专利名称：肿瘤早期检测评估试剂盒及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤早期检测评估试剂盒及其制备工艺。
肿瘤组织发生、发展依赖于新生血管的不断形成，通过新生毛细血管为肿瘤细胞提供必需的营养和氧气，同时血管的形成又可为肿瘤细胞代谢废物的及时排泄提供了便利的通道。研究表明，实体肿瘤组织的血管内皮细胞倍增时间仅为4天，而正常成人的组织中的血管内皮细胞倍增时间约为1年，肿瘤组织的血管内皮细胞增殖的速度比正常组织快90多倍，肿瘤组织血管内皮细胞快速增长的原因在肿瘤发生或复发时，肿瘤血管形成有关的一组基因开始活动和高度表达。肿瘤切除后，这些基因产物开始下降，甚至降到正常水平。肿瘤一旦复发、转移这些基因又开始活动，基因产物又开始升高。瘤体的缩小、发展与转移，治疗效果的好与坏都可影响到这些基因的表达。监测癌症病人这些基因的活动情况及波动变化可以预示病情的变化趋势。在这些基因中，尤以碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast GrowthFactor，bFGF)与血管的增生为密切。本试剂盒就是通过肿瘤病人血、尿中的bFGF来为临床医生提供了分子水平肿瘤状态的检测方法。
近年来的研究发现，当远外微小转移灶里的癌细胞处于无血管生成的血管前期时，其增殖速率与快速生长的原发灶的细胞增殖速率相近；而此时的微小转移灶内的癌细胞有一个非常高的凋亡速率，这时肿瘤细胞的凋亡速率与增殖速率相平衡。当肿瘤血管系统在转移灶里形成并使癌灶进入血管期后，凋亡和增殖之间的平衡被破坏，凋亡减少而增殖过程占优势，结果表现为快速生长的转移灶。
本发明的目的在于提供一种肿瘤早期检测评估试剂盒及其试剂盒中bFGF单克隆抗体、多克隆抗体和其它缓冲剂的制备工艺，能够简单地对肿瘤的发生、发展，肿瘤的疗效进行动态评估。
本试剂盒每盒是由以下物质组成的包被缓冲液1瓶阳性对照(bFGF)1瓶阴性对照(生理盐水)1瓶BFGF的单克隆抗体或多克隆抗体 1瓶二抗标记物1瓶酶底物溶液1瓶终止液1瓶洗涤液1瓶封口胶1块酶标板1块其中阳性对照(bFGF)、阴性对照(生理盐水)、二抗标记物、封口胶、酶标板为现有物质；包被缓冲液、BFGF的单克隆抗体或多克隆抗体、酶底物溶液、终止液、洗涤液是由本发明的工艺制备而成的。
本发明的工艺是通过以下步骤实现的；1.多克隆抗体的制备1.1 bFGF抗原瑞森基因项目工程药物研究所制备1.2动物成年纯种大耳白兔1.3方法A免疫准备于每只家兔两后肢脚掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5—6mg。B第一次免疫注射弗氏完全佐剂(FCA)抗原的制备，取不完全佐剂5ml，缓慢滴加BCG，边滴边研磨。再逐滴加入等量bFGF抗原液(边滴边研磨)直至形成油包水乳剂，滴1滴于冷水上久置不散为合格，滴加BCG及抗原时不可太快，加1滴充分研匀再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐剂中，应含BCG5—6mg/ml，抗原5mg/ml。
免疫准备后10天左右，于每只兔两后支窝已肿大的淋巴结构内或其近旁各注入弗氏完全佐剂抗原(bFGF)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg。C第二次免疫注射间隔2-3周后，于每只兔脊柱两侧，两肩部，两臀部及两腹股沟皮下作多点注射，每点0.2ml弗氏完全佐剂抗原，共8—10点。D第三次免疫注射间隔2-3周后，再于每只家兔脊柱两侧、肩部、两臀部选不同点上，作皮下多点注射，共8点，每点注射弗氏不完全佐剂抗原(不含BCG)0.2ml。E试血测抗体效价间隔7-10天，无菌采兔耳静脉血0.5-1ml，分离血清，以双向琼脂扩散试验测抗体效价。效价＞1∶32时，可以放血。否则，以不加佐剂的抗原作静脉注射免疫，一周内注射3次，依次为0.1、0.3、0.5m.l(含人bFGF分为1mg，3mg，5mg)。一周后再试血测效价，达到要求，立即放血。F放血采用颈动脉采血法。G分离血清将放出或抽出的血液倾斜放入37℃孵箱15-30分钟，再移至4℃数小时，待血块收缩，血清析出时，吸出血清，放入试管中，2000转/分钟离心30分钟。HIgG的分离纯化IgG的提取分两步进行，第一步采用盐析法粗提人γ球蛋白；第二步将提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱层析提纯IgG。具体方法如下取血清60ml+生理盐水60ml，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵120ml，4℃，30分钟，离心3000转X20分钟，弃上清，加生理盐水60ml溶液，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵30ml，4℃，3小时，离心3000转/分X20分钟，弃上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml。在PH7.2-7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成为穿过峰，获得较纯的IgG。2.单克隆抗体的制备2.1 小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug bFGF加福氏完全佐剂腹腔注射，间隔2-3周后，用同样剂量bFGF腹腔加强免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾细胞融合。2.2 抗原bFGF，由陕西瑞森基因工程药物研究所提供。2.3 细胞融合，免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，进行细胞融合，用ELISA间接法初步筛选出阳性克隆，再用中和抑制试验证实为阳性克隆后，经有限稀释法克隆2-3次，筛选出分泌抗体阳性的单个克隆，稳定传代3个月，制备腹水和液氮冻存。2.4 单克隆抗体的鉴定2.4.1 杂交瘤细胞系染色体分析取对数生长期的杂交瘤细胞用秋水仙素处理，经Giemsa染色，镜检计数。2.4.2 Ig类及IgG亚类测定用美国Sigma公司的抗鼠Ig亚类抗血清与浓缩至原容积1/20的杂交瘤细胞培养上清液作琼脂双向免疫扩散。2.4.3 单克隆抗体特异性的测定将bFGF进行电转移，而后用各株单抗分别进行ELISA染色。2.4.4 单克隆抗体比活性测定将各株单抗的蛋白进行定量，然后按不同稀释度测定各株的滴度。3. 多克隆及克隆ELISA测定尿样中的的bFGF3.1 各种缓冲液及试剂的配制方法A.包被缓冲液0.05M PH9.6的Na2CO3—NaHCO3Na2CO3(MW105.99)1.59克NaHCO3(MW84.01)2.93克蒸馏水溶至1000mlB.洗涤液PH7.4的PBS-Tween 20NaCl(MW58.44)8.0克KH2PO4(MW136.09)0.2克Na2HPO4·12H2O(MW358.14)2.9克(或者NaHPO41.14克 )KCl(MW74.56)0.2克蒸馏水溶至1000mlTween 20 0.5mlC.酶标记物稀释液在上述洗涤液中加入羊血清，浓度为2％。D.酶底物溶液邻苯二胺(O.P.D)—H2O2(2)磷酸—柠檬酸缓冲液PH5.0①0.2M Na2HPO4
取Na2HPO4·12H2O 71.63克用蒸馏水溶至1000ml。
②0.1M柠檬酸液取柠檬酸19.2克，用蒸馏水溶至1000ml，取①液25.7ml，②液24.3ml，再加蒸馏水50ml。
(2)O.P.D—H2O2邻苯二胺(O.P.D)10mg磷酸—柠檬酸缓冲液25ml3％H2O2(分析纯)0.4mlE.终止液2MH2SO4浓硫酸(95-98％)22.2ml蒸馏水 177.3ml(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。)3.2操作步骤取单克隆或多克隆抗体，正常鼠IgG(均稀释成10mg/ml)平行包被40孔板(如A排包被单克隆或多克隆抗体，B排包被正常鼠IgG)，0.1ml/孔，放入湿盒中4℃冰箱过夜，用洗涤液洗涤板3次，每次3分钟，甩干。在平行包被的孔中加入被检抗原0.1ml/孔，37℃孵育1小时，同上洗涤3次，甩干。再在各孔内加入单克隆或多克隆抗体(稀释成10mg/ml)，0.1ml/孔，37℃孵育1小时，同上洗涤3次，甩干，在各孔中加入酶标的二抗(稀释成1∶4000)，0.1ml/孔，37℃孵育1小时，同上洗涤3次，甩干。在各孔内加入酶底物溶液0.1ml/孔，37℃避光孵育20分钟。在各孔内加入2M H2SO40.025ml/孔，终止反应，用酶联检测仪测定各孔的490nm的吸光度。3.3 结果判定OD 比值计算
实施例一.试剂盒组成96人份 48人份 20人份包被缓冲液 1瓶 10ml 5ml 2.5ml阳性对照(bFGF) 1瓶 1ml 0.5ml 0.25ml阴性对照(生理盐水) 1瓶 1ml 0.5ml 0.25mlBFGF的单克隆抗体或多克隆抗体 1瓶 10ml 5ml 5ml二抗标记物 1瓶 10ml 5ml 5ml酶底物溶液 1瓶 6ml 3ml 3ml终止液 1瓶 6ml 3ml 3ml洗涤液 1瓶 25ml 12.5ml 6ml封口胶 1块 10块 10块1块酶标板 1块 96孔板 48孔板 24孔板二、标本收集1.晨尿、脱水及大量输液病人不宜采尿。
2.最好新鲜尿样，4℃可保存48小时，-20℃可保存4周。
3.尿液不能反复冻融。三、试剂贮存1. 4℃保存，有效期为4-6个月。
2.包被液必须盖紧，4℃保存，长期不用，应更换新包被液。四、检测步骤1.取出酶标板，每孔加包被液2滴(其中3孔不加，直接加阳、阴性对照液各2滴，一孔留作空白对照)。2.加病人尿液10ul，与包被液混匀。加盖封口膜，置湿盒，4℃过夜或37℃3.5—4小时以上。3.到时取出，吸去包被液，每孔加洗涤液200ul，洗3次，每次加洗液后静置1分钟后，甩净，拍干余液。4.加一抗2滴，37℃湿盒60分钟。5.同步骤3，洗3次。6.加二抗2滴，37℃湿盒60分钟。7.同步骤3，洗3次。8.每孔滴加底物A和B各1滴(空白不滴)，混匀，置湿盒37℃×30分钟(或室温45分钟)避光。到时，每孔加终止液1滴，在酶标仪490mm处测OD值。五、判断结果OD比值计算
六、临床评估参考1 待检标本OD比值≥2.1，表明血管形成肽基因表活跃。2 待检标本OD比值在1.5—2.0之间为可疑。3 待检标本OD比值在1.5以下，表示血管形成肽基因表达处于静止期。
权利要求
1.肿瘤早期检测评估试剂盒，包括阳性对照(bFGF)、生理盐水、二抗标记物、封口胶、酶标板，其特征在于，其中还包括包被缓冲液、BFGF的单克隆抗体或多克隆抗体、酶底物溶液、终止液和洗涤液。
2.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所说的包被缓冲液为0.05M、PH9.6的Na2CO3—NaHCO3，所说的酶底物溶液为邻苯二胺(O.P.D)—H2O2，所说的终止液为2MH2SO4，所说的洗涤液为PH7.4的PBS—Tween 20。
3.根据权利要求1所述的试剂盒的制备工艺，其特征在于，所说的BFGF的多克隆抗体按以下A-H步骤制备A免疫准备于每只家兔两后肢脚掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg；B第一次免疫注射弗氏完全佐剂(FCA)抗原的制备，取不完全佐剂5ml，缓慢滴加BCG，边滴边研磨，再逐滴加入等量bFGF抗原液(边滴边研磨)直至形成油包水乳剂，滴1滴于冷水上久置不散为合格，滴加BCG及抗原时不可太快，加1滴充分研匀再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐剂中，应含BCG5—6mg/ml，抗原5mg/ml；免疫准备后10天左右，于每只兔两后支窝已肿大的淋巴结构内或其近旁各注入弗氏完全佐剂抗原(bFGF)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg；C第二次免疫注射间隔2-3周后，于每只兔脊柱两侧，两肩部，两臀部及两腹股沟皮下作多点注射，每点0.2ml弗氏完全佐剂抗原，共8—10点；D第三次免疫注射间隔2-3周后，再于每只家兔脊柱两侧、肩部、两臀部选不同点上，作皮下多点注射，共8点，每点注射弗氏不完全佐剂抗原(不含BCG)0.2ml；E试血测抗体效价间隔7-10天，无菌采兔耳静脉血0.5-1ml，分离血清，以双向琼脂扩散试验测抗体效价。效价＞1∶32时，可以放血，否则，以不加佐剂的抗原作静脉注射免疫，一周内注射3次，依次为0.1、0.3、0.5m.l(含人bFGF分为1mg，3mg，5mg)，一周后再试血测效价，达到要求，立即放血；F放血采用颈动脉采血法;G分离血清将放出或抽出的血液倾斜放入37℃孵箱15-30分钟，再移至4℃数小时，待血块收缩，血清析出时，吸出血清，放入试管中，2000转/分钟离心30分钟；HIgG的分离纯化IgG的提取分两步进行，第一步采用盐析法粗提人γ球蛋白；第二步将提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱层析提纯IgG，具体方法如下取血清60ml+生理盐水60ml，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵120ml，4℃，30分钟，离心3000转X20分钟，弃上清，加生理盐水60ml溶液，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵30ml，4℃，3小时，离心3000转/分X20分钟，弃上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml，在PH7.2-7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成为穿过峰，获得较纯的IgG。
4.根据权利要求1所述的试剂盒的制备工艺，其特征在于，所说的BFGF的单克隆抗体按以下步骤制备(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug bFGF加福氏完全佐剂腹腔注射，间隔2-3周后，用同样剂量bFGF腹腔加强免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾细胞融合；(2)免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，进行细胞融合，用ELISA间接法初步筛选出阳性克隆，再用中和抑制试验证实为阳性克隆后，经有限稀释法克隆2-3次，筛选出分泌抗体阳性的单个克隆，稳定传代3个月，制备腹水和液氮冻存。
全文摘要
本发明提供一种肿瘤早期检测评估试剂盒,由包被缓冲液、阳性对照(bFGF)、生理盐水、BFGF的单克隆抗体或多克隆抗体等组成,同时,本发明还提供了BFGF单克隆抗体、多克隆抗体和其它缓冲剂的制备工艺,能够简单对肿瘤的发生、发展,肿瘤的疗效进行动态评估。
文档编号G01N33/531GK1251901SQ9911590
公开日2000年5月3日 申请日期1999年11月9日 优先权日1999年11月9日
发明者赵永同, 祁淼 申请人:赵永同, 祁淼