专利名称：一种检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的试剂盒及方法
技术领域：
:本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种血清或血浆中的脂蛋白残粒胆固醇(RLP-C)，具体来说是一种检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的试剂盒及方法。
背景技术：
:脂蛋白残粒(remnantlipoprotein, RLP)又称富含甘油三酯(triglyceride,TG),脂蛋白残粒(TRL)是乳糜微粒(chylomicron, CM)和极低密度脂蛋白(very lowdensitylipoprotein, VLDL)经脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)水解逐渐失去甘油三酯、磷脂、脂蛋白A (apoprotein A, apoA)和apoC后,转变成的富含胆固醇、胆固醇脂和apoE的较小颗粒。近年来，随着对脂蛋白残粒的深入了解，RLP测定的临床意义日趋受重视。大量研究表明，浓度在动脉粥样硬化性疾病及动脉粥样相关的疾病(如II型糖尿病、III型高脂血症和慢性肾功能衰竭及肥胖患者)中显著增加。另外，从人动脉粥样斑块中分离的脂蛋白在结构上与富含TG脂蛋白残粒相似。因此，血清或血浆脂蛋白残粒胆固醇(RLP-C)水平升高是动脉粥样硬化性疾病和冠心病(coronary heart、disease, CHD)以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病的重要危险因素。所以，准确、快速测定RLP非常重要。然而，现有技术中测定RLP的传统方法多用超速离心法和凝胶电泳法。脂蛋白残粒是一组在大小、密度、电泳迁移率、化学组成及受体识别等方面呈高度异质性的颗粒，现有的分离方法主要是根据其不同的物理和化学特征来测定脂蛋白残粒。超速离心是脂蛋白分离的参考方法，先前常用LDL (1.006<d>ll.009kg/L或Svl2 20)反映残粒状态，后来有学者提出Svl2 60的脂蛋白反映颗粒状态比Svl2 20的脂蛋白好。但是在此范围的脂蛋白包括LDL (1.006〈d>ll.009kg/L或Svl2 20)和介于d〈l.006kg/L组分中的小VLDL颗粒，因此，此法并不 能作为分离脂蛋白残粒的参考方法；而聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)法根据分子大小来分离脂蛋白，用LDL来反映脂蛋白残粒状态，包括大小在VLDL和LDL的任何脂蛋白残粒。但是，此两种方法因需特殊仪器，费时或操作繁琐，均难于在普通实验室展开。由Naka jima et al创建了一种基于脂蛋白残粒表面的载脂蛋白组成而建立的免疫分离法。使用免疫亲和胶混合了抗人apoB-100单抗(J1-H)，单抗识别正常血脂水平与高TG血症样本中绝大多数apo B-100-VLDL以及几乎所有的IDL和LDL，但不识别富含apoE的一小部分VLDL ；电镜下，非结合部分的脂蛋白主要是直径在30-80um的VLDL ；HPLC分析，同样支持其VLDL的主要成分；免疫亲和胶含有的抗人apo Al单抗用以去除几乎所有的HDL颗粒，SDS-PAGE显示非结合部分包含了 apoB-100，B-48，E，C，但没有apo Al的脂蛋白；在琼脂糖电泳中，非结合脂蛋白(d〈1.006kg/L)显示β或慢pre-β泳动带，而结合脂蛋白(d〈l.006kg/L)与正常VLDL则显示快pre-β泳动带,此非结合脂蛋白富含apo E,包含了几乎所有apo B-48与部分apo B-100的TRL。因此，其组成为CM与VLDL残粒，被称为残粒样微粒(remnant-like particles, RLP)0
在Naka jima et al 创建的方法，由日本 Immunoresearch Laboratories 生产测定RLP-C免疫分离试剂含有三种试剂:第一种试剂由免疫亲和胶组成:含抗人ApoB-100 (J1-H)单克隆抗体，抗人ApoAI (H-12)单克隆抗体；第二种试剂:RLP-C洗涤液、Tris-HceBuffer Solution洗漆液。第三种试剂:胆固醇试剂。其操作方法:经室温平衡后的均匀的免疫亲和胶，置IOml基底离心管，用RLP-C Buffer (pH7.4)洗涤三次，混匀后，将3mm直径钢珠加入微量样品杯中，加入300ul洗涤后的免疫分离胶与5ul样本，室温条件下在水平振荡器上振荡120分钟，静置30分钟后，取上清液备用。第二步，取静置30min后的上清液20ul备用。第三步，用生化分析仪检测样品量20ul第一试剂160ul，5min后加试剂II 53ul，5min读点，计算其胆固醇浓度。此检测方法价格昂贵，检测每份血清需数百元，而且，分离过程需4-6小时，免疫亲和胶需要洗涤三次，费人力，操作繁琐，难于在实验室开展。因此，需要一种简单、廉价、快速的检测血清或血浆中脂蛋白残粒胆固醇的方法。从上世纪日本Immunoresearch Laboratories提供RLP-C免疫分离胶上市,但是在方法学上操作繁琐、费时、费力、价格昂贵，仅限于实验研究用，而且不供应中国大陆使用。10多年来，国内仅有2篇科研实验文章发表，检测试剂也是通过其他途径进入国内实验室的
发明内容
:针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的试剂盒及方法。本发明提供了一种检测试剂盒，包括两种试剂，第一种试剂Rl由β -环糊精、抗人ΑροΒΙΟΟ单克隆抗体、抗人ApoAI单克隆抗体、抗环血酸氧化酶、胆固醇酯酶、Tris缓冲液组成，所述的Tris缓冲液的PH值 为7.1-7.5 ;第二种试剂R2由Tris缓冲液、过氧化物酶、胆固醇氧化酶和4-氨基安替比林组成，所述的Tris缓冲液的PH值为7.1-7.5。进一步的,所述的抗人ΑροΒΙΟΟ单克隆抗体也可选择兔或羊抗人ΑροΒΙΟΟ多克隆抗体。进一步的,所述的ApoAI单克隆抗体也可选择兔或羊抗人ApoAI多克隆抗体。本发明还提供了一种采用上述的试剂盒检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的方法，包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样品加入第一种试剂Rl后，37°C孵育5min，读测第I点样本Al，加入第二种试剂R2，37°C孵育5min，读测第2点样本A2，样本A=样本A2-样本Al，还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准采用生化分析仪测定的步骤中，将校准加入第一种试剂Rl后，37°C孵育5min，读测第I点校准Al，加入第二种试剂R2，37°C孵育5min，读测第2点校准A2，校准A=校准A2-校准Al ；
权利要求
1.一种检测试剂盒，包括两种试剂，其特征在于:第一种试剂Rl由β-环糊精、抗人ΑροΒΙΟΟ单克隆抗体、抗人ApoAI单克隆抗体、抗环血酸氧化酶、胆固醇酯酶、Tris缓冲液组成，所述的Tris缓冲液的PH值为7.1-7.5 ;第二种试剂R2由Tris缓冲液、过氧化物酶、胆固醇氧化酶和4-氨基安替比林组成，所述的Tris缓冲液的PH值为7.1-7.5。
2.如权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于:所述的抗人ΑροΒΙΟΟ单克隆抗体也可选择兔或羊抗人ΑροΒΙΟΟ多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于:所述的ApoAI单克隆抗体也可选择兔或羊抗人ApoAI多克隆抗体。
4.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的方法，其特征在于包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样品加入第一种试剂Rl后，37°C孵育5min，读测第I点样本Al，加入第二种试剂R2,37°C孵育5min，读测第2点样本A2，样本A=样本A2-样本Al，还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤中，将校准品加入第一种试剂Rl后，37°C孵育5min，读测第I点校准品Al，加入第二种试剂R2，37°C孵育5min,读测第2点校准品A2，校准A=校准品A2-校准品Al ；
全文摘要
本发明一种检测试剂盒，包括两种试剂，第一种试剂R1由β-环糊精、抗人ApoB100单克隆抗体、抗人ApoAI单克隆抗体、抗环血酸氧化酶、胆固醇酯酶、Tris缓冲液组成；第二种试剂R2由Tris缓冲液、过氧化物酶、胆固醇氧化酶和4-氨基安替比林组成。本发明还提供了一种检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的方法，将样品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，通过生化分析仪读测第1点样本A1，然后加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，通过公式计算脂蛋白残粒胆固醇的浓度，本发明的测定方法简便、快速。
文档编号G01N33/50GK103235114SQ201310170390
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者朱晓敏, 朱慧琳, 王泉龙, 杨杰, 刘颖成, 刘颖冰 申请人:上海北加生化试剂有限公司