专利名称：双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及新颖的双马来酸酐(bis-maleic anhydride)。本申请尤其涉及以下发现双马来酸酐交联剂可被用于保存/固定细胞样品或组织样品。因其具有很大优势，故双马来酸酐交联剂可用于需要固定细胞样品或组织样品并且与此同时需要固定剂对随后的操作(如免疫组织化学、荧光原位杂交或RT-PCR)中对蛋白或核酸的检测几乎没有影响的方法。本申请同样证实了使用双马来酸酐交联剂作为固定剂很大程度地促进了在预先固定的细胞样品或组织样品中对感兴趣的分析物的随后的检测。
背景技术：
迄今为止，没有通常可应用的、“理想的”方式来制备例如分别用于免疫组织化学或感兴趣的核酸的检测的细胞样品或组织样品。固定和通过固定所引入的负面效应的可逆性分别对多肽抗原和核酸的可检测性，以及对由此获得的结果的再现性产生主要影响。对于细胞样品或组织样品中的抗原的成功的免疫染色，至少要满足三个标准a) 抗原在其原位的保留(retention)，b)抗原的可接近性(accessibility)和c)对感兴趣的抗原/表位进行正确的构建/保存。目前看来，没有固定和/或检测操作完全满足了所有这三个标准。对于本领域已知的操作而言，对于这些标准中的一个或两个的最好的表现导致了至少一个其它标准的降低的表现的代价。一些固定剂是可获得的并且在临床病理学实验室的例行程序中使用，如戊二醛、 甲醛和丙酮，或其它有机溶剂。然而，绝大部分的固定操作是基于交联剂的使用，如甲醛。 固定剂溶液通常为含有磷酸钠的甲醛水溶液，其被配制成提供至PH为7. 2-7. 6的缓冲作用 (在加入少量的强酸或碱后产生最小的PH变化)和大约等渗的溶液(一种其渗透压与哺乳动物细胞外液相同的溶液，通常基于生理盐水)。按照现有技术的发展水平，需要固定操作是正好恰当的。如果固定时间太短，则仅发生由用于使样品脱水的醇导致的蛋白质的凝结，而不发生固定。这可能例如负面地影响组织形态学的保存或损伤长期的保存稳定性。伴随着延长的甲醛固定，交联蛋白分子形成可削弱石蜡的渗透或/和抗体分子进入的致密的网络。由此，感兴趣的抗原可能被可逆性地或者甚至不可逆地掩蔽。进一步地， 表位可能被化学修饰(“破坏”)(例如，通过与甲醛反应)。此外，已知甲醛固定后大多数酶的活性受到了损伤。如上所提及，在甲醛中的固定在临床病理学上的应用最为广泛。其主要原因最可能是通过用甲醛固定，感兴趣的抗原被捕捉在其在活体中所占据的位置。凭借甲醛固定后引入的亚甲基桥，细胞样品或组织样品的形态学也得以很好的保存。然而，这些正面作用需要付出样品通透性方面的代价，并导致了引起易接近性和/或感兴趣的抗原/表位的构型的变化、核酸的损伤和酶活性的失活的固定。由甲醛固定导致的交联可能会掩蔽或损坏表位，导致假阴性免疫染色。当主要的免疫试剂为单克隆抗体时，上述失效甚至比使用多克隆抗血清时更有可能会发生。这就是为什么进行了许多次尝试并发现于与处理逆转甲醛固定效应相关的文献中。为进行长期储存，固定的细胞样品或组织样品通常需要为脱水的并且包埋在合适的包埋剂中。相对于塑料包埋或用震动切片机(vibrating microtome)或在恒冷切片机中切割未包埋样品，石蜡包埋通常是优选的。如上所述，在某种程度上，所有的固定操作表示各种妥协方案。最好的形态学保存经常付出了对于抗体的易接近性或在抗原或其上的表位的破坏的代价。但是且对于本发明而言同样重要的，不仅存在在样品的制备期间(如样品的固定或进一步的加工如用石蜡包埋)引入的高的差异性，还可能存在甚至更大的差异性，其是由各种方式和途径的在核酸检测中恢复免疫反应性或可接近性，即在被称为抗原修复的操作中所导致的。尽管例如免疫组织化学方法或用于在细胞样品或组织样品中检测感兴趣的核酸的方法得以广泛应用并具有重要用途，仍存在对进一步改善的巨大需求。这样的改善可以例如涉及更温和的细胞样品或组织样品的固定、抗原修复中的改善或/和结果的更好的可比性和再现性，以及可以甚至涉及使用其中相应的抗原或表位在标准操作如甲醛固定中被破坏的抗体的可能性。本发明的发明人已经令人惊奇地发现双马来酸酐作为交联剂在细胞样品或组织样品的制备/固定中的用途具有巨大优势，并且可以且将导致关于本领域已知的至少一个或甚至几个问题的显著性的改善。

发明内容
本方面涉及用于体外固定细胞样品或组织样品的方法，其中所述细胞样品或所述组织样品与双马来酸酐交联剂孵育，由此将所述细胞样品或所述组织样品固定。本申请进一步公开了保存细胞样品或组织样品的方法，所述方法包括用双马来酸酐交联剂固定组织样品和将所述固定的样品包埋于石蜡中的步骤。本发明还公开了用于在细胞样品或组织样品上进行免疫组织化学的方法，所述方法包括如下步骤用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品，将所述固定的样品包埋于石蜡中，将所述样品脱去石蜡，除去双马来酰胺交联以及免疫检测感兴趣的表位。本申请还描述了用于通过在细胞样品或组织样品上进行原位杂交从而体外检测感兴趣的核酸的方法，所述方法包括以下步骤用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品，将所述固定的样品包埋于石蜡中，将所述样品脱去石蜡，除去双马来酰胺交联以及通过原位杂交来检测感兴趣的核酸。本申请进一步给出了用于通过在细胞样品或组织样品中的RT-PCR从而体外检测感兴趣的核酸的方法，所述方法包括以下步骤用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品，将所述固定的样品包埋于石蜡中，将所述样品脱去石蜡，除去双马来酰胺交联以及通过进行RT-PCR来检测感兴趣的核酸。本申请也显示了基于本发明的方法，在从细胞样品或组织样品制备的相同的样品中感兴趣的多肽和感兴趣的核酸均可以被检测出来。本发明涉及用于在一个包含细胞样品或组织样品的测试样品中通过免疫组织化学体外检测至少一种感兴趣的多肽和检测至少一种感兴趣的核酸的方法，所述方法包括以下步骤用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或
5组织样品，将所述固定的样品包埋于石蜡中，将所述样品脱去石蜡，除去双马来酰胺交联以及通过进行RT-PCR或荧光原位杂交来免疫检测至少一种感兴趣的多肽和检测至少一种感兴趣的核酸。本发明进一步涉及双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途以及双马来酸酐交联剂在制造用于固定细胞样品或组织样品的固定剂中的用途。
具体实施例方式在第一个实施方案中，本发明涉及用于体外固定细胞样品或组织样品的方法，其中所述细胞样品或所述组织样品与式I的双马来酸酐孵育，
权利要求
1.用于体外固定细胞样品或组织样品的方法，其中所述细胞样品或所述组织样品与式 I的双马来酸酐孵育，
2.权利要求1的方法，其中在所述双马来酸酐中，Rl为氢或甲基且R2为氢或甲基。
3.权利要求1或2的方法，其中在所述双马来酸酐中，Rl和R2是相同的。
4.权利要求1、2或3的方法，其中在所述双马来酸酐中，连接基X的长度为1-20个原子。
5.权利要求1-4中任一项所述的双马来酸酐，其中连接基X的主链由碳原子和任选的一个或多个选自0、N和S的杂原子组成。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品与双马来酸酐孵育1-72个小时。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将固定的样品包埋于石蜡中的步骤。
8.权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤a)将固定的样品包埋于石蜡中，b)将所述样品脱去石蜡，c)除去双马来酰胺交联，和e)对感兴趣的表位进行免疫检测。
9.权利要求8的方法，其中所述感兴趣的表位为当包括所述表位的所述细胞样品或组织样品用甲醛固定剂固定时被掩蔽或破坏的表位。
10.权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤a)将步骤(a)的固定的样品包埋于石蜡中，b)将所述样品脱去石蜡，c)除去双马来酰胺交联，和d)通过进行原位杂交来检测感兴趣的核酸。
11.权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤a)将固定的样品包埋于石蜡中，b)将所述样品脱去石蜡，c)除去双马来酰胺交联，和d)通过进行RT-PCR来检测感兴趣的核酸。
12.权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤 a)将固定的样品包埋于石蜡中，b)将所述样品脱去石蜡，c)除去双马来酰胺交联，和d)通过进行RT-PCR或荧光原位杂交来免疫检测至少一种感兴趣的多肽以及检测至少一种感兴趣的核酸。
13.权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤a)将固定的样品包埋于石蜡中，b)将所述样品脱去石蜡，c)除去双马来酰胺的交联，d)分离核酸，和e)用步骤(d)中分离的核酸进行突变分析。
14.双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途。
15.双马来酸酐交联剂在制备用于固定细胞样品或组织样品的固定剂中的用途。
全文摘要
本申请涉及新颖的双马来酸酐。本发明尤其涉及以下发现双马来酸酐交联剂可被用于保存/固定细胞样品或组织样品。因其具有很大优势，故双马来酸酐交联剂可用于需要固定细胞样品或组织样品并且与此同时需要固定剂对随后的操作如免疫组织化学、荧光原位杂交或RT-PCR中对蛋白或核酸的检测几乎没有影响的方法。
文档编号G01N1/30GK102472696SQ201080036711
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月19日 优先权日2009年8月21日
发明者H-P.乔赛尔, M.杰格, R.I.西兹迪亚兹, R.赫尔曼 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司