专利名称：苯甲酸标准溶液制备方法、确定该标准溶液标准曲线的方法及检测奶酪中其含量的方法
技术领域：
本发明涉及化学成份的检测的技术领域，具体来说，它涉及一种苯甲酸标准溶液 的制备方法，一种用具有不同苯甲酸含量的一系列苯甲酸标准溶液确定苯甲酸标准溶液 标准曲线的方法，和一种根据确定的苯甲酸标准溶液标准曲线检测奶酪中苯甲酸含量的方 法。
背景技术：
苯甲酸(又称安息香酸)是一种常用的食品防腐剂，与其钠盐的防腐效果相同，它 对多种微生物细胞的呼吸酶系的活性有抑制作用，并对微生物的细胞膜生长有阻碍作用， 从而达到抑制微生物的繁殖。由于它既能抑制多种微生物的繁殖，又具有很好的杀菌作用， 被广泛用于罐头、果酱、酱油、食醋、汽水以及各类肉食品中。苯甲酸是各国允许使用，而且 历史比较悠久的食品防腐剂。当苯甲酸进入人体后，会与人体内氨基乙酸(甘氨酸)和葡萄糖酸分别反应生成 马尿酸和葡萄糖苷酸，后者会随尿排出体外，所以每日摄取少量苯甲酸不会对人体形成危 害。但是摄入过量的苯甲酸时，却会对人体肝脏造成危害。因为苯甲酸的戒毒反应是在肝 脏中进行的，对肝功能衰弱的人即使摄取少量苯甲酸也会使病情加重，苯甲酸对皮肤、眼睛 和粘膜也有一定的刺激性，苯甲酸钠可引起肠道不适。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生 组织(WHO)试验研究后规定人体对苯甲酸的每日摄入量为5-10mg/kg，我国也对各类食品 中苯甲酸的最大使用量作了规定。国家标准《GB/T 21703-2008乳与乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定》中用液相色谱 法来测定苯甲酸的含量。该方法的前处理为先在150ml锥形瓶中称取液体乳20g，或者在 150ml锥形瓶中称取固体样品3g，加IOml水全部溶解。然后加入25ml 0. lmol/L氢氧化钠 溶液，在70°C水浴中处理15分钟。冷却后，加适量甲醇转移至IOOml容量瓶中。用0. 5moll 硫酸溶液将PH调节到8，然后加人2ml 92g/L亚铁氰化钾溶液和2ml 183g/l乙酸锌溶液。 剧烈振摇，静置15分钟，混合后冷却到室温，再用甲醇定容，静置15分钟，上清液经过滤膜 过滤。收集滤液作为试样溶液，用于高效液相色谱仪测定。该方法需要使用用甲醇45ml_65ml，会对环境造成一定污染，同时处理样品时间 长，操作较为复杂。该方法通常是先对具有确定苯甲酸含量的工作液进行标定，然后再用同样的方法 处理和测试被测样品，根据这两次测量的结果来推算被测样品中的苯甲酸含量。但这方法 测量精度不高，由于一次测量的数值可能会受到一些不确定因素的干扰，因此根据该工作 液的数值确定的样品苯甲酸含量可能并不准确。另外，在《气相色谱-质谱联用法测定奶粉中苯甲酸(钠)含量》(《化学测定方 法》，2008年第18卷第1期，第75-76，甘平胜，黄聪，于鸿，候建荣)中公开了一种用气相色 谱-质谱法检测苯甲酸含量的方法，但该方法只检测奶粉样品，没有提及实验时所用定性罔子、定量罔子°

发明内容
本发明的目的是提供一种苯甲酸标准溶液的制备方法，该方法操作简便且具有较
尚精度。本发明还提供了一种苯甲酸标准溶液标准曲线的确定方法，它可以用上述苯甲酸标准溶液的制备方法配备具有不同苯甲酸含量的标准工作液，并采用气相色谱-质谱法以 准确确定苯甲酸含量与峰面积之间的对应关系。本发明又提供了一种检测乳与奶酪中苯甲酸含量的方法，它采用气相色谱-质谱 /质谱法检测奶酪样品中的苯甲酸，根据上述的苯甲酸标准曲线确定奶酪中的苯甲酸含量， 并提高检测时的抗干扰能力。为实现上述目的，本发明提供了一种苯甲酸标准溶液的制备方法，该方法包括如 下步骤1)取20. 0 μ g/ml的苯甲酸标准工作液ImL到一个10_15ml的离心管中；2)在该离心管中加入蒸馏水至5ml，再加入ImL盐酸溶液(6mol/L)和2ml 二氯甲 烷，用旋涡混合器混合1分钟，用离心机在3000rpm-4000rpm条件下离心5_10分钟；3)用Iml注射器吸取下清液经过过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得待测的苯甲 酸标准溶液。本发明还提出了一种根据上述苯甲酸标准溶液制备方法确定苯甲酸标准溶液标 准曲线的方法，该方法包括1)制备具有不同苯甲酸含量的苯甲酸标准溶液；2)用气相色谱_质谱/质谱法分别标定上述步骤1)制备的不同浓度的苯甲酸标 准溶液；3)确定苯甲酸含量与峰面积对应的标准曲线。根据本发明的再一种确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法，其中，苯甲酸标准溶 液的量分别为取 20.0 μ g/ml 的苯甲酸标液 0. lml.O. 2ml,0. 5ml,0. 6ml,0. 8ml 和 1.0ml。根据本发明的另一种确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法，其中，气相色谱的条 件为色谱柱毛细管色谱柱，固定相为亚硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇或相当者，色谱 柱规格为 30mX0. 25mmX0. 2μπι 或 30mX0. 32mmX0. 2ym ；进样口 温度200-300 V ；进样方式分流，分流比为40 1-50 1 ；载气高纯氦气；流速毛细管色谱柱内径为0. 25 μ m的流速为1. 0-1. 4ml/min,毛细管色谱柱内径 为 0. 32 μ m 的流速为 1. 8-2. 5ml/min ；升温程序如下初温为140°C维持1-2分钟，然后以4-7°C /min升到175_190°C后， 保持4-7分钟，程序共10-20. 5分钟。根据本发明的又一种确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法，其中，质谱的条件 为
电离方式电轰击电离(EI)；电离能量70eV ；离子源温度200-220°C；传输线温度150-200°C；溶剂延迟时间3· 0-5. 0分钟；进样量l_2yL;扫描模式多反应监测(MRM)，定性离子质荷比(m/z) 122 > 105，122 > 77，定量离 子质荷比(m/z) 122 > 105 ；碰撞能量质荷比(m/z)122 > 105 为 8V, 122 > 77 为 20V。本发明又提出了一种用上述方法确定的苯甲酸标准溶液标准曲线检测奶酪中苯 甲酸含量的方法，该方法包括1)称取3_5g海砂到50ml离心管，然后在离心管中称取l_3g奶酪样品，加入l-2g乙酸锌，准确加入20ml蒸馏水；2)用玻璃棒充分搅拌，使奶酪均勻混合在海砂中；3)用旋涡混合器充分混合；4)用离心机在3000rpm-4000rpm条件下离心5-10分钟；5)过滤水层，吸取5ml滤液于一个10_15ml的离心管中，加入6mol/L盐酸溶液 lml，2ml 二氯甲烷；6)用旋涡混合器混合1分钟，用离心机在3000rpm-4000rpm条件下离心5_10分 钟；7)用Iml注射器吸取下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得待测的苯甲酸 样品溶液；8)用气相色谱_质谱/质谱仪对所述的待测的苯甲酸样品溶液进行测量；9)将步骤8)所得的测量结果与所确定的苯甲酸含量标准曲线进行比对，确定所 述待测的苯甲酸样品溶液的苯甲酸含量；10)根据所述待测的苯甲酸样品溶液的苯甲酸含量确定所述奶酪中的苯甲酸含量。本发明的气相色谱-质谱法检测乳与奶酪中苯甲酸含量的方法，采用气相色 谱-质谱/质谱法测定奶酪中的苯甲酸，具有消耗有机溶剂少、操作时间短、操作简单方便、 检测准确率高、抗干扰能力强等特点。


以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中，图1是在气相色谱-质谱/质谱仪处于SCAN模式时，苯甲酸含量为20. 0 μ g/ml 的苯甲酸标准溶液1. Oml得到的总离子流色谱图； 图2是在气相色谱_质谱/质谱仪处于SCAN模式时，苯甲酸含量为20. 0 μ g/ml 的苯甲酸标准溶液1. Oml得到的质谱图； 图3是在气相色谱_质谱/质谱仪处于MRM模式时，苯甲酸含量为20. 0 μ g/ml的 苯甲酸标准溶液1. Oml得到的总离子流色谱图4是在气相色谱_质谱/质谱仪处于MRM模式时，苯甲酸含量为20. 0 μ g/ml的 苯甲酸标准溶液1. Oml得到的质谱图；图5是在气相色谱_质谱/质谱仪处于MRM模式时的一种苯甲酸标准溶液标准曲 线图，横坐标是所吸取的苯甲酸标准溶液中所含的苯甲酸的质量(取20.0yg/ml的苯甲 酸标液0. ImUO. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml和1. 0ml)，分别为每毫升二氯甲烷中含有苯甲酸 1. 0 μ g、2. 0 μ g、4. 0 μ g、6. 0 μ g、8. 0 μ g、10. 0 μ g,纵坐标是相应质量(即取 20. 0 μ g/ml 的 苯甲酸标液0. lml.o. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml和1. 0ml)对应的峰面积。
具体实施例方式为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照

本发 明的具体实施方式
。需要指出的是，本发明中所提到的各具体数值，并非完全数学意义上的 数字，凡是符合化学工程意义上的数值都是适用的。各个实施例采用的实验仪器与试剂如下450GC-300MS气相色谱/质谱联用仪购自美国瓦里安(VARIAN)公司；色谱柱毛细管色谱柱，固定相为亚硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇或相当者，色谱 柱规格为 30mX0. 25mmX0. 2μπι 或 30mX0. 32mmX0. 2ym ；离心管规格是10_15ml以及50ml ；苯甲酸标准溶液取自国家标准物质研究中心，浓度1. Og/L,编号 GBff(E)100006 ；苯甲酸标准工作液浓度为20. 0 μ g/ml。制备方法是取浓度为1. Og/L的苯甲酸 标准液1ml，用蒸馏水定容到50ml ；盐酸溶液浓度为6mol/L。制备方法是取50ml盐酸溶液，用蒸馏水定容于IOOmL
容量瓶中；海砂属于分析纯；乙酸锌属于分析纯；二氯甲烷属于色谱纯。各实施例采用的仪器条件如下气相色谱条件进样口 温度200-300 °C ；进样方式分流，分流比为40 1-50 1 ；载气高纯氦气；流速毛细管色谱柱内径为0. 25 μ m的流速为1. 0-1. 4ml/min,毛细管色谱柱内径 为 0. 32 μ m 的流速为 1. 8-2. 5ml/min ；升温程序如下初温为140°C维持1-2分钟，然后以4-7°C /min升到175_190°C后， 保持4-7分钟，程序共10-20. 5分钟。质谱条件电离方式电轰击电离(EI)；电离能量70eV ；离子源温度200-220°C；
传输线温度150-200°C；溶剂延迟时间3. 0-5. 0分钟；进样量l_2yL;
扫描模式多反应监测(MRM)，定性离子质荷比(m/z) 122 > 105，122 > 77，定量离 子质荷比(m/z) 122 > 105 ；碰撞能量质荷比(m/z)122 > 105 为 8V, 122 > 77 为 20V。实施例1苯甲酸标准溶液的制备说明如苯甲酸含量为10. 0μ g/ml的苯甲酸标准溶液的制备方法。先取20. 0 μ g/ml的苯甲酸标准工作液Iml到一个15ml离心管中，在该离心管中 加水到5ml，再加入ImL盐酸溶液(浓度6mol/L)和2ml 二氯甲烷，用旋涡混合器混合1分 钟，用离心机在3000rpm条件下离心5分钟；用Iml注射器吸取下清液经过滤膜过滤到进样 小瓶，此即为制得待测的苯甲酸标准溶液。虽然上面只描述了一种苯甲酸含量的标准溶液的配制方法，但本领域技术人员可 以理解，只要制备过程开始时，在同样容量的若干离心管中加不同量的苯甲酸标准工作液， 这样就可以得到一系列具有不同苯甲酸含量的苯甲酸标准溶液。这里可以不同条件进行离 心处理，如转速是3500rpm以及4000rpm等、离心时间是8分钟以及10分钟。在本发明苯甲酸含量标准曲线的确定方法中，可以先采用上述方法，分别制备出 苯甲酸含量为0. lml.O. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、和1. Oml的苯甲酸标准溶液。实施例2苯甲酸标准溶液标准曲线的确定由于使用本发明所提供的设备(如300-MS气相色谱/质谱联用仪)使用以上的 条件均可以得出苯甲酸标准溶液的标准曲线，故本实施例中所用的条件如下气相色谱条件温度是200°C，进样方式分流，分流比为40 1 ；流速毛细管色谱柱内径为0.25 μ m的流速为1. Oml/min，毛细管色谱柱内径为 0. 32 μ m 的流速为 1. 8ml/min ；升温程序如下初温为140°C维持lmin，然后以4°C /min升到175°C后，保持4min， 程序共IOmin ；离子源温度200°C ；传输线温度150°C;质谱的条件为电离方式电轰击电离(EI)；电离能量70eV ；离子源温度200°C ；传输线温度150°C;溶剂延迟时间3. O分钟；进样量=IyL;扫描模式多反应监测(MRM)，定性离子质荷比(m/z) 122 > 105，122 > 77，定量离 子质荷比(m/z) 122 > 105 ；
碰撞能量质荷比(m/z)122 > 105 为 8V，122 > 77 为 20V。按照上述制备苯甲酸标准溶液的条件，根据采用的仪器条件调节仪器，待状态稳 定后，用气相色谱-质谱法对制备出的具有不同苯甲酸含量的苯甲酸标准溶液分别进行 分析，再根据所标定的数值确定苯甲酸含量与峰面积对应的标准曲线，此即为苯甲酸标准 溶液标准曲线，其中，苯甲酸标准溶液的量分别为取20.0yg/ml的苯甲酸标液0. 1ml、0.2ml、0. 5ml、0. 6ml、0. 8ml 禾口 1. 0ml。图1是在气相色谱-质谱/质谱仪处于SCAN模式时，苯甲酸含量为取20. 0 μ g/ml 的苯甲酸标准溶液1. Oml得到的总离子流色谱图；图2是在气相色谱-质谱/质谱仪处于 SCAN模式时，苯甲酸含量为取20. 0 μ g/ml的苯甲酸标准溶液1. Oml得到的质谱图；图3是 在气相色谱_质谱/质谱仪处于MRM模式时，苯甲酸含量为取20. 0 μ g/ml的苯甲酸标准溶 液1. Oml得到的总离子流色谱图；图4是在气相色谱-质谱/质谱仪处于MRM模式时，苯甲 酸含量为取20. 0 μ g/ml的苯甲酸标准溶液1. Oml得到的质谱图；图5是在气相色谱_质谱/质谱仪处于MRM模式时的一种苯甲酸标准溶液标 准曲线图。横坐标是所吸取的苯甲酸标准溶液中所含的质量(取20.0yg/ml的苯甲酸 标液0. ImUO. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml和1. 0ml)，分别为每毫升二氯甲烷中含有苯甲酸
1.0μ g、2. 0μ g、4. 0μ g、6. 0μ g、8. 0μ g、10. 0μ g，纵坐标是相应质量(即取 20. 0 μ g/ml 的 苯甲酸标液0. lml.o. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml和1. 0ml)对应的峰面积。得出的标准曲线的相关数据如下初始线性曲线拟合，线性方程y = +3. 8717e+4x-3. 5148e+4 ；偏差0.28%。利用本发明的上述方法确定出的苯甲酸含量标准曲线，可以很方便地对奶酪中的 苯甲酸含量进行检测。下面将结合实施例3，详细说明奶酪中苯甲酸含量的检测方法。实施例3奶酪中苯甲酸含量的检测首先，称取3g海砂到50ml离心管，在离心管中称取Ig奶酪样品，加入Ig乙酸锌， 准确加入20ml蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌，使奶酪均勻混合在海砂中，用旋涡混合器充分 混合，用离心机在3000rpm条件下离心5分钟。然后，过滤水层，吸取5ml滤液于一个15ml的离心管中，加入6mol/L盐酸溶液 lml, 2ml 二氯甲烷，用旋涡混合器混合1分钟，用离心机在3000rpm条件下离心5分钟。最后，用Iml注射器吸取下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得待测的苯 甲酸样品溶液。将待测的苯甲酸样品溶液注入到气相色谱_质谱/质谱仪中得到峰面积， 从标准曲线中查得式样中苯甲酸的含量(yg)。式样中苯甲酸含量X，以质量分数(mg/kg)表示，按下式计算X= Cs/mi*4式中Cs—从标准曲线中查得试样中苯甲酸的含量(yg)。HIi——试样的质量(g)。在此实施例中，Cs为0. 324 μ g，Hii为1. 0024g,由上式计算得1. 36mg/kg。用气相色谱_质谱仪对上述待测液进行测量，随后将测量的结果与所确定的苯甲酸含量标准曲线进行比对，确定待测液的苯甲酸含量。这样，就可以根据待测液的苯甲酸含 量计算出奶酪中的苯甲酸含量。以上选择的海砂、乙酸锌的克数可以根据所取的奶酪样品发生变化，比如说当取 3g奶酪样品时，海砂与乙酸锌应相应增加，如取海砂5g和乙酸锌2g。离心机也可以在提供的条件内选定不同的值。这些都是本领域技术人员可以理解并且能够实现的，在此不作赘 述。
如上所述，在本发明的苯甲酸含量标准曲线确定方法中，通过制备一系列具有不 同苯甲酸含量的苯甲酸标准溶液，可以提高苯甲酸含量标准曲线的准确度，减少测量中的干扰。同样在检测奶酪中苯甲酸含量的方法中，采用气相色谱-质谱/质谱法测定奶酪中 的苯甲酸，具有消耗有机溶剂少、提取时间短、操作简单方便、检测准确率高、抗干扰能力强 等特点，很好的满足了实验室检测量大的需要。以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式
，并非用以限定本发明的范围。任何 本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。
权利要求
一种苯甲酸标准溶液制备方法，其特征在于，该方法包括1)取20.0μg/ml的苯甲酸标准工作液1mL到一个10ml-15ml的离心管中；2)在所述离心管中加入蒸馏水至5ml，再加入1mL盐酸溶液(6mol/L)和2ml二氯甲烷，用旋涡混合器混合1分钟，用离心机在3000rpm-4000rpm条件下离心5-10分钟；3)用1ml注射器吸取下清液经过过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得待测的苯甲酸标准溶液。
2.一种根据权利要求1所述苯甲酸标准溶液制备方法确定苯甲酸标准溶液标准曲线 的方法，其特征在于1)根据权利要求1所述方法，制备具有不同苯甲酸含量的苯甲酸标准溶液；2)用气相色谱-质谱法分别标定上述步骤1)制备的所述各种苯甲酸标准溶液；3)确定苯甲酸含量与峰面积对应的标准曲线，该标准曲线即为苯甲酸标准溶液标准曲线。
3.如权利要求2所述的确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法，其中，所述的苯甲酸标 准溶液的量分别为取20. 0 μ g/ml的苯甲酸标准溶液0. ImUO. 2ml,0. 5ml,0. 6ml,0. 8ml和 1. Omlo
4.如权利要求2所述的确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法，其中，所述气相色谱的 条件为色谱柱毛细管色谱柱，固定相为亚硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇或相当者，色谱柱规 格为 30mX0. 25mmX0. 2μπι或 30mX0. 32mmX0. 2ym ； 进样口温度200-300°C ； 进样方式分流，分流比为40 1-50 1 ；载气高纯氦气；流速毛细管色谱柱内径为0. 25 μ m的流速为1.0-1.4ml/min，毛细管色谱柱内径为 0. 32 μ m 的流速为 1. 8-2. 5ml/min ；升温程序如下初温为140°C维持1-2分钟，然后以4-7°C /min升到175-190°C后，保 持4-7分钟，程序共10-20. 5分钟。
5.如权利要求4所述的确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法，其中，所述质谱的条件为电离方式电轰击电离(EI)； 电离能量70eV ； 离子源温度200-220°C ； 传输线温度150-200°C ； 溶剂延迟时间3. 0-5. 0分钟； 进样量l-2yL;扫描模式多反应监测(MRM)，定性离子质荷比(m/z) 122 > 105，122 > 77，定量离子质 荷比(m/z) 122 > 105 ；碰撞能量质荷比(m/z) 122 > 105为8V, 122 > 77为20V。
6.一种用权利要求2所述方法确定的苯甲酸标准溶液标准曲线检测奶酪中苯甲酸含 量的方法，其特征在于包括1)称取3-5g海砂到50ml离心管，然后在离心管中称取l_3g奶酪样品，加入l_2g乙酸 锌，准确加入20ml蒸馏水；2)用玻璃棒充分搅拌，使奶酪均勻混合在海砂中；3)用旋涡混合器充分混合；4)用离心机在3000rpm-4000rpm条件下离心5-10分钟；5)过滤水层，吸取5ml滤液于一个的离心管中，加入6mol/L盐酸溶液lml，2ml二氯甲烷；6) 用旋涡混合器混合1分钟，用离心机在3000rpm-4000rpm条件下离心5_10分钟；7)用Iml注射器吸取下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得的待测苯甲酸标准 溶液；8)用气相色谱_质谱/质谱仪对所述的待测苯甲酸标准溶液进行测量；9)将步骤8)所得的测量结果与所确定的苯甲酸标准溶液标准曲线进行比对，确定所 述待测苯甲酸标准溶液的苯甲酸含量；10)根据所述待测苯甲酸标准溶液的苯甲酸含量确定所述奶酪中的苯甲酸含量。
全文摘要
本发明提供了一种苯甲酸标准溶液制备方法、一种根据该方法确定苯甲酸标准溶液标准曲线的方法和一种检测奶酪中苯甲酸含量的方法。上述方法将奶酪中加入海砂和乙酸锌研磨，然后加入20mL蒸馏水，用旋涡混合器混匀后离心，过滤后取5mL滤液用1mL 6mol/L盐酸调节pH值，用二氯甲烷提取，用气相色谱-质谱/质谱仪(GC-MS/MS)测定苯甲酸的含量，用毛细管色谱柱利用程序升温即可满足检测要求。该气相色谱-质谱/质谱法检测奶酪中苯甲酸含量的方法，提取时间短、操作简单方便、检测准确率高、抗干扰能力强，可以满足实验室中检测量大的需要。
文档编号G01N30/02GK101806682SQ20101013441
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者刘卫星, 刘晓川, 常建军, 李梅, 胡桂林, 赵源 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司