专利名称：一种胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒、及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测领域，具体地涉及一种胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒及其方法。
背景技术：
胃蛋白酶(pepsin)属于天冬氨酸蛋白水解酶类，是胃消化蛋白水解酶，相对分子 量为31-36kd，其前体是胃蛋白酶原，胃蛋白酶原在成年脊椎动物胃黏膜中合成，由胃主细 胞分泌，在胃液的酸性条件下转换成胃蛋白酶。其功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽 片段。胃食管返流病(GERD)是指胃肠内容物返流入食管引起返酸、烧心、胸痛等消化道 症状，进而严重影响生活质量并可导致食管癌前病变的疾病。是一种非常常见的影响生活 质量的食管疾患，其发病原因主要是食管抗反流屏障减弱或食管黏膜长时间暴露于胃液之 下，致使胃酸和胃蛋白酶损害食管粘膜。部分患者需终身服用抑酸制剂，部分患者则需行腹 腔镜下胃底折叠术治疗来控制。通常情况下，食管下括约肌(LES)在吞咽时开放，随后关闭防止胃酸返流入食管。 静息时LES压力足以防止食物返流。LES的不当松弛可导致胃酸返流入食管，引起刺激反 应。胃食管返流疾病(GERD)的发病机理与食管胃动力有关，包括食管清除能力下降和胃排 空延迟。50%的病人有食管蠕动功能的丧失。食管裂孔疝损害食管排空功能，随着疝孔增 大，问题也增多，导致胃酸清除减慢。症状和体征GERD症状通常在餐后和脂肪进入胃内后被诱发。弯腰、仰卧和紧张能 加重症状，肥胖、妊娠、腹水、腹带过紧等也能导致症状加重。GERD的一系列症状包括胃部 烧灼感(83% )、反胃(70% )、咽下困难(37% )、呼吸道症状(30% )、腹痛(10% )、胸痛 (10% )、恶心(8% )、嗳气(7% )和出血(4% )。患者主诉餐后有胃部烧灼感和反胃等典 型症状。也有病人主诉严重胸痛，常被错误地归咎于心脏病发作。另外，也可能有声嘶或喘 鸣等典型的胃酸引起的哮喘症状。一些患者没有典型症状，当食管严重受损后，患者主诉吞 咽困难，甚或出血，这经常在呕血或黑色柏油样便后被注意到。夜间食管返流增加食管炎的 危险，因为夜间吞咽活动和唾液分泌减少不能中和胃酸导致其停留在食管内时间较长。检查患者会有声嘶、上腹部触痛、驼背、牙釉质破坏或肺部听诊爆裂音(伴吸入性 肺炎)。穿紧身衣服由于能增加腹压也能使这些症状突显。病史和体格检查经常足以诊 断GERD。最近有报道认为连续7d服用大剂量奥美拉唑对此病有效，因为它能抑制胃酸分 泌，阻止GERD症状的发生。如果患者诊断后药物疗法无效，或他们主诉咽下困难，内窥镜 检查则是诊断食管炎的最好手段。上消化道钡餐透视对重度食管炎的诊断是相当准确的 (98. 7%),中度和轻度食管炎次之(分别为81. 6%和24. 6% )。食管内pH值监测，即测定 胃和食管内容物的酸度，对内窥镜检查阴性的患者是有帮助的。食管测压法，即通过鼻道向 胃内插管测定LES压力和食管功能，也有助于确诊。应当注意，所有检查都可以产生假阴性 结果。
对胃蛋白酶的检测目前基本上运用变性血红蛋白法测定其活性，而对于胃蛋白酶 含量的检测，周素芳，邓勇，周德义等在《不同胃液胃蛋白酶含量及活性的测定》一文中曾报 道利用红桂木凝集素建立ELISA方法检测，其原理是利用凝集素具有与糖蛋白特异性结合 的性质。但这种方法无法区分样品中的其它酶类及胃液中食物的一些糖蛋白，从而会造成 检测的假阳性。

王建荣，程艳爽，马燕兰曾在《不同体位与方式鼻饲患者口咽及支气管分泌物胃蛋 白酶含量的变化》中提及用放射免疫分析的方法检测胃蛋白酶含量；但其放射免疫方法操 作时间长，标记物具有放射性污染，已渐渐被市场所淘汰。综上检查方法，内窥镜和钡餐检查给病人带来不舒适和一定的伤害，而且对轻度 食管炎准确性低(24.6%)；而食管内pH值检测过程繁琐，受影响因素多，不能满足临床要 求。胃蛋白活性检测操作繁琐，不便于临床的筛查；凝集素反应存在的交叉因子多，容易导 致假阳性；放射免疫反应又操作时间长，对环境有污染。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay, CLIA)于 1977 年问世， 上世纪九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进 展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后 发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定 性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位， 代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反 应的高灵敏性(检测限度可达10-15-10-18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快 速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分 析技术的首选。由于胃蛋白酶可以对蛋白或多肽进行剪切，其酶活性的最适PH值约为3，在PH值 6时仍有活性。所以利用免疫分析的方法进行特异性检测时，既要保持胃蛋白酶的免疫活 性，又要避免其酶活性对蛋白的分解能力，这也是免疫分析试剂盒开发的难点之一，而化学 发光免疫分析作为一种新兴的分析技术，其运用于胃蛋白酶检测也未有报道。我们利用胃 食管返流时返流物中含有胃液，而胃液中含有胃蛋白酶，从而通过检测胃蛋白酶来评价是 否存在胃食管返流。胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒应运而生。

发明内容
为了解决上述问题而开发和完成了本发明，即将化学发光技术与胃蛋白酶的免疫 分析学有效地结合，同时使用了发光信号强、持续时间长、更高信噪比的自制化学发光底物 液，提供了一种能够更加简便、快速、灵敏、稳定地检测胃蛋白酶的试剂盒。同时本发明的试 剂盒采用的方法比目前其它分析法灵敏度高，反应高度特异性，因此使本试剂盒更适于在 产业上有效地进行推广和应用。因此，本发明的目的是提供一种胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒。本发明的再一目的是提供一种制备上述胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒的方法。根据本发明的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，包括1)胃蛋白酶抗原校准品；2)样品收集液，pH 2-3 ；3)样品稀释液，pH 6-8 ；4)胃蛋白酶抗体包被的微孔板；5)胃蛋白酶抗体标记物；6)化学发光底物液；以及7)浓缩洗涤液。由于胃蛋白酶可以对蛋白或多肽进行剪切，其酶活性的最适PH值约为3，在pH值 6时仍有活性。所以利用免疫分析的方法进行特异性检测时，既要保持胃蛋白酶的免疫活 性，又要避免其酶 活性对蛋白的分解能力根据本发明的试剂盒，样品采集后，保存在低PH 值的样品收集液(PH2-3)中可以保持胃蛋白酶的活性，在样品检测前，用pH 6-8的样品稀 释液进行稀释，使其待测溶液的升至中性，这样避免了胃蛋白酶在酸性环境下酶分割能力， 但对胃蛋白酶的免疫活性没有影响，况且中性的PH值环境也有利于抗原抗体的反应。根据本发明的试剂盒，标记物标记的抗体与固相载体上包被的抗体同被测样品中 的胃蛋白酶抗原形成“包被抗体_抗原_抗体_标记物”的夹心复合物结构，因此本发明采 用的“双抗体夹心法”反应模式，既有效地利用抗原_抗体反应的高特异性，又结合了化学 发光免疫分析技术的高灵敏度，并能通过生物素_亲合素体系使反应灵敏度得到更高的水 平，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。根据本发明的试剂盒可以用于检测鼻咽部、咽喉部分泌物、食管内容物中是否含 有胃蛋白酶，从而判断是否存在胃食管反流病；本发明试剂盒还可以用于检测胃液中胃蛋 白酶浓度，从而辅助诊断胃部病变。根据本发明的试剂盒，其中，所述标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素 及其衍生物。根据本发明的试剂盒，其中，所述标记物生物素及其衍生物时，示踪酶为辣根过氧 化物酶标记链亲合素(HRP-SA)。根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为1，2_ 二氧乙烷类衍生物、鲁米 诺或异鲁米诺。根据本发明的试剂盒，其中，所述样品收集液为pH 2 3的缓冲液，根据本发明的 具体实施，所述样品收集液的配方为一水柠檬酸 2 IgProclin300 ImL双蒸水定容至1000mL。根据本发明的试剂盒，其中，所述样品稀释液为pH6 8的含蛋白的缓冲液，根据 本发明的具体实施例，所述样品稀释液的配方为NaH2PO4 · 2H20 0. 6gNa2HPO4 · 12H20 5. 8gNaCl8. 766g牛血清白蛋白IOgProclin300ImL双蒸水定容至1000mL。根据本发明的试剂盒，其中，所述的胃蛋白酶抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗 体。根据本发明的试剂盒，其中，所述的抗体，其来源可以是鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、 牛、驴、马、鸡、猴子。
本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤1)胃蛋白酶抗原校准 品；2)样品收集液；3)样品稀释液；4)胃蛋白酶抗体包被的微孔板；5)标记胃蛋白酶抗体； 6)配制化学发光底物液；7)配制浓缩洗涤液；8)分装上述胃蛋白酶抗原校准品、标记的胃 蛋白酶抗体、化学发光底物液和浓缩洗涤液；以及9)组装为成品。根据本发明的方法，所述包被微孔板的步骤4)包括以下步骤I)抗体的制备人工合成胃蛋白酶多肽，用合成的多肽交联BSA后免疫兔子，制备兔抗人胃蛋白 酶抗体。II)包被用0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的胃蛋白酶抗体配制成包 被液，并将其负载于微孔板上；III)用生理盐水洗涤上述微孔板；以及IV)封闭配制封闭液，基于IOOOmL所述封闭液包含0. 2g NaH2PO4 · 2H20、 2. 9gNaH2P04 .UH2OUOg牛血清白蛋白和ImL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7. 0 7. 6， 然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的微孔板上。根据本发明的制备上述试剂盒的方法，其中胃蛋白酶抗体酶标记物为辣根过氧化 物酶，采用过碘酸钠法进行标记；胃蛋白酶抗体酶标记物为碱性磷酸酶，采用戊二醛交联法 进行标记；而胃蛋白酶抗体标记生物素，采用EDC/NHS方法偶联，并采用过碘酸钠法进行辣 根过氧化物酶链亲合素。所述胃蛋白酶抗原校准品为人工合成多肽，纯度不得低于90%，包被的微孔板为 48或96孔的微孔板条，标记的酶为偶联碱性磷酸酶(ALP)或是辣根过氧化物酶，化学发光 底物液中的有效发光物质为鲁米诺或AMPPD，浓缩洗涤液为PBST或含Tween20的Tris-HCl 缓冲液。本发明“胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒”可以检测出胃液中、食管内容物、咽 喉部分泌物、鼻咽部分泌物、气管支气管分泌物中的胃蛋白酶含量，并且根据是否可以检出 胃蛋白酶来判断是否存在胃食管反流，根据检出胃蛋白酶含量可以判断胃部病变治疗的效 果及其病情的变化。它具有无创、简便、快速、灵敏、稳定等优点。同时该胃蛋白酶化学发光 免疫检测试剂盒的各项指标均已达到技术要求。


图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。
具体实施例方式实施例1应用辣根过氧化物酶系统制备本发明的胃蛋白酶化学发光免疫检测试 剂盒

一、辣根过氧化物酶标记抗体的制备 溶解5mg HRP于0. 5mL蒸馏水中，加入0. 5mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌 30min，经IOmM pH值为4. 4醋酸钠缓冲液，透析后加入5mg胃蛋白酶抗体，搅拌2h，最后用200mMNaBH4进行还原，经0.02M PBS缓冲液透 析后，加等体积甘油，_20°C以下保存。二、酶标抗体稀释液NaH2PO4 · 2H200. 2gNa2HPO4 · 12H20 2. 9gNaCl8. 766g酶稳定剂IgBSAIOgProclinImL双蒸水IOOOmL三、酶标抗体浓度选定经试验证明，酶标抗体的工作浓度范围为1 500以上。四、胃蛋白酶抗原校准品的制备将人工合成的胃蛋白酶多肽抗原用校准品稀释液稀释成含量分别为0、2、6、20、 60、200ng/mL系列浓度，建立定量校准品。五、胃蛋白酶抗体包被的固相载体的制备。(1)包被采用0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的胃蛋白酶抗体混合制 成包被液，并将其负载于微孔板上；具体地，所述0. 05mol/L碳酸盐缓冲液的配方为无水碳酸钠 1. 59g碳酸氢钠2. 93g去离子水IOOOmL溶解混勻后，调整pH值至9. 6，加入5. Omg胃蛋白酶抗体混勻，按100 μ L/孔的量 加入微孔板中，4°C过夜。(2)洗涤用生理盐水洗涤上述包被好的微孔板。(3)封闭NaH2PO4 · 2H20 0. 2gNa2HPO4 · 12H20 2. 9g牛血清白蛋白IOgProclin300ImL双蒸水定容至IOOOmL将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混勻，调整pH值为7. 0 7. 6。按200 μ L/孔的量加入微孔板中，室温放置2-4小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍 干。室温除湿干燥24小时后立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查是否漏气，如有 漏气则需重新封袋，如无漏气现象贴签后置2 8°C保存，备用。六、样品收集液IOOmM柠檬酸缓冲液，用NaOH溶液调pH至2. 5 ；具体地，所述配方如下一水柠檬酸2 Ig
Proclin300ImL双蒸水定容至IOOOmL用NaOH溶液调整pH至2. 5。

七、样品稀释液采用含蛋白的20mM pH7. 4PBS缓冲液；具体地，所述样品稀释液配方如下NaH2PO4 · 2H20 0. 6gNa2HPO4 · 12H20 5. 8gNaCl8. 766g牛血清白蛋白IOgProclin300ImL双蒸水定容至IOOOmL调整pH 至 7. 4八、化学发光底物A液在IOOml双蒸水中加入1. 21g Tris和295 μ L浓HCl配成0. IM ρΗ8. 5的 Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入0. 5g的Luminol、20 μ L的Tween20以及0. Ig对碘苯 酚，混合均勻。B液在IOOml双蒸水中加入柠檬酸三钠0. 73g和柠檬酸0. 44g，配制成0. IM PH5. 0的柠檬酸缓冲液，在此溶液中加入0. Ig过氧化脲。使用方法使用前将A液与B液按1 1比例混合后使用九、浓缩洗涤液NaH2P04 · 2H20 4gNa2HP04 · 12H20 58gNaCl155gTween-20IOmL加去离子水定容至 IOOOmL调整pH 至 7. 2 7. 4十、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。随机抽取三份经过特异性、精密性、灵敏度及 稳定性检定合格后组装成Pepsin化学发光免疫分析定量测定试剂盒。实施例2应用碱性磷酸酶系统制备本发明的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒一、碱性磷酸酶标记抗体的制备由于本试剂盒采用得是碱性磷酸，因此一般都采用戊二醛交联法来制备酶标记 物。在此交联法中采用两步法即先将酶与戊二醛作用，透析后除去多余的戊二醛，在与抗体 作用而形成酶标记物。由于酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，容易失活，因此需在 结合物溶液中加入等体积的甘油并在低温冰箱(-20°C )中保存。二、化学发光底物本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法Tris24. 22g
NaCl175gKCl4gHCl15mL双蒸水IOOOmLProclin 300 ImLAMPPD200mL三、浓缩洗涤液Tris 24. 22gNaCl 175gTween20 IOmlHCl15mL加去离子水定容至 IOOOmL调整pH值至7. 4。其他试剂与组分的配置方法与辣根过氧化物酶系统制备胃蛋白酶化学发光免疫 检测试剂盒的方法一致。实施例3应用生物素链亲和素系统制备本发明的胃蛋白酶化学发光免疫检测试 剂盒一、生物素标记抗体的制备生物素标记胃蛋白酶抗体以生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体发生偶 联反应，对PBS充分透析，生物素标记物以新生牛血清稀释，加入PrOclin300，-20°C以下保存。二、辣根过氧化物酶标记链亲和素的制备溶解5mg HRP于0. 5mL蒸馏水中，加入0. 5mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌 30min，经IOmM pH值为4. 4醋酸钠缓冲液，透析后加入2mg胃蛋白酶抗体，搅拌2h，最后用 200mM NaBH4进行还原，经0.02M PBS缓冲液透析后，加等体积甘油，_20°C以下保存。其他试剂与组分的配置方法与实施例1的方法一致。综上所述，在本发明的研究过程中，首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量 鉴定，以保证试验的精确性，然后对包被方法进行了研究，选择出最适合的包被缓冲液和封 闭液，找到最佳的浓度条件，并且配制出了能够使酶标记物长期保持活性的稀释液。利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放 射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，可用于检测胃液中胃蛋白酶含量的变化，更适用 于临床上对胃食管反流病的监测。实施例4本发明的试剂盒的使用方法

使用本试剂盒前，应先取出室温放置15 30分钟，使它们平衡到室温；之后，准备 好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪以及辅助仪器，如洗板机等，是否正
常工作。一、样品的准备1、胃液取Iml胃液，加入到含0.5ml的样品收集液中，4000rcp/min离心5分钟， 取上清，检测前用样品稀释液进行1 500稀释(如Iml样品稀释液中加入2μ1样品)。
2、胃食管返流物用咽拭纸刮取鼻咽部、咽喉部分泌物，或用一次性痰液收集器在 负压的条件下抽吸气管或支气管分泌物，将浸入样品收集液中，4000rcp/min离心5分钟， 取上清，检测前用样品稀释液进行1 5稀释(如500 μ 1样品稀释液中加入100 μ 1样品)。3、痰液咯出咽喉深部痰液，吐入含有样品收集液的管子中，4000rcp/min离心5 分钟，取上清，检测前用样品稀释液进行1 5稀释(如500 μ 1样品稀释液中加入100 μ 1 样品)。

二、检测方法使用本试剂盒按照实施例1的方法进行实验的具体操作步骤如下1)将实验需要的微孔板(微孔板已包被好抗体，96/48孔)放置在板架上；2)反应孔中分别加入稀释后的待测样品100 μ 1，再加各浓度校准品0、2、6、20、 60、200ng/mL，每孔各加100 μ L，每次试验设空白1孔；3)轻轻振荡30秒混勻，用封板膜封板，37°C温育60min ；4)取出反应板，弃去孔中溶液，用PBST洗液在自动洗板机上或者手工洗板5次，在 吸水纸上拍干；5)空白孔除外，每孔加入含生物素标记胃蛋白酶抗体的结合物100μ 1 ；
6)轻轻振荡30秒混勻，用封板膜封板，37°C温育30min ；7)如步骤4方法洗板5次，在吸水纸上拍干；8空白孔除外，每孔加入酶工作液100μ 1 ；9)轻轻振荡混勻，用封板膜封板，37°C温育30min ；10)如步骤4方法洗板5次，在吸水纸上拍干；11)每孔加含Iuminol的HRP发光底物液A 50 μ L,再加含过氧化脲的HRP发光 底物液B 50 μ L ；或者先将鲁米诺化学发光底物液的A液和B液按1 1混合，每孔各加 100μ L ；12)轻轻振荡混勻，室温(20 27°C )避光反应5min ；13)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间0.1-1秒/ 孔；14)分别读取校准品浓度值和其相对应的RLU值，在建立的双对数曲线上建立标 准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该样品中胃蛋白酶的浓度，计算检测结果 (参见附图1)；15)打印检测结果报告。实施例5本发明的试剂盒在方法学上的鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行鉴定，经过 大量的实验证明，本发明的试剂盒在用于胃蛋白酶浓度水平测定时，该方法学指标如下1)检测范围0. 3 250ng/mL ；2)最低检出量平行测定20孔零值校准品血清，计算零值校准品RLU平均值(X)及 标准差(S)，以X+2S为定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即 为最低检出量为0. 3ng/mL。3)精密度测定胃蛋白酶抗原质控品的浓度，重复检测3次，每次重复20孔，进行 精密度测定，计算分析内精密度为4.6%，小于10%，分析间精密度(高、中、低三个质量控制范围)为8. 3%，小于15% ；4)特异性分别测定与胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、唾液淀粉酶、溶菌酶等标志 物进行交叉反应，其交叉反应率分别为0. 03%,0. 02%,0. 04%,0. 04%均小于0. ；5)稳定性各试剂组分别置于37°C烘箱中3天、7天和10天，实验发现各组分仍稳定。6)正常人参考血清的确定根据临床实验结果， 在反流物、分泌物中的正常值范 围，本检测方法的应小于5ng/ml。本发明的试剂盒所用样品量少，所需样品来源简单方便，体外检测对测试对象没 有任何毒副作用。同时本发明采用的化学发光酶免疫分析方法，不产生放射性污染。利用 本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒 成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查实验室。因此本发明为临床检测胃蛋白 酶(Pepsin)，辅助诊断胃食管反流病提供了一种更准确，特异，方便，快捷的方法。
权利要求
1.一种胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)胃蛋白酶抗原校准品；2)样品收集液，PH 2-3 ；3)样品稀释液，PH 6-8 ；4)胃蛋白酶 抗体包被的微孔板；5)胃蛋白酶抗体标记物；6)化学发光底物液；以及7)浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述样品 收集液的配方为一水柠檬酸 21g Proclin300 ImL 双蒸水定容至1000mL。
3.根据权利要求1所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述样品 稀释液的配方为NaH2PO4 · 2H20 0. 6gNa2HPO4 · 12H20 5. 8gNaCl8. 766g牛血清白蛋白 IOgProclin300ImL双蒸水定容至1000mL。
4.根据权利要求1所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述标记 物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素及其衍生物。
5.根据权利要求1所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学 发光底物液为1，2- 二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
6.根据权利要求1所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的胃 蛋白酶抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗体 源自鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、牛、驴、马、鸡、猴子。
8.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)配制胃蛋白酶抗原校准品；2)以胃蛋白酶抗体包被微孔板；3)标记胃蛋白酶抗体，得胃蛋白酶抗体标记物；4)配制样品收集液，其pH为2-35)配制样品稀释液，其pH为6-86)配制化学放光底物液；7)配制浓缩洗涤液；8)分装抗原校准品、胃蛋白酶抗体标记物、化学发光底物液和浓缩洗涤液；以及9)组装为成品。
全文摘要
本发明涉及免疫检测领域，具体地涉及一种胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒及其方法。根据本发明的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒，包括1)胃蛋白酶抗原校准品；2)样品收集液，pH 2-3；3)样品稀释液，pH 6-8；4)胃蛋白酶抗体包被的微孔板；5)胃蛋白酶抗体标记物；6)化学发光底物液；以及7)浓缩洗涤液。本发明的试剂盒可以检测出胃液中、食管内容物、咽喉部分泌物、鼻咽部分泌物、气管支气管分泌物中的胃蛋白酶含量，并且根据是否可以检出胃蛋白酶来判断是否存在胃食管反流，根据检出胃蛋白酶含量可以判断胃部病变治疗的效果及其病情的变化。它具有无创、简便、快速、灵敏、稳定等优点。
文档编号G01N33/573GK102128928SQ20101057424
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者柳静, 陈秀 申请人:中国人民解放军第二炮兵总医院, 北京科跃中楷生物技术有限公司