专利名称：预测糖尿病的工具和方法
预测糖尿病的工具和方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断糖尿病易感性的方法，所述方法包括测定怀疑具 有糖尿病易感性的受试者的试验样品中至少一种代谢物，并将所迷至少一 种代谢物与参考比较，由此诊断糖尿病易感性。此外，本发明包括代谢物 集合、数据集合(包含代谢物的特征值)和存储介质(包含所述数据集合)。 此外，本发明也涉及系统，所述系统包含用于比较有效连接到数据存储介 质上的样品代谢物特征值的工具。本发明还包括是诊断工具，其包含至少 一种代谢物，以及所述至少一种代谢物用于制备用于诊断糖尿病易感性的 诊断工具的用途。最后，本发明涉及用于鉴定糖尿病相关代谢物的方法。
糖尿病的流行在工业化世界中已达约6% ，并在2030年将在全世界范 围内增加至3.66亿的受影响人群。世界上糖尿病的最常见原因(类型)(约 卯％)是2型糖尿病，其具有多因子致病原因。2型糖尿病的病理学序列 携带许多元件。相信具有目前了解甚少的遗传易感性是强制性的。糖尿病 表型然后是否会发生受许多环境因素影响，所述环境因素具有通过引起或 损害胰岛素抵抗或削弱胰岛素分泌而刺激(stress )葡萄糖稳态系统的能力。 当然，许多激素在葡萄糖代谢调节中起作用，但关键激素是胰岛素。血糖 量正常通过胰島素作用与胰岛素分泌之间平衡的相互影响而维持。胰岛素 由胰腺P细胞产生，所迷胰腺P细胞对于不同的葡萄糖需要能够极快速调 控。2型糖尿病的主要原因是胰岛素抵抗增加。因此，胰岛素作用通常降 低，但最初该(葡萄糖稳态)系统能够通过增加P细胞的功能来补偿胰岛 素作用的降低。此时，或许仅可检测OGTT中的空腹血糖受损或糖耐量受 损。但是随时间流逝，增加的胰岛素抵抗和葡萄糖毒性将会使所述P细胞 应激过度，并可诊断2型糖尿病。
除高jfcj瞎或低血糖引起的直接医学问题外，所述疾病的主要医学和社会经济学负担是由伴随的并发症引起的。糖尿病的破坏性并发症主要是大
血管和樣bk管疾病，像慢性肾衰竭、视网膜病、外周神经病和自主神经病 或心4/U使塞。因此，患有2型糖尿病的患者心血管发病率比非糖尿病患者 的心血管发病率高2到4倍(Stumvoll等，Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy, Lancet 2005 )。
才艮据该机制，目前糖尿病的治疗基于监测血糖水平并通过施用外源胰 岛素将升高的血糖水平降低至正常水平。为此，将外源胰岛素注射进血液。
或者，可通过营^^L食并排除生活方式的危险因素如吸烟、缺乏锻炼、高 胆固醇水平和不稳定的体重来调节血液中的葡萄糖水平。
ADA (美国糖尿病协会)的专家委员会认可了受试者的中间群体，其 葡萄糖水平虽然没有到i^瞎尿病的标准，然而也高得不能认为是正常的。 定义该组空腹血糖(FPG )水平>100 mg/dl ( 5.6 mmol/1)但<126 mg/dl ( 7.0 mmol/1)或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中2小时值〉140 mg/dl (7.8 但<200 mg/dl (11.1 mmol/1 )。因此，FPG值的分类如下 -FPG <100 mg/dl ( 5.6 mmol/1)=正常空腹葡萄糖； -FPG 100 - 125 mg/dl ( 5.6 - 6.9 mmol/1) = IFG (空腹血糖受损)； -FPG >126 mg/dl ( 7.0 mmol/1)=糖尿病的临时性诊断(如下描述， 必须证实该i貪断)。
当使用OGTT时相应的分类如下
-负荷后2小时血糖<140 mg/dl ( 7.8 mmol/1)=正常葡萄糖耐量； 画负荷后2小时血糖140 - 199 mg/dl (7.8 - 11.1 mmol/1) = IGT (糖耐
量受损)；
-负荷后2小时血糖>200 mg/dl (11.1 mmol/1)=糖尿病的临时性诊断 (如下描述，必须证实该诊断)。 2型糖尿病的诊断
1.糖尿病症状加上偶然血糖浓度>200 mg/dl (11.1 mmol/1 )。偶然定义 为一天内的任何时间，而不考虑自上一餐后的时间。糖尿病的经典症状包 括多尿、多饮和莫名其妙的体重减轻。或者2. FPG >126 mg/dl (7.0mmo1/1)。空腹定义为至少8小时无能量摄取。或者3.0GTT中负荷后2 小时血糖>200 mg/dl (11.1 mmol/1 )。应该如描述通过WHO， 4吏用含溶解 在水中的75 g无水葡萄糖等同物的葡萄糖负荷来进行试验。
缺少明确的高血糖情况下，应该通过在不同的日子重复试验来确认这 些标准。不推荐将第三种措施(OGTT)用于常规临床用途。(美国糖尿病 协会，Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care 2006)。然而，血糖水平的增加或可获得的胰岛素的减少是糖尿病发生和进 展中相当下游的发展。仍未有备选诊断措施，或甚至可在疾病发作早期之 前或至少在疾病早期鉴定处于危险中的个体的诊断措施。
因此，本发明根本的技术问题必须视为提供有效并可靠地诊断糖尿病 易感性的工具和方法。该技术问题通过权利要求中表征的实施方案和下文 描迷的实施方案来解决。
因此，本发明涉及"^断糖尿病易感性的方法，所述方法包括 (a )测定怀疑患有糖尿病或具有其易感性的受试者试验样品中的至 少一种代谢物，所述至少一种代谢物选自隐黄质、2-羟基-十六烷酸、三 酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、 C18:2 )、巨头鲸鱼酸、二十三烷酸、5-羟脯 氨酸；和
(b)将步骤U)的测定结果与参考比较，由此诊断糖尿病易感性。 所述代谢物中的每一种代谢物其本身是此处涉及的疾病易感性的合适 生物标记。然而，包括或由上述组中一组生物标记组成的一组生物标记最 优选通过本发明的方法来测定。 一组生物标记优选由至少2种、至少3种、 至少4种并优选多达全部上述生物标记组成。
如根据本发明的含义，表述"用于诊断的方法"指所述方法基本上由 上述步骤组成或可能包括其他步骤。然而，应理解所述方法在优选的实施 方案中是体外进行的方法，即不在人或动物体上实践。如此处所用诊断指 评估受试者具有此处所指疾病的易感性的可能性，即糖尿病易感性的可能 性。易感性的"^断有时指预后或受试者将发生疾病的可能性的预测。如本 领域技术人员所理解，虽然优选此类评估对待诊断的受试者100%正确，但其通常不是100 %正确。无论如何，所述术语需要受试者中统计学上显
著的部分可以鉴定为具有此处所指疾病的易感性。本领域技术人员可以通 过^f吏用多种众所周知的统计评估工具(例如，置信区间的测定、p值测定、
斯氏t检验、Mann-Whitney检验等等)不用额外费力地来确定所述部分 是否是统计学上显著的。细节见于Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选置信区间为至少50 % 、 至少60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、至少95 % 。 P值优选为0.2、 0.1、 0.05。
本发明的诊断包括相关疾病的易感性或其症状的监测、确认和分类。 监测涉及记录早已确诊的易感性(关于疾病)，或并发症，例如来分析疾病 的#、具体治疗在疾病期间或疾病成功治疗后出现的疾病或并发症iijl 上的影响。确认涉及强化或证实已使用其他指示物或标记物进行的诊断。 分类涉及根据症状的强度或种类将诊断(结果)分配到不同的类别中，例 如在说明书其他地方阐明的糖尿病类型。具体地，可以优选基于下表所示 的代谢物和调控的类型将受试者分为不同的危险组。代谢物生物标记可以 指示具有增加的糖尿病危险的受试者，并归入下表所示的以下危险组空 腹血糖受损(IFG )、糖耐量受损(IGT )或两者均有(IFG& IGT )。因此， 本发明的方法是i貪断受试者是否具有糖尿病易感性或患有IFG、 IGT或 IFG& IGT的方法，该方法基于所附表中列出的与所述增加的危险相关的 代谢物。
如此处所用，术语"糖尿病"指葡萄糖代谢受损的疾病状况。所述损 伤导致高血糖。才艮据世界卫生组织(WHO),可将糖尿病细分为四类。1 型糖尿病由缺乏胰岛素引起。胰岛素是由所谓的胰岛细胞产生。所述细胞 可能被l型糖尿病(la型)中的自身免疫反应破坏。此外，l型糖尿病也 包括自发性变体(lb型)。2型糖尿病由胰岛素抵抗引起。根据目前的分 类，3型糖尿病包含所有其他特定类型的糖尿病。例如，P细胞可能具有 影响胰岛素产生的遗传缺陷，可能遗传引起胰岛素抵抗或胰腺可能被如此 破坏或损伤。此外，激素失调或药物也可以引起3型糖尿病。4型糖尿病可能在长眼期间发生。优选地，此处所用的糖尿病指2型糖尿病。才艮据德 国糖尿病协会，通过空腹状态血糖水平高于110 mg/dl或餐后血糖水平高 于220 mg/dl来诊断糖尿病。进一步优选的诊断技术公开于本说明书其他 地方。糖尿病的其他症状为本领域所熟知并描述于标准医学教科书，如 Stedman或Pschyrembl中。
如此处所用，术语"易感性"指受试者还未曾发生疾病或任何上述疾 病症状或其他诊断标准，然而在将来的指定时间窗(time window,预测窗) 内会有发生疾病的一定可能性。预言窗是根据预测的可能性，受试者应当 发生疾病或病症的时间段。预言窗可以是通过本发明的方法分析后，受试 者的所有剩余生命期限。但是，预言窗优选是待通过本发明的方法分析的 样品获得后的一个月、六个月，或一年、两年、三年、四年、五年或十年 的时间段。具有易感性的受试者发生此处所指疾病的可能性将显著大于给 定受试者群体中糖尿病统计学出现的可能性。优选地，对于个体受试者， 与发生糖尿病易感性相关的可能性是至少30%、至少40%、至少50%、 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%，或相对于给定受 试者群体中发生糖尿病的平均可能性，增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、 5倍或10倍。此处所指的受试者群体意指是相同物种的复数个体受试者， 优选是相同遗传背景或相同种族的复数个体受试者，更优选也是相同年龄 和性别的复数个体受试者。
如此处所用，术语"至少一种代谢物"指单种代谢物或多种代谢物， 即优选至少2、 3、 4、 5、 10、 50、 100、 500、 1,000、 2,000、 3，000、 5,000 或10，000种代谢物。应理解如此处所用的"代谢物"可以是所述代谢物的
至少一个分子，多至代谢物的多个分子，并且多种代谢物指多种化学上不 同的分子，其中对于每一种代谢物而言可能存在至少一个分子，多至多个 分子。本发明的代谢物包括所有种类的有机或无机化学化合物(包括生物 学物质，如生物体包含的那些化合物)。优选地，本发明的代谢物是小分子 化合物。更优选地，在考虑多种代谢物的情况下，所述多种代谢物代表代 谢物组，即生物体、器官、组织或细胞在特定时间和特定条件下所包含的代谢物集合。
代谢物是小分子化合物，如代谢途径中酶的底物、此类途径的中间物 或通过代谢途径获得的产物。代谢途径为本领域所熟知并可在物种间变化。 优选地，所述途径包括至少三羧酸循环、呼吸链、光合作用、光呼吸作用、 糖酵解、糖异生、磷酸己糖途径、氧化戊糖磷酸途径、脂肪酸产生和P氧 化、鸟氨酸循环、氨基酸生物合成途径、蛋白质降解途径如蛋白酶体降解、
氨基酸降解途径、以下物质的生物合成或降解脂类、聚酮化合物(包括 例如黄酮类化合物和异黄酮类化合物)、类异戊二烯(包括例如薛类、固醇 类、类固醇类、类胡萝卜素、叶黄素)、糖类、苯丙素类(phenylpropanoids) 和个汴生物、生物碱(alcaloids )、苯型类(benzenoids )、吲咮类、巧I^M危酸 化合物、p卜啉类、花色素类、激素类、维生素类、辅因子如辅基或电子载 体、木质素、芥子油苷类、嘌呤类、嘧啶类、核苷类、核苷酸类和相关分 子如tRNA、小RNA (miRNA)或mRNA。因此，小分子化合物代j射物 优选包括以下种类的化合物醇类、烷类、烯类、炔烃类、芳香化合物、 酮类、醛类、羧酸类、酯类、胺类、亚胺类、酰胺类、氰化物、氨基酸、 肽、硫醇类(thiols )、硫代酸酯类、磷酸酯类、硫酸酯类、硫醚类、亚砜 类、醚类、或上述化合物的组合或衍生物。代谢物中的小分子可以是正常 细胞功能、器官功能或动物生长、发育或健康所需要的初级代谢物。此夕卜， 小分子代谢物还包含具有基本生态学功能的次级代谢物，例如允许生物体 适应其环境的代谢物。此外，代谢物不局限于所述初级和次级代谢物，还 包括人工小分子化合物。所述人工小分子化合物来自外源提供的小分子， 其为生物体施用或吸收，但不是以上定义的初级或次级代谢物。例如，人 工小分子化合物可以是通过动物代谢途径从药物中获得的代谢产物。此外， 代谢物还包括肽、寡肽、多肽、寡核普酸和多核苷酸，如RNA或DNA。 更优选地，代谢物具有50 Da (道尔顿)至30,000 Da的分子量，最优选小 于30,000 Da、小于20,000 Da、小于15,000 Da、小于10,000 Da、小于8,000 Da、小于7,000 Da、小于6,000 Da、小于5,000 Da、小于4,000 Da、小于 3,000 Da、小于2,000 Da、小于l，000Da、小于500Da、小于300Da、小于200Da、小于100Da。然而，优选代谢物具有至少50 Da的分子量。最 优选地，本发明的代谢物具有50 Da至不超过1,500 Da的分子量。
将理解除上述代谢物或代谢物組外，其他代谢物或其他代谢物组也可 以通过本发明的方法来测定。所述其他代谢物或其组可包括已知与糖尿病 或糖尿病易感性相关的代谢物。优选地，所述其他代谢物是葡萄糖。
一起待测定的其他优选代谢物，即与上述代i射物或代谢物组同时或连 续测定的其他优选代谢物是选自以下的代谢物
(i) 长链饱和脂肪酸，优选二十四烷酸(C24:0 )、三十烷酸(C30:0 )、 或二十三烷酸(C23:0)，
(ii) 多不饱和脂肪酸，优选二十二碳六烯酸(C22:顺式 [4，7，10，13，16，19]6 )、 二十碳五烯酸(C20:顺式[5，8，11，14，17]5)、廿碳四烯 酸(C20:顺式[5，8，11，144)、亚油酸(C18:顺式9，122 )、或亚麻酸(C18: 顺式[9，12，15]3)，
(iii) 氨基酸，优选赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、异 亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、曱硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯 氨酸或谷氨酰胺，
(iv) 抗氧化剂，优选维生素C、辅酶Q10或a-生育酚，
(v) 三羧酸循环代谢物，优选丙酮酸、柠檬酸或苹果酸，
(vi) 鸟氨酸循环代谢物，优选尿素、瓜氨酸、琥珀酸或鸟氨酸，
(vii) 甘露糖、a-酮异己酸、甘油、脂级分或3羟基丁酸，
(viii) 葡萄糖。
本发明所及"长链饱和脂肪酸"优选包括C18至C30脂肪酸，其中数 字"18"和"30"表示脂肪酸链中碳原子的数目。更优选地，它涉及C20 至C30脂肪酸，并且最优选涉及二十四烷酸(C24:0 )、三十烷酸(C30:0 )、 或二十三烷酸(C23:0 )。
如此处所用，"多不饱和脂肪酸"指包含多于一个不饱和碳键的脂肪酸。 本发明优选考虑的多不饱和脂肪酸是C18至C22多不饱和脂肪酸，并且最 优选是二十二碳六烯酸(C22:顺式[4,7，10，13,16，19]6 )、 二十碳五烯酸(C20:顺式[5，8，U，14，175)、廿碳四烯酸(C20:顺式[5，8，11，14]4 )、亚油酸(C18: 顺式[9，122)、或亚麻酸(C18:顺式[9，12，153)。
如此处所用，术语"氨基酸"包括天然发生的M酸及其衍生物。天
优选地，本术语涉及赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸 或谷氨酰胺。
如此处所用，术语"抗氧化剂"包括能防止受试者中氧化作用的化合 物。优选地，所述术语涉及天然发生的代谢物，其可作为受试者细胞中的 辅酶或者是维生素其(包括需要外源供应的那些)。更优选地，本发明的抗 氧化剂是维生素C、辅酶Q10或ot-生育酚。
术语"三羧酸循环代谢物"或"鸟氨酸循环代谢物"涉及在上述众所 周知生物化学转化级联中合成或用作底物的产物、中间物和反应物。这些 产物、中间物或反应物在生物化学标准教科书中有描述并为本领域技术人 员所熟知。优选地，丙酮酸、柠檬酸或苹果酸是三羧酸循环的代谢物。优 选地，尿素、瓜氨酸、琥珀酸或鸟氨酸是此处所及鸟氨酸循环的代谢物。
优选地，才艮据本发明的方法测定一组生物标记。更优选地，所述组由 来自上述(i)至(vii)具体说明的不同代谢物组的生物标记组成。最优选 地，有待测定至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全 部上述(i)至(vii)组中的至少一种代谢物。已发现上述代谢物种类的成 员提供用于诊断糖尿病或糖尿病易感性的支持性生物标记。此外，上述代 谢物种类的组合提供甚至更有价值并可靠的结果。
同样优选地，除了上述支持性代谢物或支持性代谢物组外，测定至少 一种支持性代谢物，其选自以下任何一种3-羟基丁酸、丙氨酸、a-酮异 己酸、a-生育酚、精氨酸、维生素C、天冬酰胺、P-胡萝卜素、胆固醇、 柠檬酸、瓜氨酸、肌酸酐、二十碳五烯酸(C20:顺式[5，8,11，14，175)、叶 酸盐(folate )、葡萄糖、葡萄糖-l-磷酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘油酸、甘 油-3-磷酸、甘氨酸、异亮氨酸、乳酸、亮氨酸、苹果酸、甘露糖、甲硫氨酸、肌醇、鸟氨酸、十六烷酸、磷脂类、孕烯醇酮硫酸盐、十八烷酸、琥 珀酸、苏糖酸、苏氨酸、三酰基甘油酯类、色氨酸、尿酸和缬氨酸。
更优选地，至少一种支持性代谢物选自色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、 十六烷酸、二十碳三烯酸、甘油磷酸酯、异亮氨酸、二十碳三烯酸、色氨 酸、二十四烷酸、亚油酸、丝氨酸、酪氨酸、亚油酸、孕烯醇酮石克酸盐、 天冬氨酸、廿碳四烯酸和琥珀酸。最优选地，所述情况中的受试者是雄性。
更优选地，至少一种支持性代谢物选自丙氨酸、十六烷酸、异亮氨 酸、二十碳三烯酸、尿酸、十八烷酸和丝氨酸。最优选地，所述情况中的
受试者是雌性。
所述代谢物的每一种本身成为此处所指疾病易感性的合适的支持性生 物标记。然而，最优选地，包括或由上述組中的一组生物标记组成的一组 支持性生物标记待通过本发明的方法来测定。 一组生物标记优选包括至少 2种、至少3种、至少4种并优选最多全部上述支持性生物标记。
优选地，之前所指的支持性代谢物也可与此处其他地方具体说明的合 适的参考结果比较。所述比较的结果对寻找受试者是否具有此处所指疾病 的易感性将是进一步支持性的。优选的参考结果、相对量的改变值和所述 调节类型的说明见于下文所附实施例中。
如此处所用，术语"试验样品"指待用于通过本发明的方法诊断糖尿 病易感性的样品。所述试验样品是生物学样品。生物来源的样品(即生物 学样品)通常包含多种代谢物。待用于本发明方法的优选试验样品是来自 体液，优选来自血液、血浆、血清、淋巴、汗、唾液、眼泪、精液、阴道 液体、粪便、尿或脑脊液的样品，或来自例如通过活体解剖来自细胞、组 织或器官的样品。这也包括包含亚细胞区室或细胞器(如线粒体、高尔基 体网络或过氧化物酶体)的样品。此外，生物学样品也包括气体样品，如 生物体的挥发物。生物学样品来自如此处其他地方具体说明的受试者。用 于获得上述不同类型生物学样品的技术为本领域所熟知。例如，当例如活 体解剖获得组织或器官样品时通过血液采集获得血液样品。
优选地在上述样品用于本发明方法前将其预处理。如下文更详细地描述，所述预处理可包,放或分离化合物，或去除多余物质或废物所需要 的处理。合适的技术包含离心、萃取、分馏、纯化和/或富集化合物。此夕卜，
如果气相层析偶联质i普用于本发明的方法，将需要在所述气相层析前衍生 化(derivatize)化合物。合适并必要的预处理依赖于进行本发明方法的工 具并为本领域技术人员所熟知。如前描述的预处理的样品也包含在如本发 明所用的术语"样品"中。
如此处所用，术语"受试者，，指动物，优选指哺乳动物如小鼠、大鼠、 绵羊、狗、猫、马、猴子或奶牛，并优选指人。应用本发明的方法可以诊 断的其他动物为鸟类或爬行动物。如此处所用的，怀疑患有糖尿病或怀疑
具有其易感性的受试者优选指显示指示糖尿病的症状或临床病征或参数的 受试者。然而，所述术语也涉及表面上健康的受试者，即没有显示任何上 述症状、临床病征或参数的受试者。表面上健康的受试者可通过本发明的 方法进行研究，作为预防护理的措施或用于群体篩选目的。
如此处所用，术语"测定所述至少一种代谢物"指测定此处所指样品 包含的至少 一种代谢物的至少 一种性能特征。根据本发明的性能特征是表 现代谢物的物理和/或化学性质(包括生物化学性质)的特征。此类性质包 括，例如分子量、粘性、密度、电荷、自旋、光学活性、颜色、荧光、化 学发光、元素组分、化学结构、与其他化合物反应的能力、在生物读出系 统中诱导响应(例如报道基因的诱导)的能力等等。所述性质的值可用作 性能特征并可通过本领域技术人员所熟知的技术来测定。此外，性能特征 可以是任何性质，其通过标准操作(例如数学计算如乘法、除法或对数计 算)来自代谢物的物理和/或化学性质的值。最优选地，所述至少一种性能 特征允许测定和/或化学鉴定所述至少 一种代谢物。
试验样品所包含的至少一种代谢物可根据本发明定量或定性地来测 定。对于定性测定，代谢物的存在或缺少将通过合适的技术来测定。此夕卜， 定性测定可优选包括代谢物化学结构或组成的测定。对于定量测定，基于 上文所指的一种或多种性能特征的测定值，优选测定样品中存在的至少一种代谢物的精确量或者至少一种代谢物的相对量。在不能或不将测定代谢 物精确量的情况下可测定相对量。在所述情况下，可以测定相对于所述代 谢物以第二个量包含的第二个样品，代谢物存在的量增加了还是减少了 。 定量分析代谢物因此有时也包括称作半定量分析代谢物。
此外，如本发明的方法所用的测定优选包括在前面所指分析步骤之前 使用化合物的分离步骤。优选地，所述化合物分离步骤产生样品包含的代 谢物的时间分辨分离。本发明优选使用的用于分离的合适技术因此包括所
有的层析分离技术，如液相层析(LC)、高效液相层析(HPLC)、气相层 析(GC)、薄层层析、大小排阻或亲和层析。这些技术为本领域所熟知并 可为本领域技术人员所用而不需要额外的劳动。最优选地，LC和/或GC 是本发明的方法待考虑的层析技术。用于代谢物此类测定的合适装置为本 领域所熟知。优选地，层析用于特定气相层析质谱(GC-MS )、液相层析 质谱(LC-MS)、直接输注质谱或傅里叶变换离子回旋共振质谱 (FT-ICR-MS )、毛细管电泳质i普(CE-MS )、高效液相层析偶联质i普 (HPLC-MS )、四极杆质镨、任何连续偶联质谱，如MS-MS或MS-MS-MS, 电感耦合等离子体质i普(ICP-MS)、热解质谱(Py-MS)、离子迁移质谱或 飞行时间质镨(TOF)。最优选地，使用如下文详细描述的LC-MS和/或 GC國MS。所述4支术7^开于例如Mssen， Journal of Chromatography A， 703， 1995: 37-57、US 4,540,884或US 5，397，894,其公开内容在此引入作为参考。 作为备选或除质语技术外，以下技术可用于化合物的测定核磁共振 (NMR )、磁共振成象(MRI )、傅里叶变换红外分析(FT-IR )、紫外(UV) 光镨、折射率(RI)、荧光检测、放射化学检测、电化学检测、光散射(LS)、 ^L拉曼光i普学或火焰电离检测(flame ionisation detection, FID )。这些 技术为本领域技术人员所熟知并可使用而不需要额外的劳动。本发明的方
法将优选通过自动装置辅助。例如，样品加工或预处理可通过机器人技术 得以自动化。数据处理和比较优选由合适的计算机程序和数据库辅助。上 文描述的自动装置允许在高通量方法中使用本发明的方法。
此外，也可以通过特定化学或生物学试验来测定所述至少 一种代谢物。所述试验将包含允许特异性检测样品中所述至少 一种代谢物的工具。优选 地，所述工具能够特异性识别代谢物的化学结构，或基于其与其他化合物 反应的能力或其在生物学读出系统中诱导响应(例如报道基因的诱导)的 能力特异性鉴定代谢物。能够特异性识别代谢物的化学结构的工具优选为 抗体，或特异地与化学结构如受体或酶相互作用的其他蛋白质。例如可以 使用代谢物作为抗原通过本领域所熟知的方法获得特异抗体。如此处所指 的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，及其片段，如能够结合抗原或半抗
原的Fv、 Fab和F(ab)2片段。本发明也包括人源化的杂交抗体，其中显示 想要的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组 合。此外，还包括的是单链抗体。供体序列通常至少包括供体的抗原结合 氨基酸残基，但也可包含供体抗体的其他结构和/或功能相关的氨基酸残 基。此类杂合体可以通过本领域所熟知的几种方法来制备。能够特异性识 别代谢物的合适的蛋白质优选为酶，其参与所述代谢物的代谢转化。所述 酶可以^使用代谢物作为底物或可以转化底物成为代谢物。此外，所述抗体 可以用作产生特异性识别代谢物的寡肽的基础。这些寡肽将例如包含酶的 结合结构域或接受所述代谢物的袋。基于合适的抗体和/或酶的试验可以是 RIA(放射免疫测定)、ELISA (酶联免疫吸附测定)、夹层酶免疫试验、 电化学发光夹层免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定
(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay, DELFIA )或固相 免疫试验。此外，代谢物也可基于它与其他化合物反应的能力(即通过特 异的化学反应)得到鉴定。合适的反应为本领域所熟知，并优选地包括酶 促反应(例如对于甘露糖，Pitkanen E， Pitkanen O， Uotila L.; Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1997年10月;35(10):761-6或对于维生素C ， Winnie Lee， Susan M. Roberts和Robert F. Labbe; Clinical Chemistry 43: 154-157， 1997 )、 i^分光光度测定方法(BN La Du, RR Howell, PJ Michael和EK Sober; Pediatrics, 1963年1月，39國46，第31巻，第1期)、荧光分光光度法
(S腿i T， Umeda Y, Kishi Y， Takahashi K， Kakimoto F.; Clin Chim Acta. 1976年12月1日；73(2):233画9 )和荧光；化学发光(J.J. Thiele， H.J.Freisleben， J. Fuchs和F.R. Ochsendorf; Human Reproduction，第 10巻， 第1期，110-115页，1995)。可以4吏用其他检测方法如毛细管电泳(Hubert A. Carchon和Jaak Jaeken; Clinical Chemistry 47: 1319-1321， 2001 )和比 色法(KyawA;ClinChimActa. 1978年6月；86(2):153-7)。另外，代谢物 可因其在生物学读出系统中诱导响应的能力而得到测定。生物学响应将检 测为表示样品中包含的代谢物的存在和/或量的读出。生物学响应可以是例 如，基因表达的诱导，或细胞或生物体的表型响应。
另外，应理解根据用于测定所述至少一种代谢物的技术，将被检测的 分析物可以是生理发生代谢物(即受试者体内存在的代谢物)的衍生物。 此类分析物可能因为样品制备或检测工具而产生。认为此处所指的化合物 是分析物。然而，如上阐明，这些分析物将代表以定性方式和定量方式存 在的代谢物。此外，应理解对于多数代谢物，代谢物与分析物相同。
术语"参考"指结果，即可与糖尿病易感性相关的至少一种代谢物的 性能特征数据。此类参考结果优选从已知具有糖尿病易感性的受试者样品 中获得。参考结果可以通过应用本发明的方法来获得。或者，但也优选的， 参考结果可以从已知不具有糖尿病易感性的受试者(即将来不会发生糖尿 病，并更优选将来也不会发生其他疾病)样品中获得。此外，对(包含待 研究的受试者)个体的群体的代谢物的相对或绝对量而言，参考也可优选 为可计算参考，最优选为平均数或中位数。如此处其他地方具体说明的， 测定群体中所述个体代谢物的绝对或相对量。怎样计算合适的参考值，平
均数或中位数优选为本领域所熟知。前面所指的受试者群体包含多数受试 者，优选至少5、 10、 50、 100、 l，OOO或10,000个受试者。应理解通过本 发明的方法待诊断的受试者和所述多数受试者的受试者是相同种类。
更优选地，参考结果即所述至少 一种代谢物的至少 一个性能特征值将 储存在合适的数据存储介质如数据库中，并因此也可用于进一步的诊断。 因为一旦证实(将来)对应参考样品来自的受试者(的确)发生了糖尿病， 就可以在数据库中鉴定到合适的参考结果，这也允许有效地诊断疾病的易 感性。与人糖尿病易感性相关的优选参考结果是示于附随实施例的表中的那些结果。
术语"比较"指评估上文中详细描述的测定结果(即所述至少一种代 谢物的定性或定量测定结果)是否与参考结果相同或相似或与之不同。
在从已知具有糖尿病易感性的受试者中获得参考结果的情况下，可以 基于从试验样品中获得的试验结果与上述参考结果的同一性或相似性程 度，即基于关于至少一种代谢物的相同或相似定性或定量组成来诊断所述 易感性。如果性能特征值和在定量测定情况下的强度值相同，试样样品的 结果和参考结果相同。如果性能特征值相同，但强度值不同，所述结果相
似。此差异优选并不显著并且特征在于强度值在至少1到99百分位数、5 到95百分位数、10到卯百分位数、20到80百分位数、30到70百分位 数、40到60百分位数的参考值区间内，50、 60、 70、 80、 90或95百分位
数的参考值。
在从已知不具有糖尿病易感性的受试者或受试者群体中获得参考结果 的情况下，可以基于从试验样品中获得的试验结果与上述参考结果的差异， 即基于关于至少一种代谢物的定性或定量组成中的差异来诊断所述易感 性。如果使用如上文详细说明的可计算参考，应用相同的计算。差异可以
是代谢物绝对或相对量的增加(有时称作代谢物上调；亦参阅实施例)或 代谢物所述量的减少或无可检测的量(有时称作代谢物下调；亦参阅实施
例)。优选地，相对或绝对量的差异是显著的，即在45到55百分位数、40 到60百分位数、30到70百分位数、20到80百分位数、10到90百分位 数、5到95百分位数的参考值区间外。对于在该说明书其他地方涉及的特 异代谢物，相对量改变的优选值(即"倍数"变化)或改变类型(即导致 更高或更低相对量和/或绝对量的"上"调或"下"调)示于下文所附表中。 如果在所述表中说明指定代谢物在受试者中是"上调的"，相对和/或绝对 量将增加，如果其为"下调的"，代谢物的相对和/或绝对量将减少。此外，
"倍数，，变化表示增加或减少的程度，例如，2倍的增加指与参考相比， 所述量是代谢物量的两倍。
因此，在优选实施方案中的本发明方法包括来自已知具有糖尿病易感性的受试者或组的参考。最优选地，试验样品和所述参考的相同或相似结 果(即所述至少一种代谢物相似的相对或绝对量)在该情况下指示糖尿病 易感性。在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考来自已知不具 有糖尿病易感性的受试者或组，或者所述参考是可计算参考。最优选地， 至少 一种代谢物的缺少，或与参考样品比较时在试验样品中优选显著不同 的量(即观察到绝对或相对量的显著差异)在此情况下指示糖尿病易感性。 该比较优选由自动装置辅助。例如，可以使用包含用于比较两个不同 数据组的算法的合适的计算机程序(例如，包含性能特征值的数据组)。此 类计算机程序和算法为本领域所熟知。尽管如上述，也可以手动进行比较。
用于测定至少 一种代谢物的上述方法可以落实到装置中。如此处所用 的装置至少包含上述工具。此外，所述装置还优选包含用于比较和评估至 少 一种代谢物的 一种或多种待检测性能特征和同样优选测定信号强度的工 具。装置的工具优选彼此间有效地连接。怎样以可操作方式连接所述工具 依赖于装置中包括的工具类型。例如，在用于自动定性或定量测定代谢物 的工具应用的地方，通过所述自动操作工具获得的数据可以通过例如计算 机程序进行加工以^t于诊断。优选地，在此类情况下，工具包含在单个装 置中。所述装置因此可以包括用于代谢物的分析设备和加工所得数据用于 诊断的计算机i殳备。或者，在工具如试纸条用于测定代谢物的地方，用于 诊断的工具可包含对照条或表，其将测定的结果数据定位为已知为伴随糖
尿病易感性的结果数据或指示如上讨论的不具有此类易感性的受试者的那 些结果数据。优选装置为在没有专业临床医师特殊知识的情况下可应用的 那些装置，例如，仅需要装载样品的试纸条或电子装置。
或者，用于测定至少 一种代谢物的方法可以落实到包含若干装置的系 统中，优选地所述装置彼此间有效连接。尤其是，所述工具必须以一种方 式连接以允许实施如上详细描述的本发明的方法。因此，如此处所用，有 效地连接优选指在功能上连接。根据待用于本发明系统的工具，所述工具
通过允许数据在所述工具(例如，玻璃纤维电缆和用于高通i^:据传送的 其他电缆)间传送的方式将每一工具与其他工具连接，以在功能上进行连接。然而，本发明也考虑工具间的无线数据传送，例如通过LAN (Wireless LAN，W-LAN)。优选的系统包含用于测定代谢物的工具。如此处所用的用 于测定代谢物的工具包括用于分离代谢物的工具如层析装置，和代谢物测 定工具如质谱装置。上文已详细描述了合适的装置。待用于本发明系统中 化合物分离的优选工具包括层析装置，更优选液相层析、HPLC和/或气相 层析装置。用于化合物测定的优选装置包含质i普装置，更优选地，GC-MS、 LC-MS、直接输注质镨、FT-ICR-MS、 CE-MS、 HPLC-MS、四极杆质镨、 连续偶^t谱(包括MS-MS或MS-MS-MS )、 ICP-MS、 Py-MS或TOF。 分离和测定工具优选彼此偶联。最优选地，如在说明书其他地方详细描述， 在本发明系统中使用LC-MS和/或GC-MS。还包含的是比较和/或分析从 测定代谢物工具中获得的结果的工具。用于比较和/或分析的工具可包含至 少 一个数据库和用于比较结果的执行计算机程序。上述系统和装置的优选 实施方案也在下文中有详细描述。
有利地，根据本发明已发现至少一种上述代谢物将成为糖尿病易感性 的合适的生物标记。应用这些代谢物作为生物标记允许快速、可靠并节省 成本的糖尿病易感性诊断。此外，所述方法可通过如本说明书其他地方描 述的自动装置辅助，并因此允许高通量篩选处于患有糖尿病危险中的受试 者。因此，本发明的方法可以辅助用于糖尿病预防的卫生计划并可用于监 测成功的糖尿病预防治疗或预防糖尿病的其他措施(包括营养饮食)。此外， 此处所指的代谢物或代谢物组合可以以节省时间和成本的方式通过该说明 书中描述的代谢物傳技术来同时测定。此外，本发明的方法允许评估受试 者是或成为某个糖尿病危险组(即，IFG、 IGT或IFG& IGT)的成员的 危险。IFG和IGT报导的流行(率)基于种族、年龄和性别分布，大幅变 化于5至26%之间。危险组IFG和IGT均预期在不久的将来增加。IFG 和IGT危险组两者据报导在3-5年内均有25 %的糖尿病发病率的增加，50 %维持他们不正常的血糖状况，以及25%回复为正常的葡萄糖水平。据长 期观察，具有IFG或IGT的个体大部分似乎发生糖尿病。与具有IFG或 IGT的受试者相比，具有IFG和IGT (IFG& IGT )的个体具有大约两倍发生糖尿病的几率(Nathan 2007， Diabetes Care 30(3): 753-759)。
上文对术语的说明和解释因此应用于下文具体说明的其他实施方案。 在本发明方法的优选实施方案中，所述至少一种代谢物选自二酰基
甘油酯(C18:l、 C18:2)和三酰基甘油酯(C16:0、 C18:2、 C18:2 )。
所述代谢物的每一种通过其自身成为此处所指易感性的合适的生物标 记。然而，最优选地，包括上述组中一种生物标记的一组生物标记通过本 发明的方法来测定。 一组生物标记优选由至少2种、至少3种、至少4种 并优选地多达全部上述生物标记组成。此外，在本发明的基本研究中已发 现上述组的代谢物在男性个体中是糖尿病易感性的特别适当的生物标记。 因此，根据本发明待诊断的受试者是上述优选实施方案的受试者，更优选 是男性受试者。
如上描述，在本发明方法的优选实施方案中，所述测定至少一种代谢 物包含质谱分析法(MS)。如此处所用的质谱分析法包括允许测定分子量
(即质量)，或相对于化合物(即待根据本发明测定的代谢物)的质量变量。 优选地，如此处所用的质谱分析法涉及GC-MS、 LC-MS、直接输注质谱 分析、FT-ICR-MS、 CE-MS、 HPLC-MS、四极杆质i普分析、任何连续偶 联质谱分析如MS-MS或MS-MS-MS 、 ICP-MS、 Py-MS或TOF或使用上 述技术的组合方法。怎样应用这些技术为本领域技术人员所熟知。此外， 合适的装置是市售的。更优选地，如此处所用的质谱分析涉及LC-MS和/ 或GC-MS，即涉及有效连接到前面层析分离步骤的质i普分析。更优选地， 如此处所用的质i普分析包括四极杆MS。更优选地，所述四极杆MS如下 进行a)选择通过质语仪的第一个分析四极杆电离产生的质量/电荷系数
(m/z)， b)通过在充满轰击气体并作为轰击小室起作用的另一后继四极 杆中应用加速电压将步骤a)中所选的离子片段化，选择通过步骤b)另 一后继四极杆片段化处理产生的离子的质量/电荷系数，其中方法的步骤a) 至c)进行至少一次并且存在于物质的混合物中的所有离子的质量/电荷系 数的分析作为电离处理的结果，其中所述四极杆充满轰击气体，但在分析 过程中不应用加速电压。本发明使用的所述最优选质镨分析的细节可见于更优选地，所述质镨分析是液相层析(LC ) MS和/或气相层析(GC)MS。
如此处所用的液相层析指允许在液相或超临界相中分离化合物(即代 谢物)的所有技术。液相层析的特征在于流动相中的化合物经过静止相。 当化合物以不同的速度经过静止相时，因为每一个体化合物具有自己的特 异滞留时间(即化合物经过系统所需要的时间)，它们得以及时分离。如此 处所用的液相层析也包括HPLC。用于液相层析的装置是市售的，例如来 自Agilent Technologies, USA。才艮据本发明应用的气相层析原则上与液相 层析在操作上是可比较的。然而，不同于在经过静止相的化合物(即代谢 物)存在于液体流动相中，所述化合物将存在于气体体积中。化合物经过 柱(可包含作为静止相的固体支持物质)或器壁(其可作为静止相或被静 止相包被)。此外，每一化合物具有经过柱所需要的特定时间。此外，在气 相层析的情况下，优选考虑所述化合物在气相层析前进行衍生化。用于衍 生化的合适的技术为本领域所熟知。优选地，根据本发明的衍生化优选涉 及极性化合物的甲氧基化作用(methoxymation )和三甲硅烷基化作用和 非极性(即亲脂的)化合物的转甲基化作用、甲氧基化作用和三甲硅烷基 化作用。
此外，本发明涉及数据集合，其包含指示糖尿病易感性的至少一种代 谢物的特征值，所述代谢物选自上文提及组中的任何一组。
术语"数据集合"指在物理上和/或逻辑上集合的数据集合。因此，数 据集合可落实到单个数据存储介质中或彼此有效连接的物理上分离的数据 存储介质中。优选地，数据集合落实到数据库中。因此，如此处所用的数 据库包含在合适的存储介质上的数据集合。此外，数据库优选还包含数据 库管理系统。数据库管理系统优选为基于因特网的分级数据库管理系统或 面对对象数据库管理系统。此外，数据库可以是联合数据库或集成数据库。 更优选地，数据库将落实为分布式(联合)系统，例如Client-Server-System。 更优选地，构造数据库以允许搜索算法来比较试验数据组和包含数据集合的数据组。尤其是，通过使用此类算法，可以搜索数据库(即查询搜索) 得到指示糖尿病易感性的相似或相同数据组。因此，如果可以在数据集合 中鉴定到相同的或相似的数据组，试验数据组将与糖尿病易感性相关。结 果，从数据集合中获得的信息可以基于从受试者获得的试验数据组用于诊 断糖尿病易感性。更优选地，数据集合包含上文记载的任何一组包含的所 有代谢物的特征值。
按照上述内容，本发明包括数据存储介质，其包含上述数据集合。
如此处所用，术语"数据存储介质"包括基于单个物理实体如CD、 CD-ROM、硬盘、光存储介质或磁盘的数据存储介质。此外，所述术语还 包括由物理分离实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供上述 数据集合的方式，优选以查询搜索的合适方式彼此有效连接。
本发明也涉及系统，其包含
(a) 比较样品代谢物的特征值的工具，其有效连接到
(b) 如上描述的数据存储介质。
如此处所用，术语"系统"涉及彼此有效连接的不同工具。所述工具 可落实到单个装置中或可以是彼此有效连接的物理上分离的装置。用于比 较代谢物特征值的工具优选基于用于上述比较的算法而进行运作。数据存 储介质优选包含上述数据集合或数据库，其中存储数据组的每一组指示糖 尿病易感性。因此，本发明的系统允许鉴定存储在数据存储介质中的数据 集合是否包含试验数据组。结果，本发明的系统可用作诊断糖尿病易感性 的诊断工具。
在系统的优选实施方案中，包含用于测定样品代谢物特征值的工具。 术语"用于测定代谢物特征值的工具"优选涉及用于测定代谢物的上
述装置，如质i普分析装置、NMR装置，或进行代谢物化学或生物测定的装置。
此外，本发明涉及诊断工具，其包含用于测定选自上述提及组中任何
一组的至少一种^a谢物的工具。
术语"诊断工具，，优选涉及如在说明书的其他地方中详细说明的诊断装置、系统，或生物学或化学测定。
表述"用于测定至少一种代谢物的工具"指能够特异识别代谢物的装
置或物质。合适的装置可以是光镨测定装置如质i普、NMR装置或用于进 行代谢物化学或生物学测定的装置。合适的物质可以是特异检测代谢物的 化合物。如此处所用的检测可以是两步方法，即化合物首先特异性结合到 待检测的代谢物上并随后产生可检测信号，例如荧光信号、化学发光信号、 放射信号等等。对于可检测信号的产生，可能需要其他化合物，其全部包 含在术语"用于测定至少一种代谢物的工具"中。在说明书中其他地方详 细描述了特异性结合到代谢物上的化合物，并且其优选包括酶、抗体、配 体、受体或其他生物学分子或特异性结合到代谢物上的化学品。
另外，本发明涉及诊断组合物，其包含选自上文涉及组中任何一组的 至少一种代谢物。
选自上述组中任何一组的至少一种代谢物将作为生物标记，即受试者 危险状态的指示分子，即糖尿病易感性的指示分子。因此，代谢物分子自 身可优选通过此处涉及的工具，根据显色或检测作为诊断组合物。因此， 指示本发明的代谢物存在的诊断组合物物理上也可包含所述生物标记，例 如待检测的抗体和代谢物的复合物可作为诊断组合物。因此，所述诊断组 合物可进一步包含用于检测该说明书中其他地方具体说明的代谢物的工 具。或者，如果使用检测工具如基于MS或NMR的技术设备，作为危险 状态指示剂的分子种类将是待研究的试验样品包含的至少 一种代谢物。因 此，本发明涉及的至少一种代谢物自身因其鉴定为生物标记而作为诊断组 合物。
最后，本发明涉及至少一种代谢物的用途，或用于其测定的工具用于 制备诊断装置或用于诊断糖尿病易感性的组合物，其中所述至少一种代谢 物选自上文所涉及组中的任何一组。
如上文早已明确，所述代谢物的每一种自身是此处所指疾病易感性的 合适的生物标记。然而，最优选地，包括上迷组中任何一组生物标记的一 组生物标记通过本发明的方法测定。 一组生物标记优选由至少2种、至少3种、至少4种并优选多达全部上述生物标记组成。
的其特定公开内容一并引入作为参考: '' 本发明现在将通过以下实施例来阐明，所述实施例不旨在限定或限制 本发明的范围。
实施例1:测定代谢物
志愿者被告知关于计划检查的内容。实验方案由Dife (德国人体营养 研究所)伦理委员会批准并且给予所有受试者书面知情同意书。然后，测 量人体测量值和内膜中层厚度。经这些检查后，利用75g葡萄糖进行口服 葡萄糖耐量测试(OGTT)。在0、 30、 60和120分钟采血样。志愿者通过 WHO和ADA的标准进行分类。通过加入EDTA作为抗凝血剂并随后离 心从全血中获得血浆。
如下描述制备样品并进行LCMS和GCMS分析
以以下方式制备样品通过沉淀从血浆中分离蛋白质。加入水及乙醇 和二氯甲烷(dichlormethan )的混合物后，剩余样品进4亍分级(fraction) 成为水极性相和有机亲脂相。
对于脂提取物的transmethanolysis，将140 氯仿、37 pl盐酸(在水 中，为37wt % )、 320 pl甲醇和20 jil曱苯的混合物加入到蒸浓的提取物中。 紧密密封小管并在100。C振荡加热2小时。随后将溶液蒸发至干燥。将残 余彻底干燥。
通过与紧密密封小管中的甲氧胺盐酸盐(methoxyamine hydrochloride, p比咬中20 mg/ml， 100 pl， 60。C， 1.5小时)反应进行羰基 的甲氧基化作用(methoximation )。作为时间标准，加入20 pl奇数直链 脂肪酸溶液(3/7 (v/v)吡勿甲苯中，7到25碳原子脂肪酸各0.3 mg/mL 和27、 29和31碳原子脂肪酸各0.6mg/mL的溶液)。最后，利用100 pl N 甲基-N-(三曱代甲硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)再次在紧密密封 的小管中60°C进行30分钟衍生化作用。注射进GC前的终体积是220 pl。
对于极性相，所述衍生化作用以以下方式进行通过与紧密密封小管中的甲氧胺盐酸盐(吡啶中20 mg/ml， 50^1， 60。C， 1.5小时)反应进行 羰基的甲氧基化作用。作为时间标准，加入10 jil奇数直链脂肪酸溶液(3/7 (v/v) P比勺甲苯中，7到25碳原子脂肪酸各0.3 mg/mL和27、 29和31 碳原子脂肪酸各0.6mg/mL的溶液每)。最后，衍生化作用利用50 pl N甲 基-N-(三甲代甲硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)再次在紧密密封的 小管中60°C进行30分钟。注射进GC前的终体积是110 pl。
GC-MS系统由偶联到Agilent 5973 MSD的Agilent 6890 GC组成。自 动采样器是来自CTC的CompiPal或GCPal。
对于所述分析，根据来自相分离步骤的分析样品材料和级分，使用具 有不同多甲基珪氧烷静止相(含有0%至35%的芳族部分)的常见商业化 毛细管分离柱(30 m x 0,25 mm x 0,25 pm )(例如，DB-lms， HP隱5ms， DB-XLB， DB-35ms， Agilent Technologies )。无分流(splitless )地注射高达 1 的终体积并且烘箱温度程序根据样品材料和相分离步骤的级分以不 同的加热速率始于70。C并止于340。C，以在每一分析物峰中实现足够的层 析分离和扫描次数。此外，RTL(保留时间锁定，Agilent Technologies) 用作分析和常规GC-MS标准条件，例如名义上1到1.7 ml/分钟的恒流并 且氦作为流动相气体，通过70 eV电子轰击完成离子化作用，以2.5到3 扫描/秒的扫描速率和标准的调准条件在15到600的m/z范围内扫描。
HPLC画MS系统由偶联API 4000质谱仪(Applied Biosystem/MDS SCIEX， Toronto,加拿大)的Agilent 1100 LC系统(Agilent Technologies, Waldbronn,德国)组成。HPLC在具有C18静止相(例如，GROM ODS 7 pH， Thermo Betasil C18 )的市售反相分离柱上进行。注射高达10pL的 终样品体积并使用曱醇/水/甲酸或乙腈/水/甲酸梯度的梯度洗脱以200 pL/ 分钟的流速进行分离。
以阳性模式通过电喷雾离子化作用对非极性级分进行质谱分析，并使 用多重反应监测(MRM )方式和100 - 1000 amu的全扫描以阴性方式对 极性级分进行质i普分析。
实施例2:数据评估与集中的血浆参考一起，对危险受试者(具有发生糖尿病高危险的受
试者；"IFG": IFG阳性的非糖尿病受试者、"IGT，，: IGT阳性的非糖尿 病受试者，或IFG阳性和IGT阳性的非糖尿病受试者)和对照受试者的 全部血浆样品进行GC-MS和LC-MS测量。对于每一测量批次，计算单 个受试者的相对信号比率。
通过代谢物信号比率的线性建模来测定危险特异性代谢物，所述线性建才莫 是通过对混淆的年龄和BMI (体重指数)因子和并入的两种不同性别校正 三重危险因子(水平IFG、 IGT、 IFG&IGT):首先产生上述因子的线 性模型，其次通过t-统计估测评估的作用，再次，仅选择关于危险因子水 平以及性别和危险因子水平间的t-统计p-值0.05的代谢物。此外，测定 每一代谢物的调节类型，"上调，，是相对于对照各危险水平增加的几率>1， 且"下调"是相对于对照水平增加的几率<1。
以下表1至表5给出了数据评估的结果。表1和表2显示尚未曾报导 过的糖尿病患者的代谢物结果。表3至表5涉及的代谢物已对糖尿病患者 描述。表l和表3列出有关主要作用"危险"显著的代谢物，主要作用"危 险"具体为各个显著因子IFG、 IGT和IFG&IGT的水平(t-统计)。表2、 4和表5列出有关危险和性别相互作用显著的代谢物，即在对照和危险受 试者之间显示性别特异性不同调节的代谢物。表中给出的结果根据它们作 为糖尿病易感性生物标记的潜力和效力而分类。也说明了观察到的调节类 型。"上调"指代^射物的绝对量或相对量增加，而"下调"指所述绝对量或 相对量的减少或甚至缺少可检测量的代谢物。与糖尿病特别强烈相关的代 谢物细分为通过表中分界线指示的组。此外，表中指出危险组，即IFG、 IGT或IFG&IGT。
表1:总体结果。在2型糖尿病危险组(IFG、 IGT和IFG&IGT)和对照 之间显著不同(pO.05)(主要作用"危险，，显著，即在男性和女性中相同 的调节类型("上调"、"下调"))的代谢物。通过p-值分类代谢物。[IFG = 空腹血糖受损；IGT-葡萄糖耐量受损；IFG&IGT:具有IFG和IGT的患
者代谢物调节危险—组
隐黄质下调IGT
2-羟基-十六烷酸上调IFG
三酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、C18:2)上调IGT
巨头鲸鱼酸上调IGT
二十三烷酸下调IFG&IGT
5-羟脯氨酸上调IFG
表2:在男性对照和来自糖尿病危险组的男性患者之间明确不同的代谢 物。关于危险-性别相互作用，代谢物显著不同(p〈0,05),即，关于2型 糖尿病(IFG、 IGT和IFG&IGT)危险和对照，在男性和女性之间不同 调节。通过p-值分类代谢物。[IFG-空腹血糖受损；IGT-葡萄糖耐量受 损；IFG&IGT:具有IFG和IGT的患者]
代谢物 _ _调节一男性危险一组
二酰基甘油酯(C18:1、 C18:2) 下调 IGT
三酰基甘油酯(C16:0、 C18:2、 C18:2)下调 IGT 三酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、 C18:2)下调 IFG
表3:总体结果。在2型糖尿病危险组(IFG、 IGT和IFG&IGT)和对照 之间显著不同(p<0.05)(主要作用"危险"显著，即在男性和女性中相同 的调节类型("上调"、"下调"))的代谢物。通过p-值分类代谢物。[IFG =空腹血糖受损；IGT:葡萄糖耐量受损；IFG&IGT:具有IFG和IGT的 患者I
代谢物 调节 危险组
乳酸
a-酮异己酸
葡萄糖
甲硫氨酸
甘露糖
3-羟基丁酸
IFG IGT
IFG&IGT IGT
IFG&IGT IGT
周罔同周周周
上下上下上上上调 IGT
上调 IFG
上调 IFG
卜素 下调 IFG&IGT
C 上调 IFG&IGT
下调 IGT
甘油酯类 下调 IFG
上调 IGT
磷脂类 上调 IGT
肌酸酐 下调 IGT
谷氨酸 上调 IFG
a-酮异己酸 下调 IFG&IGT
三酰基甘油酯 上调 IGT
缬氨酸 上调 IGT
苹果酸 上调 IFG
a-酮异己酸 下调 IFG
异亮氨酸 上调 IGT
琥珀酸 上调 IFG
葡萄糖-l-磷酸 上调 IFG&IGT
缬氨酸 上调 IFG&IGT
二十碳五烯酸(C20:顺[5，8，ll，14，175)下调 IFG&IGT
磷脂类 上调 IFG
尿酸 上调 IFG&IGT
柠檬酸 上调 IGT
天冬酰胺 下调 IFG&IGT
曱硫氨酸 下调 IFG
谷氨酰胺 下调 IGT
十六烷酸 上调 IGT
色氨酸 下调 IFG&IGT
丙氨酸 上调 IGT
谷氨酸 上调 IGT
瓜氨酸 下调 IGT
胆固醇 下调 IFG&IGT
苏氨酸 下调 IGT
鸟氨酸 上调 IFG
眠 酸萝素酸基
氣酸糖胡生氨酰酸
亮尿苏F维甘三乳精氨酸下调IGT
甘露糖上调IFG
3-羟基丁酸上调IFG&IGT
谷氨酰胺下调IFG
孕烯醇酮硫酸盐上调IFG&IGT
甘油酸上调IGT
叶酸盐上调IFG
苹果酸上调IGT
P-胡萝卜素下调IFG
亮氨酸上调IFG
谷氨酰胺下调IFG&IGT
a-生育酚上调IFG&IGT
肌醇上调IFG
十八烷酸上调IGT
甘油-3-磷酸上调IFG
P-胡萝卜素下调IGT
表4:在男性对照和来自糖尿病危险组的男性患者之间明确不同的代谢物。 关于危险-性别相互作用，代谢物显著不同(p〈0，05)，即，关于2型糖尿 病(IFG、 IGT和IFG&IGT)危险和对照，在男性和女性之间不同调节。 通过p-值分类代谢物。[IFG =空腹血糖受损；IGT =葡萄糖耐量受损； IFG&IGT:具有IFG和IGT的患者]
代谢物 调节男性危险_组
色氨酸
丙氨酸
亮氨酸
十六烷酸
二十碳三烯酸
甘油磷脂类
异亮氨酸
二十碳三烯酸
色氨酸 二十四烷酸
TGTGTTGGGT
GSGFGGFFFG
司罔罔同罔同罔罔周周
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下下下下下下下下下下代谢物
调节女性危险组
IGT IFG IGT IFG IGT IGT IGT
IFG&IGT
表5:在女性对照和来自糖尿病危险组的女性患者之间明确不同的代谢物。 关于危险-性别相互作用，代谢物显著不同(p〈0，05)，即，关于2型糖尿 病(IFG、 IGT和IFG&IGT)危险和对照，在男性和女性之间不同调节。 通过p-值分类代谢物。[IFG =空腹血糖受损；IGT-葡萄糖耐量受损； IFG&IGT:具有IFG和IGT的患者I
丙氨酸 十六烷酸
异亮氨酸 二十碳三烯酸
尿酸
十八烷酸
丝氨酸
下上下下下上下上
盐
硫 酸
酮酸烯
酸酸酸酸醇氨四酸
油氨氨油棒冬碳 銷
亚丝酪亚孕天廿琥
G G G G G G G
F F F F F F F
J^s- J^" r^s- rjs- r^s- rfs' r^s.
上上上上上上下
权利要求
1. 诊断糖尿病易感性的方法，其包括(a)测定怀疑具有糖尿病易感性的受试者试验样品中的至少一种代谢物，所述至少一种代谢物选自隐黄质、2-羟基-十六烷酸、三酰基甘油酯(C16:0、C18:1、C18:2)、巨头鲸鱼酸、二十三烷酸、5-羟脯氨酸；和(b)将步骤(a)测定的试验结果与参考比较，由此诊断糖尿病易感性。
2. 权利要求l的方法，其中所述至少一种代谢物选自二酰基甘油酯 (C18:l、 C18:2)和三酰基甘油酯(C16:0、 C18:2、 C18:2 )。
3. 权利要求2的方法，其中所述受试者为雄性。
4. 权利要求1至3中任一项的方法，其中所述至少一种代谢物的所述 测定包含质i普分析(MS)。
5. 权利要求4的方法，其中所述质谱分析为液相层析(LC) MS和/ 或气相层析(GC) MS。
6. 权利要求1至5中任一项的方法，其中所述参考来自已知具有糖尿 病易感性的受试者。
7. 权利要求6的方法，其中试验样品和参考的相同或相似结果指示糖 尿病易感性。
8. 权利要求1至5中任一项的方法，其中所述参考来自已知不具有糖 尿病易感性的受试者。
9. 权利要求1至5中任一项的方法，其中所述参考是受试者群体中所 述至少 一种代谢物的可计算参考。
10. 权利要求8或9的方法，其中所述至少一种代谢物的缺少，或与 参考样品相比所述至少 一种代谢物在试验样品中的不同量指示糖尿病易感 性。
11. 权利要求1至10中任一项的方法，其中所述样品是所述受试者体 液的样品。
12. 权利要求l至ll中任一项的方法，其中所述受试者为人。
13. 权利要求1至12中任一项的方法，其中测定至少一种其他代谢物， 其选自(i )长链饱和脂肪酸，优选为二十四烷酸(C24:0 )、三十烷酸(C30:0 )、 或二十三烷酸(C23:0)，(ii) 多不饱和脂肪酸，优选为二十二碳六烯酸(C22:顺式 [4,7，10，13，16，19]6 )、 二十碳五烯酸(C20:顺式[5,8，11，14，175)、廿碳四烯 酸(C20:顺式-[5，8，11，144 )、亚油酸(C18:顺式[9，12口 )、或亚麻酸(C18: 顺式9，12，153),(iii) 氨基酸，优选为赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、甲疏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 脯氨酸或谷氨酰胺，(iv) 抗氧化剂，优选为维生素C、辅酶Q10或a-生育酚，(v) 三羧酸循环代谢物，优选为丙酮酸、柠檬酸或苹果酸，(vi) 鸟氨酸循环代谢物，优选为尿素、瓜氨酸、琥珀酸或鸟氨酸，(vii) 甘露糖、a-酮异己酸、甘油、脂级分或3-羟基丁酸，和(viii) 葡萄糖。
14. 权利要求1至12中任一项的方法，其中测定至少一种其他代谢物， 其选自3-羟基丁酸、丙氨酸、a-酮异己酸、a-生育酚、精氨酸、维生素C、 天冬酰胺、j5-胡萝卜素、胆固醇、柠檬酸、瓜氨酸、肌酸酐、二十碳五烯 酸(C20:顺式[5，8，11，14，1715)、叶酸盐、葡萄糖、葡萄糖-l-磷酸、谷氨酸、 谷氨酰胺、甘油酸、甘油-3-磷酸、甘氨酸、异亮氨酸、乳酸、亮氨酸、苹 果酸、甘露糖、甲硫氨酸、肌醇、鸟氨酸、十六烷酸、磷脂类、孕烯醇酮 硫酸盐、十八烷酸、琥珀酸、苏糖酸、苏氨酸、三酰基甘油酯类、色氨酸、 尿酸和缬氨酸。
15. 包含指示糖尿病易感性的至少一种代谢物特征值的数据集合，所 述代谢物选自隐黄质、2-羟基-十六烷酸、三酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、 C18:2)、巨头鲸鱼酸、二十三烷酸、5-羟脯氨酸。
16. 数据存储介质，其包含权利要求15的数据集合。
17. 系统，其包含(a)比较样品代谢物的特征值的工具，其有效连接到 (b )权利要求16的数据存储介质。
18. 权利要求17的系统，还包含用于测定样品代谢物特征值的工具。
19. 诊断工具，其包含用于测定以下代谢物中的至少一种的工具隐 黄质、2-羟基-十六烷酸、三酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、 C18:2 )、巨头鲸 鱼酸、二十三烷酸、5-羟脯氨酸。
20. 诊断组合物，其包含以下代谢物中的至少一种隐黄质、2-羟基-十六烷酸、三酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、 C18:2 )、巨头鲸鱼酸、二十三 烷酸、5-羟脯氨酸。
21. 至少一种代谢物或测定其的工具在制备用于诊断受试者糖尿病易 感性的诊断装置或组合物中的用途，其中所述至少一种代谢物选自隐黄 质、2-羟基-十六烷酸、三酰基甘油酯(C16:0、 C18:l、 C18:2 )、巨头鲸鱼 酸、二十三烷酸、5-羟脯氨酸。
22. 权利要求21的用途，其中所述至少一种代谢物选自二酰基甘油 酯(C18:l、 C18:2)、三酰1^甘油酯(C16:0、 C18:2、 C18:2)。
23. 权利要求22的用途，其中所述受试者为雄性。
全文摘要
本发明涉及用于诊断糖尿病易感性的方法，其包括测定怀疑具有糖尿病易感性的受试者的试验样品中的至少一种代谢物，并将所述至少一种代谢物与参考比较，由此诊断糖尿病易感性。此外，本发明包括代谢物的集合、数据集合(包含代谢物的特征值)和存储介质(包含所述数据集合)。此外，本发明也涉及系统，所述系统包含用于比较样品代谢物的特征值的工具，所述工具有效连接至数据存储介质。本发明还包括包含至少一种代谢物的诊断工具，和所述至少一种代谢物用于制备诊断糖尿病易感性的诊断工具的用途。最后，本发明涉及用于鉴定糖尿病相关代谢物的方法。
文档编号G01N33/92GK101438168SQ200780016275
公开日2009年5月20日 申请日期2007年3月21日 优先权日2006年3月24日
发明者A·F·H·普费尔, B·贝唐, E·莱博尔德, J·施普兰格尔, J·维默尔, K·布施, M·吉普曼斯, T·博贝特 申请人:梅坦诺米克斯有限公司