专利名称：检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质指纹图谱检测技术领域，特别涉及对肝癌血清蛋白指纹图谱检测方法。
背景技术：
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率极高，严重危害人们的身体健康。中国每年约有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。早期诊断和早期治疗是提高患者成活率的关键。但目前的诊断方法敏感度和特异性均较低，已成为肝癌诊疗的一个瓶颈。肝癌的高发病率和高死亡率使得人们不断地寻求一种有效的早期诊断方法，临床上仅以AFP一种蛋白作为血清学诊断指标在敏感性和特异性上是远远不足的，而超声等影象学检测一旦发现占位病变则已经不是很早期了。能够使疾病在发生的极早期就能够得已发现，并得到控制和治疗，进而大大提高治愈率或明显改善病人的预后和生活质量。蛋白质指纹图谱技术的出现使这种需要成为可能。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强酸性和强硷性蛋白的分辨率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。后来，2D-PAGE与质谱技术的结合，已被成功地用于肿瘤研究。例如，王征等采用MALDI-TOF-MS肽质指纹图分析结合2D-PAGE对肝癌血清进行分析，发现了15个有意义的蛋白点。但因其所采用方法学所限，该结果尚不具备临床实用性和早期诊断价值。
近年来随着临床蛋白质组学的开展，使得肝癌的早期发现成为可能。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser-desorption/ionizationtime-of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术是一项近年来新兴的临床蛋白组学实用技术，具有优于二维电泳和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤标记物的筛查等研究。该技术具有操作简便、可直接分析原始生物样本(如血清、尿液、胸腹水等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标记物的筛查和临床检测。Coombes等采用此技术从乳腺癌患者的乳头分泌物中寻找特征蛋白，Schaub等用尿液检查前列腺癌，Carrette等用脑脊液诊断老年性痴呆，以及Zhang等用于AIDS研究，并均已获得很好的结果。但国内迄今尚无采用SELDI-TOF-MS技术获得检测肝癌血清特征蛋白的报道。

发明内容
本发明的目的是为克服已有对肝癌血清检测技术的不足之处，提出一种检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法，该模型为早期诊断肝癌提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。
本发明提出的检测肝癌血清蛋白质的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出6个上调蛋白和11个下调蛋白17个作为特征蛋白，选取所述17个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型；所述的6个上调蛋白(指在肝癌患者血清中含量高于正常人血清中含量)的分子量与临界峰值分别为5073道尔顿(Da)、其临界峰值为3.544，5317Da、其临界峰值为4.652，5345Da、其临界峰值为2.301，5806Da、其临界峰值为4.810，11472Da、其临界峰值为0.618和11696Da、其临界峰值为0.983；所述11个下调蛋白(指在肝癌患者血清中含量低于正常人血清中含量)，分子量分别为6838Da、其临界峰值为8.414，6879Da、其临界峰值为2.252，8563Da、其临界峰值为23.076，8687Da、其临界峰值为2.252，8766Da、其临界峰值为7.784，13752Da、其临界峰值为9.752，13955Da、其临界峰值为3.228，17498Da、其临界峰值为0.968，28222Da、其临界峰值为0.983，37415Da、其临界峰值为0.715和80470Da、其临界峰值为0.111。
本发明提出上述的检测肝癌血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1)收集多例经病理明确诊断的肝癌患者血清及经体检确定为健康者的血清作为两组血清标本，进行-70℃低温冷冻备用；2)采用WCX2芯片对所述肝癌患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附(吸附方法为常规通用方法)；3)(采用蛋白飞行时间质谱仪(ProteinChipBiology System)(Ciphergen公司生产，型号PBSII-型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为200kD，优化范围为2kD-20kD，激光强度185-195，检测敏感度为8-10，由此获得两组蛋白图谱；4)(采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析软件、Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件)对所有肝癌患者和正常人血清的蛋白质指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行统计学处理，根据肝癌患者和正常人血清之间蛋白峰值的差异(认定P值小于10-4时具有统计学意义，共得到96个蛋白峰)，检测出2组血清蛋白指纹图谱之间有17个稳定的差异蛋白，其中有6个差异蛋白稳定上调，即在肝癌患者中高表达，分子量与临界峰值分别为5073道尔顿(Da)、其临界峰值为3.544，5317Da、其临界峰值为4.652，5345Da、其临界峰值为2.301，5806Da、其临界峰值为4.810，11472Da、其临界峰值为0.618和11696Da、其临界峰值为0.983；11个差异蛋白稳定下调，即在肝癌患者中低表达，分子量分别为6838Da、其临界峰值为8.414，6879Da、其临界峰值为2.252，8563Da、其临界峰值为23.076，8687Da、其临界峰值为2.252，8766Da、其临界峰值为7.784，13752Da、其临界峰值为9.752，13955Da、其临界峰值为3.228，17498Da、其临界峰值为0.968，28222Da、其临界峰值为0.983，37415Da、其临界峰值为0.715和80470Da、其临界峰值为0.111，将所述17个差异蛋白作为肝癌蛋白质谱诊断模型的特征蛋白；6)(由于多个特征蛋白组合起来才可将肝癌与正常人完全分开)选取上述17个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型。
本发明采用上述分类树可用于肝癌早期检测和筛查。
本发明的特点及效果本发明与其他肝癌的诊断方法比较，具有以下优点第一、本发明采用肝癌患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合起来进行对肝癌血清的检测，提供的质谱模型是肝癌早期检测和筛查的新方法和新途径，并为进一步发现新的肝癌生物标记物提供了基础；第二、与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，是一种在蛋白组学水平上的诊断，对肝癌的早期诊断提供了新标准；第三、本发明模型的构建方法设计合理可行，为降低我国肝癌的病死率、提高肝癌的临床治愈率提供了一种新的筛查方法。
第四、利用本发明用双盲法分析了85份血清标本(其中有肝癌患者、正常人和其他疾病)，结果显示，79例划分正确，6份划分错误。其中肝癌和正常人均划分正确。阳性检出率(敏感性)达100％，特异性92％。因此本发明可实现对肝癌进行早期预警、早期发现。


图1为随机抽取的4个蛋白指纹图谱(2个肝癌和2个正常人)的曲线。
图2为本发明的一种分类树模型图。
具体实施例方式
本发明提出的检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法结合附图及具体应用实施例作进一步说明，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的保护范围。
本发明提出的检测肝癌血清蛋白质的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出6个上调蛋白和11个下调蛋白17个作为特征蛋白，选取所述17个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型；所述的6个上调蛋白(指在肝癌患者血清中含量高于正常人血清中含量)的分子量与临界峰值分别为5073道尔顿、其临界峰值为3.544，5317道尔顿、其临界峰值为4.652，5345道尔顿、其临界峰值为2.301，5806道尔顿、其临界峰值为4.810，11472道尔顿、其临界峰值为0.618和11696道尔顿、其临界峰值为0.983；所述11个下调蛋白(指在肝癌患者血清中含量低于正常人血清中含量)，分子量分别为6838道尔顿(Da)、其临界峰值为8.414，6879Da、其临界峰值为2.252，8563Da、其临界峰值为23.076，8687Da、其临界峰值为2.252，8766Da、其临界峰值为7.784，13752Da、其临界峰值为9.752，13955Da、其临界峰值为3.228，17498Da、其临界峰值为0.968，28222Da、其临界峰值为0.983，37415Da、其临界峰值为0.715和80470Da、其临界峰值为0.111。
本发明提出上述的检测肝癌血清蛋白质谱模型的产生方法，包括以下步骤1)收集多例经病理明确诊断的肝癌患者血清及经体检确定为健康者的血清作为两组血清标本，进行低温(-70℃)冷冻备用；2)采用WCX2芯片对所述肝癌患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附，吸附方法为常规通用方法，具体步骤如下从冰箱(-70C)中取出血清，于4℃，10000rpm离心2min；取3μl血清样品，加6μl U9处理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入108μl结合缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混匀；将WCX2芯片装入bioprocessor中，每孔加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；每孔分别加入100μl样品混合液，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl洗脱缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干；拆开bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点点加2次0.5μl SPA，晾干后即可上机测量。
3)(采用蛋白飞行时间质谱仪(ProteinChipBiology System)(Ciphergen公司生产，型号PBSII-型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为200kD，优化范围为2kD-20kD，激光强度185-195，检测敏感度为8-10，由此获得两组蛋白图谱，图1显示随机抽取的4个蛋白指纹图谱(2个肝癌和2个正常人)，箭头所示为分子量在11kD-17kD范围内的几个特征蛋白，其中11472Da、11696Da为上调蛋白，13752Da、13955Da为下调蛋白；4)(采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析软件、Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件)对所有肝癌患者和正常人血清的蛋白质指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行统计学处理，根据肝癌患者和正常人血清之间蛋白峰值的差异(认定P值小于10-4时具有统计学意义，共得到96个蛋白峰)，检测出2组血清蛋白指纹图谱之间有17个稳定的差异蛋白，其中有6个差异蛋白稳定上调，即在肝癌患者中高表达；11个差异蛋白稳定下调，即在肝癌患者中低表达，如表1所示表1肝癌患者血清中的特征蛋白

表中向上箭头“↑”为在患者血清中高表达的上调特征蛋白；向下箭头“↓”为在患者血清中低表达的下调特征蛋白；将所述17个差异蛋白作为肝癌蛋白质谱诊断模型的特征蛋白；6)(由于多个特征蛋白组合起来才可将肝癌与正常人完全分开)本方法选取上述17个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型。
图2为本发明的一种两级分类树模型图，是选取各种分类树模型中的一个模型对血清进行检测。图中，以13752Da特征蛋白为母节点l，可将所有样品分成两组，峰值≤9.752的样本划分到左边的子节点2中，诊断为肝癌患者；峰值＞9.752的样本划分到右边的终节点3.1中，诊断为正常人。子节点2中的样本继续以11472Da特征蛋白划分，峰值≤0.618的样本被划入左边的终节点3.2中，重新诊断为正常人；峰值＞0.618的样本被划入右边的终节点3.3中，诊断为肝癌患者。最终的分析结果以表格方式表示，见表2。
表2 蛋白质指纹图谱技术评价表病理诊断结果肝癌 正常人合计蛋白指纹 肝癌 311 32图谱技术 正常人3 3336合计 343468利用本发明的检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法构成的各种分类树检测肝癌血清的实施例说明如下实施例1
抽取待测患者静脉血2mL，不抗凝。室温放置30min至1h，于室温2500转/min离心5分钟，取血清等量分装后-70℃冰箱中冻存。实验时，从-70℃冰箱中取出标本，冰中融化，于4℃10000转/min离心2min。取离心后血清样品3μL，加6μL U9处理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入108μl结合缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混匀。将WCX2芯片装入bioprocessor中，每孔加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干。每孔分别加入100μl样品混合液，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl洗脱缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。拆开bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点点加2次0.5μl SPA，晾干后即可采用蛋白飞行质谱仪(PBSII-C型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的血清蛋白进行读取分析。参数设定如下最高检测分子量为200kD，优化范围为2kD-20kD，激光强度185，检测敏感度为9。考虑到基质峰的存在，将1kD以下的峰滤去，以免基质峰对结果造成干扰。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析软件自动采集数据，分析软件的参数设置如下信噪比为5，收集阈值为10％，聚集质量为2％。采用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件分析待测患者血清的蛋白质指纹图谱，用13752Da及11472Da特征蛋白及其临界峰值构成两级分类树，查得数据中13752Da及11472Da的峰值分别为2.780及4.335，判断为肝癌患者。
实施例2抽取待测患者静脉血2mL，不抗凝。室温放置30min至1h，于室温2500转/min离心5分钟，取血清等量分装后-70℃冰箱中冻存。实验时，从-70℃冰箱中取出标本，冰中融化，于4℃10000转/min离心2min。取离心后血清样品3μL，加6μL U9处理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入108μl结合缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混匀。将WCX2芯片装入bioprocessor中，每孔加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干。每孔分别加入100μl样品混合液，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl洗脱缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。拆开bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点点加2次0.5μl SPA，晾干后即可采用蛋白飞行质谱仪(PBSII-C型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的血清蛋白进行读取分析。参数设定如下最高检测分子量为200kD，优化范围为2kD-20kD，激光强度185，检测敏感度为9。考虑到基质峰的存在，将1kD以下的峰滤去，以免基质峰对结果造成干扰。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析软件自动采集数据，分析软件的参数设置如下信噪比为5，收集阈值为10％，聚集质量为2％。采用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件分析待测患者血清的蛋白质指纹图谱，用13752Da、11472Da及5806Da特征蛋白及其临界峰值构成三级分类树，所获得的数据中13752Da、11472Da及5806Da的峰值分别为9.642、0.256及3.135，判断为正常人。
实施例3抽取待测患者静脉血2mL，不抗凝。37℃孵育20-30min，于室温2500转/min离心5分钟，取血清等量分装后-70℃冰箱中冻存。实验时，从-70℃冰箱中取出标本，冰中融化，于4℃10000转/min离心2min。取离心后血清样品3μL，加6μL U9处理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入108μl结合缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混匀。将WCX2芯片装入bioprocessor中，每孔加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干。每孔分别加入100μl样品混合液，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl洗脱缓冲液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。拆开bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点点加2次0.5μl SPA，晾干后即可采用蛋白飞行质谱仪(PBSII-C型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的血清蛋白进行读取分析。参数设定如下最高检测分子量为200kD，优化范围为2kD-20kD，激光强度185，检测敏感度为9。考虑到基质峰的存在，将1kD以下的峰滤去，以免基质峰对结果造成干扰。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析软件自动采集数据，分析软件的参数设置如下信噪比为5，收集阈值为10％，聚集质量为2％。采用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件分析待测患者血清的蛋白质指纹图谱，用11472Da、11696Da、13955Da及8563Da特征蛋白及其临界峰值构成四级分类树，查得数据中11472Da、11696Da、13955Da及8563Da的峰值分别为2.677、3.115、2.069及28.026，判断为肝癌患者。
权利要求
1.一种检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出6个上调蛋白和11个下调蛋白17个作为特征蛋白，选取所述17个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型；所述的6个上调蛋白的分子量与临界峰值分别为5073道尔顿、其临界峰值为3.544，5317道尔顿、其临界峰值为4.652，5345道尔顿、其临界峰值为2.301，5806道尔顿、其临界峰值为4.810，11472道尔顿、其临界峰值为0.618和11696道尔顿、其临界峰值为0.983；所述11个下调蛋白，分子量分别为6838道尔顿、其临界峰值为8.414，6879道尔顿、其临界峰值为2.252，8563道尔顿、其临界峰值为23.076，8687道尔顿、其临界峰值为2.252，、8766道尔顿、其临界峰值为7.784，13752道尔顿、其临界峰值为9.752，13955道尔顿、其临界峰值为3.228，17498道尔顿、其临界峰值为0.968，28222道尔顿、其临界峰值为0.983，37415道尔顿、其临界峰值为0.715和80470道尔顿、其临界峰值为0.111。
2.一种检测肝癌血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1)收集多例经病理明确诊断的肝癌患者血清及经体检确定为健康者的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；2)采用WCX2芯片对所述肝癌患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附；3)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得两组蛋白图谱；4)对所有肝癌患者和正常人血清的蛋白质指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行统计学处理，根据肝癌患者和正常人血清之间蛋白峰值的差异，检测出2组血清蛋白指纹图谱之间有17个稳定的差异蛋白及其临界峰值，其中有6个差异蛋白稳定上调，其分子量与临界峰值分别为5073道尔顿、其临界峰值为3.544，5317道尔顿、其临界峰值为4.652，5345道尔顿、其临界峰值为2.301，5806道尔顿、其临界峰值为4.810，11472道尔顿、其临界峰值为0.618和11696道尔顿、其临界峰值为0.983；11个差异蛋白稳定下调分子量分别为6838道尔顿、其临界峰值为8.414，6879道尔顿、其临界峰值为2.252，8563道尔顿、其临界峰值为23.076，8687道尔顿、其临界峰值为2.252，、8766道尔顿、其临界峰值为7.784，13752道尔顿、其临界峰值为9.752，13955道尔顿、其临界峰值为3.228，17498道尔顿、其临界峰值为0.968，28222道尔顿、其临界峰值为0.983，37415道尔顿、其临界峰值为0.715和80470道尔顿、其临界峰值为0.111；将所述17个差异蛋白作为肝癌蛋白质谱诊断模型的特征蛋白；6)选取所述17个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型。
3.一种选取血清17个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树用于肝癌早期检测和筛查。
全文摘要
本发明涉及检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法，属于蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明从血清中筛选出6个上调蛋白和11个下调蛋白17个作为特征蛋白，选取所述17个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以该蛋白的临界峰值建立两级或两级以上的分类树构成用于检测肝癌血清特征蛋白检测模型；本发明为进一步发现新的肝癌生物标记物提供了基础；利用该模型对肝癌诊断的特异性、灵敏度及阳性预测率均在 90％以上。本发明对于肝癌的诊断优于目前所采用的任何单一诊断方法，为肝癌的早期发现、早期治疗提供有一种非侵入性技术，从而为降低肝癌的病死率、提高肝癌的治愈率，并进一步为高危人群筛查肝癌提供一种新方法。
文档编号G01N30/00GK1621829SQ20041010356
公开日2005年6月1日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者张建中, 郑燕华, 冯凯, 邹德威 申请人:中国人民解放军第306医院