专利名称：一种检测l-抗坏血酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器的制备以及用该传感器对L-抗坏血酸的测定。
背景技术：
L-抗坏血酸(AA)，即维生素C，广泛存在于食品、药物及人体中，是维持生命的重要成分之一，但人体不能自身合成。AA在人体的生命过程中扮演了极其重要的作用，它可以清除人体内有害的自由基，提高人体对铁的吸收；将胆固醇转化为胆汁酸，使高胆固醇血症患者的胆固醇下降；可促进胶原蛋白抗体的合成，具有抗癌的作用；并参与神经介质、激素的生物合成。AA还参与人体内多种反应，在体内的氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。研究表明，一个成人每天需要摄入AA的量约为70-90mg，AA的缺乏可导致多种疾病， 如坏血病、免疫力低下、感冒，抑郁症、甚至是癌症。但是摄入过量的AA也会给身体带来损害，患者会出现尿道结石、腹泻、胃痉挛等症状。AA含量高低常作为某些疾病诊断及营养分析的重要指标，但AA极易氧化失效，而且在某些食物中其含量较低，因此研究一种快速，灵敏，廉价的AA检测方法是十分有必要的。目前对AA的检测方法主要有有经典的碘量法，火焰原子吸收光谱、液相色谱法、分光光度法，还有常用的库仑法、常规极谱法、荧光光度法、 化学发光法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法。这些方法中有的要求的实验条件和操作技术较高，而有些方法步骤烦琐，不利于快速分析。因此开发价格便宜，操作简单，而灵敏度又较高的AA分析方法具有重大的实际意义。电化学传感技术以其操作简单，成本低，备检测的样品不需经过预处理可直接测量；电极响应快，需较短时间；选择性、灵敏度较好； 稳定性和抗干扰强，而具有良好的应用前景。

发明内容
针对现有检测技术的缺点，本发明提供了一种采用L-半胱氨酸/壳聚糖修饰的电化学传感器快速测定AA含量的方法。L-半胱氨酸是天然氨基酸中唯一具有活泼-SH基团的化合物，同时还含有同样活泼的-NH2，具有良好的电化学活性，因而对其电化学特性研究具有十分重要的意义。L-半胱氨酸能和一些离子发生螯合作用，使得L-半胱氨酸修饰电极在化学分析和生物分析中具有广泛的应用。壳聚糖，是由甲壳素进一步脱乙酰化后得到的线性、天然含氨基的聚糖，在自然界中含量丰富，成膜性好。其分子内具有丰富的-NH2和-OH，从而使得壳聚糖对许多离子、有机物具有离子交换、离子螯合、吸附等作用。因而在分析领域中得到广泛应用，尤其是作为活性检测物质制备的各种修饰电极，性能优越。但是壳聚糖的选择性吸附能力不强，制备出的修饰电极缺乏良好的抗干扰性。自组装膜技术是活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成的有序分子组装体系，可以在分子水平上按人们预期的目标进行设计。自组装膜具有均勻一致、高密堆积和低缺陷等优点，并可按预先设计，通过精确的化学控制获得特定的功能，具有超分子的结构及界面性质。在电极表面构筑自组装膜，将扩充修饰电极的应用范围，在电催化、分子识别、光电转换、化学及生物传感器等方面具有显著的优点和广泛的应用前景。本发明人通过对壳聚糖和L-半胱氨酸的研究，经过大量的实验，得出了采用L-半胱氨酸和壳聚糖复合起来制备电化学传感器(工作电极)的思路，本发明采用自组装法，制得了 L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器(工作电极)。该传感器既克服了壳聚糖对离子的选择性吸附能力不强的缺点，也弥补了氨基酸不稳定、易脱落的劣势，充分发挥了二者各自的优势，增强了对离子的检测能力，并充分发挥了自组装技术制备简便、稳定可靠、识别性高的优点，制得了具有较高灵敏度和稳定性的电化学传感器。一种检测L-抗坏血酸的方法，采用基于L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的工作电极的电化学传感器对溶液中L-抗坏血酸的浓度进行测定，步骤如下(1)将待测L-抗坏血酸加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，以此作为电解液；控制PH 为 5. 0-5. 4 ；(2)以L-半胱氨酸/壳聚糖修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼电极为辅助电极，置于⑴中所述的电解液中，电化学测试。电解液中L-抗坏血酸浓度为1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L的范围内峰电流成良好线性关系，检出限为4. 3X 10_6mOl/L ；电解液pH较好为5. 0。本发明是通过以下措施实现的电化学传感器的工作电极结构为在玻碳电极基底表面有一层L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；其制备步骤如下1.进行玻碳电极预处理，先用抛光粉对玻碳电极进行打磨、抛光，然后对玻碳电极进行超声清洗，得到基底表面光洁的玻碳电极；2.将壳聚糖和L-半胱氨酸加入到醋酸溶液中，不断搅拌使之溶解充分；其中， 壳聚糖的含量为0. 5 0. 7wt%, L-半胱氨酸的含量为0. 3 0. 5wt% ；3.将预处理好的玻碳电极侵入2所制得的溶液中，室温下自组装3-7小时；4.将玻碳电极取出并用蒸馏水清洗，以去除多余的L-半胱氨酸和壳聚糖，室温下晾干，得到L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的AA电化学传感器的工作电极。5.将待测AA标准溶液加入pH为5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，作为电解液，放入电解池中，并以以L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼电极为辅助电极，置于电解液中，电化学测试。每次扫描结束，将三电极置于空白底液中循环扫描至无峰，用二次蒸馏水冲洗，滤纸吸干后即可进行下一次扫描，这样可保持电极良好的稳定性和重现性，实验均在室温下进行。玻碳电极包括玻碳基底，玻碳基底表面吸附有L-半胱氨酸/壳聚糖响应膜，玻碳基底与一电极引线相连，电极引线外侧包覆有绝缘层。本发明的电化学传感器具有快速、灵敏、抗干扰能力强的优点。此外本发明采用自组装法将活性检测物质L-半胱氨酸和壳聚糖修饰到电极表面，电化学传感器(工作电极) 的制备简便、成本低廉。


图1为本发明玻碳工作电极结构示意图；图2为在不同pH乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，1. 5X 10_3mol/LAA的峰电流；图3为本发明在不同修饰电极下1.5X10-3mol/L AA的循环伏安曲线，底液pH为 5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，a裸电极，b聚糖修饰电极，cL-半胱氨酸修饰电极，dL-半胱氨酸/壳聚糖修饰电极；图4为不同AA浓度下的线性伏安曲线，底液pH为5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，其中的小图为以浓度为横坐标，峰电流为纵坐标作的标准曲线，其中，a Omol/L, b 1.0Xl(T5mol/L，c 8. 0 X 10_5mol/L, d 1 X l(T4mol/L，e2. 0 X ΙθΛιοΙ/L，f 5. 0 X l(T4mol/L，g 8. OX l(T4mol/L，h 1.0X 10_3mol/L, i2. 0X l(rtiol/L。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。实施例1本电化学传感器的制备方法为(1)用抛光粉打磨玻碳电极，使其基底表面平整光洁，然后用超声(频率53KHZ，温度25°C )清洗其表面，得到预处理的玻碳电极；(2)将1. Og壳聚糖和0. 6gL-半胱氨酸加入到200ml体积分数为1 %的醋酸溶液中，搅拌使它们充分溶解；(3)将预处理的玻碳电极浸入步骤(2)所制得的溶液中，室温下自组装3小时，使壳聚糖和L-半胱氨酸溶液自组装到电极基底表面上，形成L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；(4)用去离子水清洗浸泡的玻碳电极，去除多余的L-半胱氨酸和壳聚糖，得到 L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器。实施例2本电化学传感器的制备方法为(1)用抛光粉打磨玻碳电极，使其基底表面平整光洁，然后用超声清洗其表面，得到预处理的玻碳电极；(2)将1. 4g壳聚糖和1. OgL-半胱氨酸加入到200ml体积分数为1 %的醋酸溶液中，搅拌使它们充分溶解；(3)将预处理的玻碳电极浸入步骤(2)所制得的溶液中，室温下自组装5小时，使壳聚糖和L-半胱氨酸溶液自组装到电极基底表面上，形成L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；(4)用去离子水清洗浸泡的玻碳电极，去除多余的L-半胱氨酸和壳聚糖，得到 L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器。实施例3本电化学传感器的制备方法为(1)用抛光粉打磨玻碳电极，使其基底表面平整光洁，然后用超声清洗其表面，得到预处理的玻碳电极；(2)将1. 2g壳聚糖和0. SgL-半胱氨酸加入到200ml体积分数为的醋酸溶液中，搅拌使它们充分溶解；(3)将预处理的玻碳电极浸入步骤( 所制得的溶液中，室温下静置7小时，使壳
5聚糖和L-半胱氨酸溶液自组装到电极基底表面上，形成L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；(4)用去离子水清洗浸泡的玻碳电极，去除多余的L-半胱氨酸和壳聚糖，得到 L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器。将待测AA标准溶液加入pH为5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，作为电解液，放入电解池中，并以以L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼电极为辅助电极，置于电解液中，电化学测试。每次扫描结束，将三电极置于空白底液中循环扫描至无峰，用二次蒸馏水冲洗，滤纸吸干后即可进行下一次扫描，这样可保持电极良好的稳定性和重现性，实验均在室温下进行。玻碳电极包括玻碳基底，玻碳基底表面吸附有L-半胱氨酸/壳聚糖响应膜，玻碳基底与一电极引线相连，电极引线外侧包覆有绝缘层。见图1。本发明具有灵敏度高、选择性高的优点。下面通过电化学测试的结果阐述本发明的优点图2为在不同pH条件下AA的峰电流，测定条件电解液为不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0. lmol/L)，AA浓度为1. 0 X 10_4mOl/L，测定方法为循环伏安法，电位扫描范围-0. 2 IV，扫描速度100mV/S，由图可以看出，在pH为5. 0的条件下峰电流响应最好；图3为在不同修饰电极下AA的循环伏安曲线。测定条件电解液为pH5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0. lmol/L)，AA浓度为1. 5 X 10_3mol/L，测定方法为循环伏安法电位扫描范围-0. 2 IV，扫描速度100mV/S，由图可见L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的玻碳电极的峰电流最大，而裸电极上几乎没有峰电流响应，L-半胱氨酸修饰电极和壳聚糖修饰电极虽然有峰但电流响应很小，说明经过L-半胱氨酸/壳聚糖修饰后的电极兼具了二者的优势，能够更好地对AA产生电化学响应，提高了传感器的灵敏度；图4为不同AA浓度下的线性伏安曲线，测定条件电解液为pH5. 0.的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0. lmol/L)，测定方法为线性伏安法扫描范围-0. 2 IV，扫描速度100mV/S。 可以看出峰电流在AA浓度为1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L的范围内成良好线性关系，检出限为4. 3X 10_6mol/L(CL = 3Sic/X ；CL为检出限，si为样品测量读数的标准偏差，c为样品含量值，X为样品测量读数平均值。)。
权利要求
1.一种检测L-抗坏血酸的方法，其特征在于采用基于L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的工作电极的电化学传感器对溶液中L-抗坏血酸的浓度进行测定，步骤如下(1)将待测L-抗坏血酸样品加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，以此作为电解液；控制电解液 PH 为 5. 0-5. 4 ；(2)以L-半胱氨酸/壳聚糖修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极， 钼电极为辅助电极，置于(1)中所述的电解液中，电化学测试。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于电解液中L-抗坏血酸浓度为4. 3X 10_6mol/L 2. OX 10_3mol/L，调整电解液pH为5. 0。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于电解液中L-抗坏血酸浓度为1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于电化学传感器的工作电极结构为在玻碳电极基底表面有一层L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；其制备步骤如下(1)打磨抛光玻碳电极，使其基底表面平整光洁，超声清洗其表面，得到预处理的玻碳电极；(2)将壳聚糖和L-半胱氨酸加入到醋酸溶液中，不断搅拌使之溶解充分；其中，壳聚糖的含量为0. 5 0. 7wt%, L-半胱氨酸的含量为0. 3 0. 5wt% ；(3)将⑴所得到的玻碳电极侵入(2)所制得的溶液中，室温下自组装3-7小时，得到 L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；(4)将(3)中制得的L-半胱氨酸/壳聚糖修饰玻碳电极用蒸馏水清洗，去除多余的 L-半胱氨酸和壳聚糖，室温下晾干，得到L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器的工作电极。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于醋酸溶液的体积浓度为1_2%。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于打磨抛光玻碳电极的过程是采用抛光粉对玻碳电极进行打磨、抛光。
全文摘要
本发明公开了一种检测L-抗坏血酸的方法，采用新型L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的L-抗坏血酸(AA)电化学传感器，包括玻碳电极，玻碳电极上有L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜，能对低含量的AA进行检测。本发明公开了传感器的制备方法，包括玻碳电极预处理；壳聚糖和L-半胱氨酸醋酸溶液的制备；将预处理的玻碳电极浸入所制得的溶液中，室温下自组装5～7分钟，得到L-半胱氨酸/壳聚糖自组装膜；洗去玻碳电极上多余的L-半胱氨酸和壳聚糖，得到L-半胱氨酸/壳聚糖自组装修饰的电化学传感器。本传感器对AA检测其具有制备简便、快速、灵敏的优点，AA浓度为1.0×10-5～2.0×10-3mol/L的范围内峰电流成良好线性关系，检出限为4.3×10-6mol/L。
文档编号G01N27/26GK102375008SQ20101026178
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者侯保荣, 庞雪辉, 张洁, 解建东, 谭福能, 隋卫平, 魏琴 申请人:中国科学院海洋研究所