专利名称：高效液相法在检测炎琥宁原料和制剂中有关物质的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及到高效液相法在检测炎琥宁原料和制剂中有关物质的应用。
背景技术：
呼吸道感染是由病毒或细菌感染引起的常见病、多发病。其中，感冒和肺炎又是最常见的呼吸道感染疾病。单就肺炎而言，据联合国世界卫生组织(WHO)，在最近一份报告中指出，在全球引起发病和造成死亡的疾病中，下呼吸道感染(主要是肺炎)被列为第三位高危害疾病。我国在北京等九城市通过对60岁以上的老年人进行重点调查后，发现其在所患常见病中26％为肺炎，北京某医院的死因分析表明，肺炎为80岁以上老年人的第一位死因。国内外研究资料都说明肺炎危害大。而急性上呼吸道感染(系指自鼻腔至喉部之间的急性炎症的总称)，也是最常见的感染性疾病，90％左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。本病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播，因此危害性极大。为此，全世界每年投入很大的财力物力用于对呼吸道疾病的预防与治疗，研制开发治疗各种治疗呼吸道疾病的药物也就成为世界各大制药公司投入资金较大的一个领域。我国是一个人口大国，因每年春秋冬季引发的呼吸道疾病造成的损失是很惊人的。
炎琥宁为近年来在我国上市的抗病毒药物，它是从天然植物穿心莲叶中提取的有效成份穿心莲内酯结构改造，经人工半合成所得的穿心莲内酯琥珀酸半酯(NAS)制成的钾钠盐。能抑制早期毛细血管通透性增高与炎性渗出和水肿，能特异性地兴奋垂体—肾上腺皮质功能，促进ACTH释放，增加垂体前叶中ACTH的生物合成；体外具有灭活腺病毒、流感病毒、呼吸道病毒等多种病毒的作用。动物实验有抗早、中孕作用。用于急性呼吸道感染的治疗，具有明显的抗病毒、抗菌双重功效，与同类药物相比具备副作用小，无耐药现象，制剂稳定，疗效可靠等优势。
杂质检查是药品质量标准的重要组成部分，对一些特殊杂质的控制，既能保证用药的安全有效，又能考核药物的生产工艺和贮存条件。
高效液相法HPLC是近20年发展起来的检测新技术，具有分离效果好，灵敏度高，分析速度快等优点，与多种类型检测器的联合应用，能满足大多数化合物种类的检测需要。
目前炎琥宁原料和制剂国家标准WS-10001-(HD-0042)-2002、WS-10001-(HD-0043)-2002采用的是薄层色谱法来检测炎琥宁制剂的有关物质，而有关物质的高低直接决定炎琥宁原料和制剂的质量和毒副作用。我们经过试验，发现薄层色谱法并不能准确反应炎琥宁原料和制剂中有关物质，从附图1可以看出，薄层色谱法只能检出有关物质的限度，而不能测定出准确的有关物质含量。
经过文献查询，目前还没有用高效液相法检测炎琥宁原料和制剂中有关物质的报道。

发明内容
本发明的创新在于开发了高效液相法用于检测炎琥宁原料和制剂中的有关物质，不仅提高了检测水平，还加强了药品的质量控制。
本发明是这样实现的取炎琥宁原料或制剂，加流动相制成每1ml中含0.1-100mg炎琥宁的供试品溶液和每1ml中含0.1-100μg的对照溶液；照高效液相色谱法(中国药典2000版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水、甲醇、磷酸二氢钾或乙腈任意两种或以上混合溶剂为流动相；检测波长240-290nm。理论板数按炎琥宁峰计算应不低于5000，炎琥宁峰与各杂质峰的分离度应符合规定。取对照溶液5-30μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的5-30％；再取上述两种溶液各5-30μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的2.5-5倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和，与对照溶液主成分峰面积比较，即可得出有关物质的准确含量，见附图2。
最优化的操作方法为取炎琥宁原料或制剂，加流动相制成每1ml中含0.25mg炎琥宁的供试品溶液和每1ml中含2.5μg的对照溶液；照高效液相色谱法(中国药典2000版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.1mol/L磷酸二氢钾(以磷酸调pH至3.0)乙腈(53∶47)为流动相；检测波长251nm。理论板数按炎琥宁峰计算应不低于2500，炎琥宁峰与各杂质峰的离度应符合规定。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10％；再取上述两种溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的3倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和，与对照溶液主成分峰面积比较，即可得出有关物质的含量。
方法的建立1.仪器与试剂岛津LC-10ATVP泵岛津SPD-10AT VP紫外检测器TL-9000单通道色谱工作站Delta 320-S pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司乙腈Merck色谱纯磷酸二氢钾A.R.天津市化学试剂六厂色谱柱Inertsil C18柱250×4,6mm，5μm2、方法的建立(1)波长的选择。
精密称取炎琥宁及中间体各适量，加流动相溶解并稀释至规定的浓度，用分光光度法(中国药典年版二部附录IV A)在200nm-400nm扫描结果炎琥宁在251nm有最大吸收；中间体在251nm有较大的吸收，且响应值基本一致。因此我们将测定波长选为251nm。
(2)流动相的选择①甲醇-0.05％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调PH值为2.5±0.05)(7∶3)。
②甲醇-0.1％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调PH值为3.0±0.05)(7∶3)。
③乙腈-0.1％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调PH值为3.0±0.05)(55∶45)。
④乙腈-0.1％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调PH值为3.0±0.05)(47∶53)。
结论结果流动相1炎琥宁与杂质峰未完全分离，分离度为0.90；考虑改变pH值和磷酸盐的浓度，得流动相2，流动相2炎琥宁与杂质未完全分离，分离度为0.87；考虑将有机相改为乙腈得流动相3，流动相3主峰出峰时间为6.3min，杂质峰与主峰未完全分离，改变乙腈的比例得流动相4，结果主峰保留时间为10.4min，主峰与杂质峰分离良好。确定最终流动相条件为上述流动相4。
(3)分离度试验取本品炎琥宁与中间体适量，加流动相溶解并稀释，制成一定浓度的溶液，作为样品溶液。分别精密称取样品和中间体适量，混合，加流动相溶解并稀释，制成一定浓度的溶液。分别量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪。
结果主成分与各中间体的分离良好。
(4)系统适应性及专属性试验①破坏性试验a、精密称取本品25mg，加流动相溶解并稀释至100ml；作为破坏试验的对照溶液。量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品色谱图至主成分保留时间的3.5倍。
b、酸破坏试验精密称取炎琥宁25mg，加1mol/L盐酸1ml，放置3小时，用1mol/L氢氧化钠中和，加流动相稀释至100ml，作为酸破坏样品溶液。量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品色谱图至主成分保留时间的3.5倍。图谱显示在保留时间为3.8、4.2、5.2、17.4分钟有四个新的杂质增加，各杂质峰与主峰分离良好。结果表明本品在酸性环境中不稳定。
c、碱破坏试验称取炎琥宁25mg，加1mol/L氢氧化钠1ml，放置3小时，用1mol/L盐酸中和，加流动相稀释至100ml，作为碱破坏样品溶液。量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品色谱图至主成分保留时间的3.5倍。在保留时间为1.718min、3.800min、4.055min、5.866min、6.245min、7.160min有六个新杂质峰产生；降解产物与主峰分离良好。结果表明本品在碱性环境中不稳定。
d、氧化破坏试验称取炎琥宁25mg，加30％双氧水1ml，放置60分钟，加流动相稀释至100ml，作为氧化破坏样品溶液。量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品色谱图至主成分保留时间的3.5倍。在保留时间为3.149min、3.672min、11.964min有三个杂质峰产生；降解产物与主峰分离良好。结果表明本品在氧化条件下不稳定。
d、光照破坏试验称取炎琥宁25mg，加流动相溶解并稀释至100ml，在4500Lx±500Lx照度下照射6小时，量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品色谱图至主成分保留时间的3.5倍。图谱中未见明显的新杂质峰产生，原杂质峰未见增加。结果表明本品对强光照射较稳定。
e、高温破坏试验称取炎琥宁25mg，在60℃放置3小时，加流动相稀释至100ml，作为高温破坏样品溶液。量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品色谱图至主成分保留时间的3.5倍。图谱显示未见新的杂质峰增加，在保留时间4.464min的杂质峰与对照溶液比较峰面积明显增加；各杂质与主峰分离良好。结果表明本品在高温环境中不稳定。
经破坏试验表明本品在酸性、光照环境中较稳定；在碱性、氧化、高温环境中不稳定。各降解产物与主峰的分离良好，分离度符合要求。
②空白溶剂试验取流动相20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果空白溶剂在1.7min有一小峰，不影响有关物质的测定。
③最小检测限的测定取样品溶液，稀释至主峰峰高约为基线噪音的3倍，作为本品的最小检出，记录色谱图。结果表明炎琥宁的最小检测限为5ng。
本发明所述方法操作简单，能够准确测定炎琥宁制剂中的有关物质含量。


图1薄层色谱法检查炎琥宁制剂或原料有关物质色谱2高效液相色谱法检查炎琥宁制剂或原料有关物质色谱图实施实例按以下检测方法和国家标准中的薄层色谱法对炎琥宁原料和制剂各三批进行了有关物质的测定取炎琥宁原料或制剂，加流动相制成每1ml中含0.25mg炎琥宁的供试品溶液和每1ml中含2.5μg的对照溶液；照高效液相色谱法(中国药典2000版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.1mol/L磷酸二氢钾(以磷酸调pH至3.0)乙腈(53∶47)为流动相；检测波长251nm。理论板数按炎琥宁峰计算应不低于2500，炎琥宁峰与各杂质峰的离度应符合规定。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10％；再取上述两种溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的3倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和，与对照溶液主成分峰面积比较，即可得出有关物质的含量。
检测结果为

可以看出，高效液相法可以准确测定出原料和制剂中的有关物质含量，而薄层色谱法只能检出限度。
权利要求
1.高效液相法在检测炎琥宁原料和制剂中有关物质的应用，其特征为采用高效液相法检测炎琥宁原料和制剂中的有关物质。
全文摘要
本发明涉及高效液相法在检测炎琥宁原料和制剂中有关物质的应用。本发明所述的高效液相法应用于炎琥宁原料和制剂中有关物质检测的检测具有分离效果好、灵敏度高、分析速度快、准确度高等优点，不仅提高了炎琥宁原料和制剂中有关物质的检测水平，还加强了炎琥宁制剂的质量控制。
文档编号G01N30/00GK1670528SQ20041000869
公开日2005年9月21日 申请日期2004年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者刘军, 杨春玮, 孔庆文 申请人:广东奇方药业有限公司