魏合航法包括测定禾嗍肽,理或化辦性，例如它M的肝量或NMR光谱。戶顾的方^tfc^&包括生劍专麟，与免疫测錢结的光学设备，生物芯片，质i敝、NMR-分析iM色谱仪^^，备。，1，方'^括以ELISA为基础的方法，全自动的淑職人的免疫测定(例如可用Elecsys^分析仪)，CBA(—种,钴结^验(CobaltBindingAssay),例如可用Roche"Hitachi"^分析仪)，和乳膨麟i微(例如可用Roche^Hitach^分析仪)。用于测定的方法和工具还包括即啦验(Point《f督e)设糊如Cardiac-Reader(可从RocheDiagnostics得到)。即01^验设备通常被,为肖辦在患者的床旁进疔测定的设备。一*仔就是Cardiac-Reader1^(可从RocheDiagnostics得到)，与例如测定NT-proBNP的测i式条(可作为"CardiacproBNP"从RocheDiagnostics得到)相结合。这样的测试可以采用J^/f感兴趣的肽(例如一种BNP鄉的肽)的两种(雌单克隆的)抗体。这離体可以与用于例如Elecsys^或Coba^分析的抗体是相同的，例如，第一抗体用生物素新己而第二抗体用^T立子^iS。该测试可以M;将少量(例如150"l)的血液样品加入到测试条(例如测试条中的样品孑L)上开始。在加入到观赋条之前^t后，例如，如果样品^1誠的稳(fleece)时(例如鹏纤维秘)，样品中的会她球就可以与乘ij余的血浆分离。戶刑兑的分离工具(例如秘)雌是测试条的一部分。抗体(雌是B^雜于观i賦条上)溶解于乘除的血浆中。抗体能与感兴趣的肽或多肽相结合，形成一种H^分的夹心^^^J。抗体(结合的駄结合的)縱5测试条iiAJ啦测区。该检测区包括用于检测已结合的复糊的工具，例如它可以^^亲和素。它固定住复溯并将固定的复合31^疏的抗体以雜的带显现出来。tt^，剩余盼游离的金*琉的抗体然后l蠻歸泖賦条移动，至包含含有要检测的BNPMtt的表位的合成的肽或多肽的区域娜获，以一^Pi的雜的带显现出来。这种第二絲的出现育辦作为对照，因为^t^了样品是按正确操作流动以及抗体是就无损的。观赋条可以包含标记，以矛^附/i^趣的肽或多肽育滩用该澳赋条进行检测。它也可以包含条,^它可以M:设^^阅读的编码，该设备用于光学测量检测区中可检测至啲*祐的量。这样的条鹏可以包括I^P中麟趣的肽或多肽肖辦用该测试条进行检测的信息。该条形码也可以包括关于测试条的批次特异(lot-specific)的信息c本发明中所4顿的泖JW于检测心Wl钙蛋白，糊iJ^/l锌蛋白T称舰铐蛋白I，有很高的灵敏性。各测试可以招隨恕勺0.001n^ml或甚至更低的浓度下^i接ij肌钙蛋白T。肖辦在99ro^更高的帮JS^割牛下检测到:^勺0.01ngtol的浓度。相应的ilCT于其它的心Wl钙蛋白如肌钙蛋白I，^!^本领域的駄人员是己知的，或可>!^中公开的数值推导出。高灵敏性的测试建立在与之前的分析使用基本相同的试剂和成分的基础上。灵敏Mil^/L何割特n/^a育时间B^得至腿高。CardiaoReader本身包含育滩就学上iS^:测试条上的检测区的照相机(例如电荷耦合器件，CCD)。信号带和对照带可以Mil—个模式i朋隨算法则来鉴别。信号带中t琉的3艘典型与麟趣的肽或多肽的誠比例。光学信号可以通逝比次特异的标度曲线转化为浓度，它可以被储存于一个綱芯片中。标度码禾口观iJi对比次的一致可以Sii测Ji式条上的条形^^检查。在一^^的具体实式中，测定利钠肽或。、TOl钙蛋白的量的方、B括步骤a)将肖滩弓胞M^于JI^肽的量的细teiS的细胞与miS行足够长时间的撤虫，b)检测细胞g。为了检测细胞鹏，样品^bSil的样品，imte，加AS蜘胞線基中和检测内在的漱卜在的细胞鹏。细胞腿可以包括报告基因的可检测的^i^物质的分泌，例如肽，多肽，或小肝。i^ii^物质会产生一种与肽的量相关的鹏信号。在另"HM^的具体实驗式中，测定禾1>^/1钙蛋白的量的方跑括测量可获自样品中禾糊,OWl钙蛋白的特定弓MS信号的步骤。如上面戶脱，这样的信号可以是顿谱中观测到的驗于禾糊鹏L、WI钙蛋白的m/z，^异于禾糊，ll、Ml钙蛋白的NMR光谱J^，到的信号强度。在另一^H^的具鹏駄式中，测定利钠腿的方飽括如下步骤(a)将肽与特定的配W^，(b)移絲结合的配体，(c)测定结合的配体的量。结合的配鹏产生一种^s信号。依照本发明的结^m括共价的糊哄价的结合。依照本发明的配体可以是与^S^述的利钠,。、Ml铐蛋白相结合的任意的化激，例如肽、多肽、核酸或小舒。雌的配体包括抗体、核酸、肽或多肽，例如禾嗍肽的受体或n、wm蛋白的结合配偶体和它们的片段，包括肽的结合结构域，和适体，例如核酸^的适体。准备^配体的方法是本领域公知的。例如，維的抗体鹏体的鉴定和生产也可以由商业化的伊J^麟。获得具有更高亲和力或特异性的^配体的衍生物的方法^领域的s^人员所熟知的。仔咖，在核酸、肽或多肽中引入随机突变。然后，iM^J生物可以Mitt领域己知的筛M^i例如Hlf体际来检测结合。^M^f駄的抗体包括多克隆和单克隆抗体，也包蛇们的片段，例如肖^结合抗原或W^的Fv，Fab和F(ab》片段。本发明也包括人源條合抗体，其中彭见出所需抗原特异性的非人供佩体的雜,列与人受舰体的竊,列结合。1^#序列通常至少^括微的抗原结^S^S，但是也可以皿供皿体的其它，上柳^J力肯让相关的錢^S。这样的齢体可以iiM;Lf巾本领域已知的方法伟恪。^，所述配体或试剂与利钠J^异结合。依照本发明的,结^^配体或i叙ij不会与用于分析的样品中雜的其它肽、多肽繊质实质上结合("^XaS")。it，特异结合禾糊肽的结^*合,当是与{，其它有关的肽或多肽的结^*和性的至少3倍，更i^S少10倍和甚至更^S少50倍。—辨异结合在如果它臓肖嫩区别和明确地测定时是可以接受的，例如，根据蛋白质印祉它的尺寸舰过它在样品中相对高的丰度。与配体的结合肖滩M樹可本领域已知的方法测定。1Mi也，所H兑的方法是半^1:^量的。适合的方法在下文中描述。首先，与配体的结合可以直接测定，例如，舰NMR戯面等离子体i1^0其次，如果配体也作为感兴趣的肽或多肽的酶活性的底物，酶^&i3^tl可以被检测(例如，蛋白酶的量可以M测定所纖的繊的fi^检测，例如，用蛋白质印迹)。可i^J也，配体本身可以彭的特性，配依禾糊肽或配術心Wl药蛋白复合物或与利钠肽或心Wl钙蛋白结合的配体分别可以与适合的底物接触，从而允许M^生^^信号来测定。要测定酶反应的产物，^^物的量是t船啲。麟也可以在^t辦皮可探测的l^l6S衍斜己。样品与底^Mia行一a^够的时间。一a^够的时间指产生可检测到(detectable)的、雌可湖懂(measurable)的^ft^f必需的时间。代替测l7^的量，指定(例如可检测到的)i^^出5I^必需的时间可以被测量。第三，配体可以共价或非共if^合育滩允许检屑胖顿懂配体的l祝。丰祝方法可以采用直接或间接的方式。直接^iB包括丰^i5M接(共价或非共价池)与配体结合。间接^ia包括二级配,第一配体结合(共价或非Mrtk)。配体应当特异地与第一配体结合。所说的二级配体可以结^i当的^ia禾n/^^结合二级配体的，配体的耙(受体)。通常^OT1，，或甚至更髙级的配体是为了增力瞻号。适合的二级和更高级的配体可以包括抗体、二级抗銜卩已知,霉亲和素-生髓系统(VectorLaboratories,Inc.)。配体^tl也可以用一个或多个本领域已知的丰礎"标只"。这样的t礎然后可以戯更高级配体的耙。适合的t蔬包括生物素，digoxygenin，组氨謝蔬(His-Tag),谷胱甘肽-S-鄉酶，FLAG，GFP，myc4礎，流行性感冒八病毒血(HA)，麦结合蛋白，。如果劍太或多肽，^f^位于N鄉种或C綠适合的硫M31—种适合的检测方法肖滩检测到的招可丰祝。典型的^iS包括^^立子，学服小珠，acridan酯，鲁糊，钌，酶活性丰琉，Mf活性丰祝，磁性^ig("例如，磁性軒"，包括顺磁性的和趟顿磁性的1^i5)和荧光^IS。酶活性^i己包括例如辣1t3l氧化物酶，减性磷,，e-半学,酶，荧光素麟口它们的衍生物。用于检测的适合的麟包括2-胺(DAB),3,3'-5，5'-N-四甲i^胺，NBT-BCIP(O肖基兰四唑锒氯化物和5-漠斗氯-3』引,磷酸，RocheDiagnostics有现成的Cr液)，CDP-Star(AmershamBiosciences),EOF(AmershamBiosciences)。适合的膝/^1的结合可以产生有色的鹏,、荧^^化学发光，这育^13tt领域己知的方法测量(例如，4顿感赚片鹏合的照相系统)。至于测定酶鹏，上面给出的标准同样适用。典型的荧光丰射己包括荧光蛋白(例如GFP和它的衍生物)，Cy3，Cy5，德克萨斯红(TexasRed)，荧光素(Fluorescein)和Alexa染料(例如Alexa568)。，一步的可用荧光+斜己是例如，来自MolcularProbes(Oregon)。预期量子点(quantumdote)也能作为荧光丰祝。典型的^]#1己包括355，125I，^，"P磐。MJ1斜己可以Mil樹可已知的和适合的方、;fe^检测，例如，感赚片或微图像仪。傲照本发明的适合盼测定方馳包括沉淀鹏(尤其是免疫沉淀鹏)，电化学发光(由妒生的化学发光)，RIA(娜性免疫测定)，ELISA(麟免疫吸附测定)，夹心式酶免疫检测，电化学发光夹心錄疫测定(ECLIA)，解离駄镧系荧光免疫分析(DELF1A)，闪烁雜测定法(SPA),1鹏，,辉法,孚服增^W比浊法或tm^测離，或固相免疫测定。魏"^的本领域已知的方法(例姊赚电泳，2D7嫩电泳，SDS聚丙烯St)^繊电泳(SDS-PAGE)，蛋白质印迹法和质谱分析法)，育辦制射顿赫与其它上面戶做的丰^测定方法齢舰。在另一^1^的具体实式中，测定心Wl妈蛋白鄉糊肽的量的方飽括(a)将含有如前面戶脱的禾糊肽或l^、OTl钙蛋白配体的固相支繊与含有禾嗍肽或L、MW5蛋白的样品織虫和(b)观啶与支繊结合的禾糊肽或ll、Wl钙蛋白的量。配体雌由核酸、肽、多肽、抗懒卩适体舰的组中麟，雌以固定的形式雜于固相支繊上。制造固相支鄉的原材料絲领域已知的，包括，尤其是，商处可得到的柱子材料，棘乙烯珠，孚服小珠，磁性軒，胶体的金属粒子，鹏柳或硅的片和表面，硝4掛维素条，膜，薄片，duracytes，鹏盘的孑WB壁，塑料靜。配体或i微呵以与许多不同的载体结合。已知载体的例子包括鹏，驟乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚碳鹏，右旋蹄，尼龙，直繊定粉，天然的和改性的纤维素，聚丙烯,，劇識和磁石。用于本发明目的载体的'HM可以是可溶的也可以是不溶的。适合的固定(fix/immobilize)戶;M配体的方法是已知的，包括但不限于离子的、疏冰的、共价的作用等。预期也可以用"悬浮阵列"作为根据本发明的阵列(NolanJP,SklarlA(2002).，Suspensionanaytechnolo^:evolutionof(he迈at-aiTayparadigm,TrendsBiotechnol，20(1):9-12)。在这样的悬浮阵列中，载体，例如微^T微球体，雜:浮液中。阵列由可能被硫己的携带不同配体的不同的微^r微球体纟賊。±^这些阵列的方法，例如基于固相化学和光不稳定i^户基团的方法，^#遍已知的(US5744305)。这M^f用的术语"量"包舒糊肽或。Wl钙蛋白的纟树量，禾糊肽或。、脏肌钙蛋白的相对量或浓度，也包括樹可与它们相关的iS^参数。3MH1，数包括采取直接观啶法得到的来自所述的肽的所有特定的物理或化学性质的强度信号，例如质谱或NMR光谱中的^jt值。#卜，包含S5tt说明书其它地方描述的间接测定^M寻到所有值或参数，例如，由生物学读数系统中测定得到的响应戶;Mtt的^i7K平^A特异结合配,得的^S信号。应当,与前述的量或参数相关的值也可以通31^有标准的数学运算得到。术语"心Wl钙蛋白"涉i^f有在心BM船P^先心内膜下细胞中^i的肌钙蛋白同种型。这些同种型的特征在本领域被很好鹏述，如在例如，Anderson1995,QrciMonResearch,Vol.76,No.4:681486禾卩Fenieres1998，ClinicalChemistry,44:487493。，的，心Ml钙蛋白指肌锌蛋白T禾fV^il钙蛋白I。在本发明的上下文中，肌钙蛋白T通常要ita/M蛋白i雌。然而，本领域的技术人员明白在许多或大多数的瞎况下，来自测定肌钙蛋白I的量的信息与来自测^ui药蛋白ie^t息同贿价值，因为两种肽都来自于心脏的肌肉细胞，即心肌，并ips相同執牛(细胞的损伤)的情况下被释放。因此，两种肌钙蛋白可以用本发明的方法一起测定，即同时鹏相继地测定，或分别地测定，也就是根^r,定其它的同种型。Ml钙蛋白T的魏,列和AM钙蛋白I的竊,列公肝Ancteon，引文和Fenieres1998，ClinicalChemisUy，44:487493。术语"心Ml转蛋白"也包含前述的特^/l转蛋白的变体，艮Ptti^/l钙蛋白T禾口肌钙蛋白I的变体。鹏变体至少与特定的肌药蛋白具有相同的絲生物学和免疫学腿。特别地，如果它们4顿本说明书中所舰的相同的特异的测定育嫩被检测到，那么它们具有相同的基本生物学和免疫学的'M，例如，a^顿特异识别戶满心Wl药蛋白的多克隆或单克隆抗体进行ELISA测定。！t^卜，应当SfH^m本发明的变,有的^^歹陏因至A"个M^酸的取代，缺失柳或添加的不同，其中，变体的氨基酸序列仍然，与所述特定的肌钙蛋白的MS酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%同一性。变体可以是等位基因变体或招可其它物种特异性同系物(homolog)、横向同源物(paralog)或直向同源物(orfholog)。财卜，这里所皿的变体包赚定的心WL转蛋白的片段^ftr述鄉的变体的片段，只要这些片段具有上;5^的鉢免疫学和生物学的tW。这些片段可以是，例如，肌钙蛋白的，。进1包括那些由于转译后傲布例如磷酸4t^十四^^七而不同的变体。术语"禾糊肽"包括心房禾糊肽(層)-型和脑禾糊肽(BNP)-型的肽和它们的具有相同的予鹏力的变体。臓本发明的禾糊肽包括ANP-型和BNP-型肽和它们的变体(参见例如Bonow，R.O.，1996，Newinsistsintothecardiacnatriureticpeptides,Circulation93:1946~1950)。ANP-鹏包括pre"proANP，proANP,NT-proANP禾卩ANP。BNP-鹏鄉pi^proBNP,proBNP，NT-proBNP禾卩BNP。前肽原(pre"propeptide)(当为preiJroBNP时有134个^S^)包括一,的信号肽，微酶切后释放出前体肽(propeptide)(当为proBNP时有108个錢酸)。前体肽!鹏"^剪切成N-鄉前体肽(N^pro肽，当为NT-proBNP时有76个mS酸)和活性皿(当为BNP时有32个MS酸，当为ANP时有28个^S酸)。雌的根据本发明的禾i糊肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP禾口它们的变体。層和BNP是有活性的麟并且比它们各自的无活性的相应物NT-proANP和NT-proBNP具有更短的半衰期。BNPtt液中发生fW，而NT^proBNP作为完整的^f在血中进份盾环并原^W肾清除。NT-proBNP的体内半衰期比BNP的半衰期长120併中，BNP的半衰期是20併中(SmithMW，EspinerEA，YandleTG，CharlesCJ，RichardsAM，Delayedmetabolismofhumanbrainnatriureticpeptidereflectsresistancetoneutralendopeptidase，JEhdocrinol,2000，167:239~46)。用NT-proBNP的前分,(preanalytics)更为强健，使得育辦容易:tfe^样品运输到中心实5^(MuellerT，GegenhuberA，DieplingerB，PoelzW,HaltaayerM,Long-termstabilityofendogenousB-typenatriureticpeptide(BNP)andaminotemiinalproBNP(NT-proBNP)infrozenplasmasamples,ClinCh加LabMed2004，42:942-4)。血样能在室温储存好几^t可以被邮寄^t不誠回收损失。相反的，BNP^^^氏4度下储存48小时会导,少20%的浓度损失(MuellerT,GegenhuberA，etal.，ClinicalChemLabMed2004,42:9424，supra;WuAH，PackerM，SmithA，BijouR，FinkD，MairJ，WallentinL,JohnstonN，.FeldcampCS，HaverstickDM,AhnadiCE，GrantA，DespresN,BluesteinB,GhaniF，Analyticalassayinpatientswithheartfeihire:amultisitestu<^，ClinChem2004,50:867-73》。因此，根据所感兴趣的时间3iH^'M，测定活性形舒口无活性形式的禾糊肽中的l个都是有利的。根据本发明的最,的利钠肽是NT-proBNP或它的变体。与上面简要讨论的一样，本发明所舰的人NTi3roBNP是一段多肽，包含雌相应于人NT-proBNP^^N^部分的76个Mg^i度。人BNP和NT-proBNP的结构在已有技术中己经被描述得很详细，例如WO02/089657，WO02/083913和Bonow1996，NewInsi^itsintothecardiacnatriureticpeptides,Circulation93:1946~1950。优选他，这里4顿的人NT-proBNP是在EP0648228Bl中所公开的人NT-proBNP。这些已有技术文献中公开的关于NT-proBNP的特^列及其变,3ffl都一并引入作为参考。按照本发明的NT-proBNP进"^包含上文讨论的人NT-proBNP0^寺^j^列的難基因和其它的变体4賴哋，卿变体多肽在ES酚K平上与人NT-proBNP有至少60。/。的同一性，更iMM少70。/。、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%#少99%的同一性。i/^旨felil诊断工具^lil针对^^肽的配体来i賜'J的蛋白7K解^T^是实质上梱以的并且也被予鹏内。与人NT，oBNP的魏,列相比鹏有ES,失、取f^V或添加的变体多肽也包含在内，只要戶脱多肽具有NT-praBNP的性质。这S^提及的NT-proBNP的TO旨免疫学的柳或生物学的'(4M。优逸的，NT-proBNP变#^有与NT-proBNP可比的免疫学性质(即t)^C^决定簇M;)。因此，变体对前述的用于测定禾嗍腿的工具或配体是可i咽iJ的。生物学柳或免疫学的NT-proBNP'M育嫩舰以下;5^a述的测定方^a行检测，Karletal.(Kari1999，DevelopmentofanovelsN-Teraiinal-proBNP(NT-proBNP)assaywithalowdetectionlimit,ScandJClinInvest59:177-181),Yeoetal.(Yeo2003,MulticenterevaluationoftheRocheNT-proBNPassayandcomparisontotheBiositeTriageassay,ClinicalChimicaActa338:107-115)，和下述实施例l中戶服的。变体也包括掛畢后飾的肽例如糖靴的肽。恢照本发明的变体也指在样品釆^B^被銜M的肽或多肽，例如aa将标己共价或非判/rt^到肽，^^謝性戯光^iB与lt^。术语"样品"涉及#^样品，涉及分离的细胞样品或涉及取自组织皿官的样品。^^样品f滩舰已矢啲^^得，雌包括血液、血浆、血清舰的样品。组织鄉官样品可以取自樹可组织鄉官，Mil例如，活组织切片检查。分离的细胞取自体^^且纟/口或器官，ilil分离财例如离心或细胞分选。优选地，细胞的、组织的繊官的样品取自那^i^生^M^述的肽(即利钠肽和心Wl转蛋白)的细胞、组织鄉官。这勤万用的"比较"包含^#^析的样品辨糊鹏1>1钙蛋白的量与说明书中任意地方描舰的魏的##源的量进行比较。可以離i^用的比较涉及相应的織或值的比较，例如，^tS与纟树^S相比较，而浓度与参考浓度相比较或来自测，品的强度信号与参考样品中同I^IM的^^信号相比较。本发明方法中步骤b)所涉及的比较可以AX或itm鹏助进行。对Ti十算机辅助比较，可以皿一^S十鋭/lfi^将测^的值与对应于存^^i^库中的适合的参考物的值相比较。计敦A^r以进"^iff介比较的结果，艮附一种适合的输出格式来自动^t、所需的诊断。这翻用的术语涉及兽辦mi面戶脱的比棘刑古—个^#是否患有晚血性心脏病或另一种在本说明书中所提及的^的量，^性心脏病雌是无症状的。因此，该##物可以要么来自属于上;^万描述的风险组的對^t，柳^少在^性心脏病方言的^#。对^#可用的参，可以^于不同的生理学的[而变化，例如年龄、性别，人群。因此，一顿合的#%4可以根据本发明的方法由分析的参考样品与领|凡辦品"^即同时il^g继地确定。大体上，fi^M本发明B^^R^^ifiL性心脏病的^M^呈中，心Wm蛋白的量如&fiL浆中的量将也会增加。而且，缺血性心脏病变得,重，血浆中禾糊肽的量^i高。因此，对^~^^的對錄，血浆中心wm蛋白禾畔嗍月爐的提高船麟至陏很高的患有急性心血管事件^M^鄉式的慢性心力衰竭的可能性。更^m，依照本发明已会拨现^^缺血性冠'11祸的心1转蛋白的##*为至少0.003n^ml，优选O.lng/ml，特别是0.5ng/ml。而且，前面所弓间的心脏肌钙蛋白的参賴与禾嗍肽的#组合也線了(即与更高的3SM可能性相联系),性冠'1>病，其中利钠肽的#%￡为至少150p^ml，,350p^ml，特别是500p^ml。上文和下文所作的术语的定义和解释因jJtiS用于本说明书中的所有具体实皿式以i^;f附的权利要求书。由上面戶;^f寻出在本发明方法的一liM的具体实敲式中，心wi钙蛋白的##*为至少0.003ng/ml，其^^与{顿所弓间的禾嗍肽的#%1^合用于指示晚期缺血性冠心病在一个优选的具体实施方式中，本发明允许区别单血管冠心病和多血管冠心病。在本发明的上下文中，术语"多血管冠心病"指一种比"单血管冠心病"更严重的血管闭塞。这里所用的术语"区别"标区分患有单血管冠心病的受试者和患有多血管冠心病的受试者。这里所用的术语"慢性心力衰竭"涉及慢性的、即持久的心力衰竭。心力衰竭的特征繊環的心脏舒张或心脏收缩血液流动速率和因此减弱的心脏功能。然而，不是表现出伴随着严重的心肌细胞坏死的突然的局部缺血，这里所涉及的慢性心力衰竭优选伴随着导致连续发展的心脏功能损伤的连续的心肌细胞坏死事件。有利地，本发明提供上述区别性诊崎性心血管執特B慢性心力衰竭的方法，从而允许可靠地和时间、费用均有效地区分戶腿的赫状况。因此，患有所述疾病的受试者能够通过特异的和有效的疗法被容易地治疗，而不是采用非特异的和无效的疗法。已经发现肌钙蛋白T的水平高但还没有症状的受试者将接受更深入的诊断，特别是导管血造影术，一种实际的(virtual)血管造影术，使用对比媒介同一个顿断层图相连以鉴别缩窄，所述缩窄可被展开，在情况可能时，可以借助气囊扩张或支架。通过这些，MI可以被避免，和心脏功能能被维持。已经发现肌钙蛋白t的水平高但没有症状的對錄也可以接受斷氏心肌内赴压力的治疗并因此陶拨生顿的可能性。本发明的方法特别优选的具体实施方式如下所述在一个本发明方法的优选的具体实駄式中，至少0.003ng/ml的心肌钙蛋白的参考量和至少150pg/ml的利钠肽的参考量指示了严重的晚期冠状动脉疾病。在一个更微的具体实駄式中，心肌钙蛋白的参考量和至少0.1ng/ml和利钠肽的参考量至少350pg/ml。在一个特别优选的具体实肺式中，心脏肌钙蛋白的参考量至少0.5ng/ml和利钠肽的参考量是至少500pg/ml。在一个本发明方法的优选的具体实施方式中，利钠肽是BNP,更优选是NT-proBNP。在一，~#，的本发明方法的具^式中，禾糊肽是ANP，更优选是NT-pro層。在一个魏"^雌的本发明方法的具体实式中，臓的心Wl钙蛋白;im钙蛋白T禾n/^Jl钙蛋白I。同样，在一1^选的本发明方袪的具体实式中，戶，的^t是人。本发明进"^涉及一种itiMWilfiL'ra'll病的设备，包括a)测定^t的样品中心Wl钙蛋白量的工具；b)^iitk，测定样品中禾嗍JW的工具；这S^f用的术语"设备"涉及许多工具M的系统，其至d^含前^彼Jifct间可操作it^以进t^页测的工具。雌的测定利钠鹏心Wl钙蛋白量的工具和进行比较的工:^J:文中本发明的方,分已经公开了。怎样以一种操作的方^m些工具连^^将取决于该设备中所包括的工具的种类。例如，当鹏了自动测定肽的量的工具，由所述自动运行的工具获得的就育辦舰例如计算,辨鹏，以诊輪性心血管執牛鹏它^1^舰的鄉。雌的，在这种情况下，该工具由单一的设备组成。所述的设备可以包括用于测定样品中肽的量的分析单飛,于鹏不同诊断结果的娜的it^几单元。可选择的，当例如测试条的工具l細于测定肽的量，用于该诊断的工具就可以包括对照条或tables,其将测定出的量分S^"个己知与急性心血管割牛或其它这鹏舰的,相伴随的量或一个已知^^IW^i^t的量。该测试条，，与特异结合禾糊,ll、脏肌钙蛋白的配柳连。该观'賦条或设备，tt^包括检测所郷与戶脱配体结合的工具。雌的检测XteJ^本发明方法中相关的具体实駄式中公开。^i^种情况下，工具作^，使得系统的j顿者糊导出量的测定结果与其诊断值根据手册上的指导和解释联在一起。在这样的一个具体实施方式中，这些工具可以以與虫的设备出IJ^tt^包驗一^^试齐愴。本领域的脉人员将,怎游不费周折it^些工具3i^来。雌的设备顧陛肖辦在没有麟的专业临床医生知识的斜牛下鹏的设备，例如，只需要加入样品的湖赋条或电子设备。结果可以以需要临床医4lf释的诊断原始繊的形式输出。然而雌的，设备的输出是不需要专业医41释的经过的诊断原始数据，iM是，输出必示数储是否患能微的或是中等的心力衰竭。ia^优选的设^^含分析单力装置(例如，生劍专感器，阵列，结合了特异i鄉则钠肽的配体的固相支持吻，等离子体表面i^a，NMR^ti十，质谱仪等)^i:;^;m&的li^本发明方法的iff古单^/^S。本发明也包含设备用以Wf^t中晚期WL性冠A病(，是无症状的)的用途，戶微设#^§:a)测定^t的样品中心roi钙蛋白的量的工具；b)<i，测定样品中禾糊肽的量的工具。最后，本发明涉及一种用于^^发明方法的i顿搶，舰a)测定^t的样品中心Wl药蛋白的量的工具；b)ffiMk，测定样品中禾嗍肽的量的工具。这S^刑顿的术语"试齐喰"涉及前虹具的集合，雌以分隔的^A—个单一的自中的形，供。该^|，也^^包含^^发明方法的用法说明。tt^tfe，该试齐憶可以另夕炮含用^^释樹可关刊鄉晚期冠状动脉自和/或它的并魏的测定结果的4顿者手册。糊哋，该手册可以包含关于什么湖啶水平相应于什么等级的风险的信息。这在本说明书的其他地方进行了详细的概括。另外，劍顿者手册可以撤关于正确删顿織嗆中的组件来测定各自的生辦励K平的指导。关于所有本说明书引用的参考文献的完整公开内容以及在本说明书中特别指出的公开内^tp—并弓l入作为参考。下述的实施例将只是鄉脱明本发明。它不能^s释为，在樹可情况下，限审体发明的范围。实施例实施例l:总共235K症状的被附f有动脉硬4W险的个,受了EGC,超声心动描^^ii同冠，t^。根据超声心动描i沐的结果，如果LVEF低于40%贝嫩诊断为心脏收缩功能的穀U患者具有高于60%的LVEF被认为TO4心脏收縮功能穀L，患者具有40^0%的LVEF被认为关于心脏收縮的功能穀L是WI定的。另夕卜观啶了左心房的尺寸和隔膜的厚度。冠状动脉,被分为单、Z^卩HlfiL管病。如棘一条或多条的血微窄使得縮小血管術^RS少50%则认定_管病。除了这些检查，还要获取关于风险行为的医学史，其包掛及烟、糖尿病、动脉高血压、先前心flMS，也包括血脂异常，微舰固醇7jC平、LDL7K平和甘油三酯水平。敏感的肌钙蛋白通过一种新发展的灵敏的肌钙蛋白T测定(RocheDiagnostics,曼海姆，德国)来检测，NT>proBNPifeilil免疫测^^检测(RocheDiagnostics,曼海姆，德国)，血浆样品中的CD40配体351德国曼海姆的RocheDiagnostics的免^S测定1^测，以及NT-proBNPilil^Wij维iM的Biomedica生产的1tl:滴定板免疫测定来检测。所有的测定都按照^T^的用法说明^iS行。下面的表l中给出了结果。表l:记录有冠状动脉疾病的患者的高灵敏TnT四分位数(quaitile)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例2:一个具有2型糖尿病史的57岁的男性有反复的短期的胸痛，^痛大多数与运动无关。他经受了冠状血管造影术以进行进一步澄清(没有发生病理变化)。肌钙蛋白TJiO，Ol，NT-proBNP是92p^ml。实施例3:一个具有心m^B^史且身体MJt状况良好的42岁的男性同意接^M学检査。M声心动描iB^中发现25%的斷氏的LVEF，冠MLf^术显示，有两狭窄》90o/。的HlfiL管病，通过支架移t魏治疗。肌钙蛋白T是0,04和NT-proBNP是920pg/ml。实施例4:总共26个患有晚期心血管病以及雜可检测的灵敏的肌钙蛋白T的患者被鹏了12个月。12个月的观察期以后，所有的患者臓^肌钙蛋白T阳性并且在检查之前，状。中值TNT水平最初J^0，009ng/ml和12个月后iJM^0,009ng/hi1。^明，3te于血液收集的时间点，肌钙蛋白T阳性f辦了一个稳定的结果并1JE确的与所定义的风,的,性。权利要求1.一种用于诊断晚期缺血性冠心病的方法，其包括如下步骤a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量；b)通过比较步骤a)中测定的量与参考量来诊断所述疾病。2.根据权利要求i的方法，其中冠'i:祸涉及冠舰管病。3.根据权利要求26^J^法，其中冠'll祸是多血管病。4.根据权利要求1或2的方法，其中MML性冠A祸是无症状的。5.根据权利要求1或2駄法，其中至少0.003ng/ml的心Wl转蛋白的参賴才际严重的,冠状动脉驗。6.根据权利要求5的方法，其中^^i^0.1n^mL7.根据权利要求1或2的方法，其中戶服的心TOl钙蛋白WI^蛋白T称^/l转蛋白I。8.根据权利要求1至7中ft"的方法，其中除了心Wl钶蛋白;^卜，还测定了禾糊肽的量。9.根据权利要求8的方法，其中禾糊肽是BNP。10.根据权利要求9的方法，其中BNP是NT-proBNP。11.根据权利要求8的方法，其中禾i糊肽是ANP。12.根据权利要求ll的方法，其中ANP是NT-proANP。13.根据权利要求1或2的方法，其中戶腿的^#是人。14.根据权利要求1或2的方法，其中至少150pg/ml的禾糊肽的参糖畅严重的晚期冠状动脉赫。15.根据权利要求14的方法，其中##35(^&^1。16.—种用于诊麟性心血管執牛的设备，其包搖a)观啶穷储的样品中心Ml钙蛋白的量的工具；b)测定一份样品中禾嗍肽的量的工具；禾口c)比l^f^fi与适合的^4以雌诊it胜心血管割牛的工具。17.—种设备用以诊断^#的,1性冠心病、1M是无症状的晚期缺血性超。祸的用途，戶鹏设純括a)测定^t的样品中心Wl钙蛋白的量的工具；b)ft，测定样品中禾糊肽的量的工具。18.用于^^:发明方法的试齐憶，其包括a)测定彭錄的样品中心Wl钙蛋白的量的工具;b)ft，测定样品中禾i糊肽的量的工具。全文摘要本发明涉及一种用于诊断晚期缺血性冠心痛的方法，包括步骤a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量；b)通过比较步骤a)中测定的量与参考量来诊断所述疾病。文档编号G01N33/50GK101126756SQ20071014212公开日2008年2月20日申请日期2007年8月16日优先权日2006年8月16日发明者A·霍施,G·赫斯申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司