专利名称：治疗糖尿病的组合物和方法
背景技术：
本申请以2001年9月27日提交的序列号为09/967,030的美国部分继续申请为基础并要求其优先权，后者是以美国国家阶段申请的国际提交目为2002年4月4目的国际申请PCT/US00/08957为基础并产生优先权，而再后者又是以名称为“治疗糖尿病的组合物、产品和方法”、申请日为1999年4月4日、序列号60/127,824的美国临时申请为基础以及作为优先权的来源的；所有这些申请引入本文作为参考。
1.技术领域本申请涉及天然产物领域，更具体而言涉及用于治疗糖尿病的植物提取物和化合物。
2.相关技术描述糖尿病，一种具有潜在破坏性的葡萄糖代谢综合病症，在世界范围发病率呈增长趋势，目前通过胰岛素注射剂和/或药物对其部分地控制。在美国，估计一千多万人患有糖尿病。反映治疗费用的财政成本达多亿美元，而在人功能损害、进展至变盲、截肢、肾衰竭和心脏和血管疾病同时生产能力损失的代价则更是无以估量。
尽管糖尿病的标志是高血糖伴随糖在尿中排出，但是，该病分两大类型I型或幼年发病型(胰岛素依赖性糖尿病-IDDM)；和II型或成年发病型(非-胰岛素依赖性糖尿病-NDDM)。
这种分类是以发病大约时间而命名的，但是，事实上发病时间是不能决定的。概括地讲，IDDM好象是该病的免疫调节型，其中胰岛素产生受损，而NDDM是细胞不能对胰岛素作出应答的病症。
在埃及、中国和印度的古代文献中认识了糖尿病。Johann ConradBrunner于1682首先提出了糖尿病可能是涉及胰腺的病症。然而，直到20世纪，才清楚了糖尿病的病况与胰岛素有关，要么与胰腺的胰岛素的形成和分泌有关，要么与循环胰岛素对机体细胞的影响有关。
单糖葡萄糖是人细胞的初始能源。葡萄糖是最佳生长、发育以及维持中枢神经系统所需要的。脑是葡萄糖的贪婪消费者，以致于血糖的任何显著下降均将导致脑葡萄糖水平的伴随下降，产生正常脑功能停止(昏迷)的后果。葡萄糖进入细胞和葡萄糖在细胞内代谢对于维持人体生命是至关重要的。胰岛素，一种调控转运的激素，控制着葡萄糖进入细胞的摄取和转运，无论葡萄糖是产生能量还是在细胞中存储。葡萄糖由消化系统进入血流。如果细胞内葡萄糖水平太低或者血中葡萄糖水平太高，胰岛素就被释放从而通过细胞摄取葡萄糖分别进行代谢或者存储来调节。如果血中葡萄糖水平也低的话，则其它激素调节糖原(淀粉-样存储聚合物)释放葡萄糖。因此，胰岛素是在适当的(proper)机体代谢中建立葡萄糖体内平衡所必需的。血中合适的胰岛素浓度是至关重要的。胰岛素缺乏导致由过量血糖引起的代谢问题而造成昏迷和死亡。另一方面，过量的胰岛素又会导致由于过度低血糖而引起休克。类似地，如果细胞不能适当地应答胰岛素，那么，体内平衡被破坏，产生过高血糖水平的结果。
当血糖是无控的严重代谢性失调，继而引发葡萄糖水平升高导致酮症和导致血液pH损坏性变化时，即使不充足的(inadequate)葡萄糖水平，也将导致昏睡和昏迷。目前，利用膳食药物和/或定期注射胰岛素试图控制危及生命的血糖摆幅。现已知道，损害是由过量葡萄糖引起的，并非直接由胰岛素缺乏所致。过量的葡萄糖与对正常代谢必要的成百上千的蛋白质相结合，并以这种方式损坏机体的细胞结构。
过量血糖引发糖尿病的许多病状。糖尿病患者常常患有小血管疾病(微血管病)，所述小血管疾病是由于毛细血管壁随着时间增厚而引起的。做为继发性的结果，毛细血管变得渗漏，导致视网膜病和肾病。以通用术语讲，糖尿病导致失明和肾损害。另外，机体的动脉硬化也可以引起冠状动脉过早破裂。糖尿病患者也出现神经病变，并导致下肢末端感觉丧失。坏疽和随后的截肢是由糖尿病引发的血管退化的常见后果。
胰岛素由胰腺内位于被称为郎格罕氏岛群的1.5百万个β-细胞产生。胰岛素是由两条链组成的中等大小的蛋白质21个氨基酸的α链和30个氨基酸的β链彼此通过二硫键相连接。
有许多学说解释导致糖尿病病症的胰腺产生胰岛素障碍的机制。参考文献是标题为“Autoimmune Imbalance and Double Negative TCells Associated with Resistant，Proneand Diabetic Animals”的文章，Hosszufalusi，N.，Chan，E.，Granger，G.，and Charles，M.；J Autoimmun，5305-18(1992)”。该文章表明郎格罕氏岛的炎症中断了胰岛素产生。具体地说，郎格罕氏岛产生胰岛素的β-细胞因免疫攻击而被破坏。这种β-细胞破坏被认为是归因于数种免疫细胞的攻击，所述免疫细胞包括NK(自然杀伤)细胞和双阴性(CD4-[W3/25+0X19+]/CD8-
)T-淋巴细胞。
该领域已经取得进一步的研究进展，参考文章标题是“Quantitative Phenotypic and Functional Analyses of IsletImmune Cell Before and After Diabetes Onset in the BB Rat”，Hosszufalusi，N..etal.，Diabetologia 361146-1154(1993)，该文章证实，糖尿病发病时双阴性T细胞(CD4-/CD8-，双阴性细胞)增加到占小岛T-细胞群的约30％。这些细胞的细胞溶解性能被证实是对小岛细胞呈组织特异性的。
标题为″Clonal deletion and autoreactivity in extrathymicCD4/CD8-(double negative)Tcell receptor-alpha/beta Tcells″，Prud′homme，G.J.，Bocarro，D.C.，et al.，J Immunol.1473314-8(1991)的文章，论述了通过一矫正引起自体反应双阴性T-细胞(即引起小岛炎症的细胞)代谢失调的阻断化合物，抑制了已知可变区基因VB 16和相关的细胞因子。提出细胞类型的正确平衡顺序为B-细胞＞T-细胞(CD4＞双阴性＞CD8)＞自然杀伤细胞＞巨噬细胞。也认识到，自身免疫反应通过双阴性T-细胞引起巨噬细胞活化，其中活化的巨噬细胞然后攻击体细胞。当胸腺的T-细胞克隆适当耗尽时，双阴性T-细胞逃逸并变成潜在的自体反应克隆。业已建立这样的理论通过施用单克隆抗体可以调节由大多数NK细胞表达的CD8蛋白，从而降低糖尿病的发病率。针对NK细胞糖脂AGMI的多克隆抗体的施用，也防止自身免疫小岛破坏。
据信，在神经学水平，来自肾上腺皮质的醛固酮调整在机体组织所有细胞表面上的一组反应的运转，以调节钠的摄取和保留并且将钾排出。低血清钠和高血清钾增强醛固酮分泌。肾上腺受神经递质多巴胺(肾上腺抑制剂)和神经递质5-羟色胺(肾上腺刺激剂)的影响；低钾水平影响多巴胺产生，因此，影响醛固酮和皮质醇分泌。另外，其它因素参与垂体促肾上腺皮质激素至皮质醇的负反馈。这些因素有心钠素或排钠激素，其抑制醛固酮的分泌，氯化钠、钾和磷。也已认识到在松果状瘤侵入垂体干期间，可以见到来自下丘脑的多巴胺对促乳素进行性抑制的干涉。这些因素可包括导致胰岛素依赖性糖尿病的免疫异常或胰岛素非依赖性糖尿病的异常胰岛素反应。
在标题为″Auto Immune Diseases Linked to Abnormal K+Channel Expression in DN CD4-and CD8-T cells″，Chandy，K.G.，etal.，Eur.J.Immunol.20747751(1990)的一文中，讨论了钾对由DN T一细胞产生的细胞毒性的影响。类似地，发现生物胺和神经肽起着神经调制(neuromodulate)神经传递的抑制或兴奋的神经递质即阿片样肽的作用。在该机制中，下丘脑合成和分泌直接来自和通过神经轴突到达毛细管网的神经激素，所述毛细管网通过垂体的门脉循环向脑下垂体前叶腺转运。
标题为″Role of growth factors in pancreatic cancer″，Korc，M.，Surg Oncol Clin N Am.，725-41(1998)的文章，解释胰岛素如何通过酪氨酸激酶依赖性途径刺激生长和细胞增殖。胰岛素，像生长因子I(RGF-I)，是一调节细胞周期进展的促有丝分裂的多肽。IGF-I和胰岛素是具有内在酪氨酸激酶活性的异四倍体(heterotetrameric)蛋白质。IGF-工作用依赖于与其自身的特异细胞表面受体的结合。胰岛素和IGF-I均活化胰岛素受体底物-I(IRS-1)，一种与mytogenic信号有关的重要的多点(multisite)船坞蛋白质。作为K-ras致癌基因和细胞周期相关激酶如p16突变的结果，mytogenic途径的致活被放大。胰岛素通过活化IGF-I受体而发挥mytogenic对细胞的作用，这导致IRS-1的磷酸化，IRS-1是介导胰岛素生长促进效应的重要调节蛋白。酪氨酸激酶被认为是截短产生的多巴胺序列以造成后受体(post receptor)缺乏，该后受体对于必要的糖皮质激素没有亲合力，但是对于DN(双阴性)T-细胞CD4-和CD8-蛋白质具有亲合力。推理这可以通过蛋白聚糖(proteoglycin)使K+(钾)通道再平衡而使得门极电压建立(buildup)并且允许分泌足够量的醛固酮而被改变。也据信帷幔(valance)正确集合的系列多肽并入蛋白聚糖中将达到这种结果。
糖尿病被认为是顽疾(insidious)，因为目前没有可知的治愈。然而，各种治疗已经用于改善糖尿病。例如，饮食措施已用于平衡患者的蛋白质、脂肪和碳水化合物的相对量。另外，通过施用胰岛素治疗中等或严重程度的糖尿病病况。处方药物如“糖苷”也已用于成年发病的糖尿病以使损害的胰岛素生产再生。其它药物用于调节胰岛素的功效。无论如何，糖尿病的治疗，无论是幼年发病型还是成年发病型，仅仅取得了部分成功。
发明概述依照本发明，提供新的治疗糖尿病的有用组合物。
本发明治疗的发现是基于发明人发现称为Brickelliacalifornica的植物的蒸汽或水提物在控制血糖方面有效。为了使用，收集植物、干燥并且合并沸水。然后，由患者定期口服提取物。Brickellia种属富含类黄酮及其它二级植物产物。除B.californica、B.ambigens、B.arguta、B.brachyphylla、B.cylindracea、B.eupatoriodes、B.glutinosa、B.grandiflora、B.laciniata、B.lemmonii、B.oblongifolia和B.veronicaefolia之外，该种属还包括在民间医药中提到的大量的的和许多种类。该种属的其它种类看起来具有B.californica的一些或全部的活性组分。
已经从Brickellia californica中提取和分馏出特异的类黄酮并且施用于糖尿病患者，结果类似于提取物产生的那些效果。具体地说，类黄酮是二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮，后者是一种黄酮。其后发现这些类黄酮联合最为有效。而且，已经测定了Brickellia类黄酮，特别是是杨梅黄酮并且尤其是毛地黄黄酮，它们单独或者联合，或者与二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮联合在治疗糖尿病方面有效。真正令人惊奇的发现是，毛地黄黄酮在降低血糖和广泛减轻IDDM以及NDDM糖尿病患者症状上特别有效。这些结果是预想不到的，因为世俗之见教导两种类型的糖尿病具有本质上不同的发病原因。发明人发现了控制两种类型糖尿病的“分子开关”。该“开关”由毛地黄黄酮和类似的类黄酮控制。
附图简要描述

图1显示I型糖尿病患者对于每日施用毛地黄黄酮反应34-天的血糖下降情况。
图2显示II型糖尿病患者(KT)一周期间血糖范围情况。
图3显示施用350mg毛地黄黄酮后图2糖尿病患者的血糖下降情况。
图4显示II型糖尿病患者(TC)对于350mg毛地黄黄酮(双份测量法)的血糖反应情况。
图5显示II型糖尿病大鼠对于施用毛地黄黄酮的长期反应情况。
优选实施方案的详细说明提供的下列描述以使得所属技术领域的任何人员能够制造和使用本发明，并且给出实现发明人构思的发明的最好方式。然而，各种变改对于本领域技术人员而言是显而易见的，因为本文已经定义了本发明的总原则，特别是提供了通过施用类黄酮、尤其是通过施用毛地黄黄酮来治疗胰岛素-依赖性和非-胰岛素依赖性糖尿病。
毛地黄黄酮是历史长河中存在的天然分子，例如存在于朝鲜蓟、葡萄、苹果、粟谷类和植物如Brickellia californica中。该分子通常由来自肉桂酸的植物合成得到，其分类属类黄酮，是已知近4千种类黄酮中的一种。毛地黄黄酮可被植物用作刺激和/或抑制基因表达的分子信号传导分子。毛地黄黄酮分子由两个苯环A和B以及一个吡喃环C环构成。该吡喃C环毗连A(苯基)环并在呈平面构型的4和9位形成双键。第三个环或B环在C环的2位通过单键与C环以23-1/2度弯曲相连。吡喃环在环上有一个氧和在共轭环A和C的3位间有一个羰基。A环在5和7位是羟基化的，同时B环在3′和4′位是羟基化的。在2和3位之间是一个双键。发明人已经发现，该双键在3位打开对于使分子呈发挥其效应的δ正相是至关重要的。
芸香苷是具有3位O-糖的毛地黄黄酮苷。在桉树叶和许多花中存在芸香苷；然而；芸香苷没有降血糖的作用但是能够清除自由基并被用于减慢白内障形成和黄斑变性。这表明该类黄酮对白内障有影响并且有别于毛地黄黄酮的作用，而且表明毛地黄黄酮苷对于降低血糖无效。Merck GmbH的Hervwig Bucholtz已经开发了由芸香苷合成毛地黄黄酮，其通过用NaOH和连二硫酸钠除去芸香苷3位的-O-糖。然而，毛地黄黄酮的降血糖作用显示出3位对于降低糖尿病患者的血糖而言是绝对必要的。毛地黄黄酮在3位具有一个δ正电荷，这使得其通过氧键而与其它化合物(糖)键合。该分子通过其δ正电荷离子地吸引六元环糖和五元环糖。毛地黄黄酮具有若干种测得的和可观察到的生物学效应。
毛地黄黄酮是Iodothreonine脱碘酶-一种氧转运激素的配体。通过抑制此激素，减慢通过线粒体壁的氧转运，从而抑制由ADP到ATP的产生和抑制ATP合成酶。而且，吡喃氧和羰基是电子受体的终点。因此，电子梯度是减速的，这是通过没收NAD到NADH和FAD到FADH以及贯穿线粒体壁的电子传递链所用的氢离子而实现的。这减慢了电子向ADP以及ATP形成所需的ATP合成酶的泵送。当ATP形成被抑制，则线粒体呼吸不能产生副产品H2O2。H2O2刺激原位癌基因p56lck上的酪氨酸激酶394和505。参见，″The Activated Form of the LckTyrosine Protein Kinase in Cells Exposed to Hydrogen PeroxideIs Phosphorylated at Both Try-394 and Tyr-505″by Hardwick andsefton JBC Volume 272，number 41 October 19，1997pp.25429-25432(其出版物特别引入本文作为参考)。基因p56lck是CD4-和＜RTI CD8-T细胞增殖所必需的信号转导物。它们是引起糖尿病的T细胞。参见″Quantitative Analysis Comparing All Major SpleenCell Phenotypes in BB and Normal RatsAutoimmune Imbalanceand Double Negative T Cells Associated withResistant，Proneand Diabetic AnimalsM by Dr.M.A.Charleset.al.，Journalof Autoimmunity，1992，Vol 5，pp305-319，(该文章特别引入本文作为参考)。这些T-细胞逃脱胸腺缺失过程并且是自体反应性的。这引起导致胰岛素释放抑制的胰腺β-细胞壁的炎症。毛地黄黄酮清除自由基，参见文章″The Effects of Plant Flavonoids on MammalianCellsImplications for Inflammation，Heart Disease，andCancer″by E.Middleton et.al.，Pharmacological Reviews，Vol.52，No 4，pp.673-751，2000(该出版物特别引入本文作为参考)。一些在B环具有3′和4′位羟基和在A环具有5和7位羟基以及在C环具有吡喃氧和羰基的类黄酮具有此作用。然后，H2O2、O2-、OH-被结合并被环外吸收，结果是，酪氨酸激酶不能被活化和T细胞不能增殖。胰腺β-细胞不发生炎症，胰岛素正常释放。
通过毛地黄黄酮对Iodothreonine脱碘酶的作用而抑制了氧转运，减慢了ADP向ATP的转化，从而使得这些CD4-/CD8-细胞不能被活化。研究已经证实，Mg2+是这些危害性T细胞的因果效应物。如果这些离子被螯合，那么ATP的催化产生则被抑制，电子传递和葡萄糖的氧化连接被抑制。此外，Cu2+在肝脏被螯合，阻止LDL(低密度脂蛋白)的断裂和修饰。这阻止铜催化作用以及产生醛和糖醇如山梨糖醇的O2-结合作用。这些醇降解眼睛的胶原基质，当暴露于UV损伤时通过使胶原脱离蛋白质而导致视网膜病。之后，作为对损伤的和降解的视网膜的保护作用或者通过晶状体蛋白质上醛和醇的直接反应而发生白内障。金属结合性能，类似于双胍的结合性能，螯合Cu2+离子以阻止肝脏糖原的催化分解。这阻止“糖倾泻(sugar dumping)”或由贮存在肝脏的淀粉生成糖。通过螯合催化途径上的离子，糖尿病患者可以使其峰值和继后的神经耗竭变得均匀。这造成糖缺乏和对糖摄取的需要，因此，由于贮存的葡萄糖聚合物耗竭而出现一个波峰。
这个吸收峰迫使已属机能低下(performing poorly)并在被CD8-天然杀伤细胞免疫攻击下的器官需要胰岛素。一些类黄酮通过没收(seques tering)来源于脂质过氧化周期的O-而终止该途径，从而使细胞膜裂成碎片和产生LDLs的管状副产品分流。毛地黄黄酮也与另一元素-氮相结合。一氧化氮在平滑肌和内皮细胞中形成，其副产品是H2O2。通过阻止一氧化氮形成，NO，致使心脏病发作的主要信号转导物，其在通过氧清除和氮结合的步骤中的形成被停止或者减缓。氮与羰基氧和吡喃氧结合形成NO。通过阻止自由基脂质过氧化，对由于缺乏酶防御的氧化性损伤极其敏感的β-细胞得以保护。如果细胞壁的脂肪酸跟着发生酯化，那么，随后产生PLA2，后者进一步加剧导致糖尿病状况的相互作用。这更进一步使β-细胞壁发炎。PLA2导致CD8-天然杀伤细胞的产生，导致异常细胞减少和减轻。正是CD4-和CD8-在cystein处的偶然交叉(crossing)给钙调蛋白和Kv1.3发出信号，开启导致糖尿病长期折磨状态的T-细胞的增殖。
当有害的CD8-天然杀伤细胞与CD4-辅助T细胞在cystein结合，它们以电子学方式刺激钙调蛋白。该电压敏感器激活一个为活化CD4-和CD8-T细胞所必需的80+超基因通道，Kv1.3，一种电压门控的钾通道。如果这个通道不被钙调蛋白激活，那么，T-细胞就保持在静止期。就不会随后发生糖尿病因果律和效应物的传播。最近，加州大学电生理学系的Irvine通过膜片钳分析发现了毛地黄黄酮阻断该通道。在静止期β-细胞上有200个小孔。当细胞电位到达1.3nV，即Kv1.3，电压门控性钾通道打开，暴露出酪氨酸激酶尾部。这些激酶被激活时，开启ras-致癌基因，一种癌启动子，后者开启蛋白激酶C，另一个肿瘤启动子。这些驱动活化T-细胞的核因子如cAMP；其刺激与糖尿病有关的易感基因如染色体19q 13.3上的那些基因。这反过来产生白细胞介素-2，一种促进T-细胞增殖的炎性细胞因子信使。当CD8-细胞遇到(sample)β-细胞的外部受体，它们寻找并与位点的层粘连蛋白(如AGM1)相结合，并且在钙负荷状态下释放白细胞介素-2。此炎性细胞因子引起细胞活化和胰岛素释放抑制。通过阻止ATP和作为其在细胞中，在β-细胞和CD8-细胞中副产品的H2O2的产生，使这些细胞停滞在静止期，停止对β-细胞的侵袭，当被葡萄糖激活时，β-细胞就能够释放胰岛素。当葡萄糖到达β-细胞壁时，电压敏感器钙调蛋白感知葡萄糖的δ正相，就释放胰岛素。但是，如果未经调控，那么也会发生继发的系列反应。β-细胞的细胞壁脂肪酸发生酯化。在此基础上，产生磷酸化磷脂酶A2，激活蛋白激酶C。这些是花生四烯酸级联反应和由PKC标志肿瘤诱发以及脂肪酶产生的副产品，脂肪酶产生表明细胞壁炎症，进一步加剧β-细胞炎症并混合(compounding)β-细胞抑制胰岛素释放的问题。
花生四烯酸激活作用的进一步后果是产生脂加氧酶细胞因子如前列腺素和血栓素(Thromboxanes)。这引起心脏病发作和器官衰竭。同时，产生环加氧酶产物如白细胞三烯和HETE(羟基廿碳四烯酸)家族分子。这些细胞因子，特别是5-HETE和12-HETE，损害遗传产物并导致基因表达改变。DNA中可以形成导致链损伤的环氧化二醇(Epoxidediols)。通过改变导致遗传性疾病的核酸序列，这些环氧化二醇可以引起移码(framne shift)突变。在编码酪氨酸中使用尿嘧啶两次。尿嘧啶在糖上具有一个嘧啶碱基，一个磷酸盐基附着于该核链上。在互补碱基对之间存在氢键作用。自由基和炎性细胞因子可以损伤和中断这种导致不适当密码子序列和核糖体错误结构的氢键。现在，转录物带有错误信息被转录。这刺激癌基因表达和CD8-NK细胞增殖。
钙释放激活的钙通道是一小电导的通道，当不被调控的电压门控或分子阻断时，它释放钙和ATP酶。就是这种缓慢释放造成糖尿病患者永远也达不到释放胰岛素所需的阈值Kv1.7。当葡萄糖促使ATP过早地被释放时，则随后引发其它的并发症。正是ATP的过量产生造成了CD4-/CD8-细胞的激活。
葡萄糖刺激ATP产生并由此产生副产品H2O2，以及因而产生副产品CD4-/CD8-T细胞和磷脂酶A2。葡萄糖被立即加工并且是脑的唯一燃料。然而，它不像在水果或者蔬菜中那样被缓慢释放，因为水果或蔬菜是纤维性的并且以控制方式缓慢释放其申的糖。ATP的过度快速产生和由此来自线粒体的副产品H2O2，以及磷脂酶A2，使得糖尿病大漩涡持续存在和传播(promulgate)。
所有这些循环均是钙驱动的。如果钙在细胞表面被螯合的话，那么，钾就不会被泵出，ATP就不会被释放。那样的话，当达到适当的电位时，可以激活Kv1.7，从而使得β-细胞释放胰岛素。所有炎性细胞因子可被pre-empted，并快速达到释放胰岛素的电力(electronicforce)。毛地黄黄酮通过其在类黄酮带有负电荷的远极末端的羟基螯合钙。电子云，凭着B环的23-1/2°弯曲螯合钙。通过区域邻近的羟基，B环上3′和4′位，和A环上相对于吡喃氧的5和7位，以及在平面共轭环的3和4位之间的羰基，范德华引力进一步增强。由于氧是电子受体的终点，吡喃与碳原子想要接受电子和消除电荷以便整个分子不含有钙的需求而使力量更为加强。这种23-1/2°弯曲的原子作用使得整体上不带钙Ca2+阳离子。此时，钙保持在细胞表面，Kv1.3被阻断，于是电子地建立超极化(hyperpolarize)的钾梯度，从而胰岛素释放通道达到Kv1.7。目前已经发现，毛地黄黄酮透入或许在阻止酪氨酸残基活化方面具有关键性作用的酪氨酸残基上具有直接效应的Kv1.3的孔中。在这种情况下，钙调蛋白不能够使细胞达到Kv1.3，使得超极化到Kv1.7。已经分析的序列中，Kv1.3具有6个氨基酸长的跨膜区域。β-细胞的固有静止期电位是-20nV。当试验100nM的毛地黄黄酮时，细胞停留于其静止期，而Kv1.3完全被阻断。当细胞达到+30-50nV时，Kv1.7活化，打开大约600个小孔并释放胰岛素。
这种说明是为了解释毛地黄黄酮对于胰岛素依赖性(I型)和胰岛素非依赖性(II型)糖尿病均能够治疗的难以置信的和预想不到的功效。长期以来，胰岛素依赖性糖尿病被认为是自身免疫病。毛地黄黄酮抑制T-细胞(上面详述的那样)可以调节或阻止导致I型疾病的自身免疫反应或许不太令人惊奇。初看起来，毛地黄黄酮显示出对于已患的I型糖尿病有效可能是令人惊奇的。世俗之见指出这种糖尿病的全部β-细胞已经破坏。然而，使用强力抗肿瘤剂干扰免疫系统的更近的实验证明，在许多(若非最多的话)胰岛素依赖性糖尿病病例中，自身免疫攻击β-细胞是个渐进的过程。也就是说，存在残余的β-细胞群，但是由于对细胞的持续的免疫攻击而阻止胰岛素释放。在这种情况下，可以预期毛地黄黄酮的抗炎效果挽救这些β-细胞并使得他们更正常地发挥功能。这是可能的情形。然而，更令人兴奋的是发明人发现毛地黄黄酮直接影响Kv1.3。
如上所述，Kv1.3似乎是一系列过程的中心，它导致一定个体在高血糖病症情况下不能释放胰岛素。也就是说，过量的葡萄糖导致生物化学相互作用的级联反应，导致Kv1.3不能使细胞达到足够的电位以使Kv1.7控制胰岛素释放。发明人相信自己是认识到并且证明Kv1.3是糖尿病枢纽的第一人。当毛地黄黄酮或类似的效应物进入分子并与分子结合时，阻止自身免疫性炎症过程(主要控制I型糖尿病)，并且阻止高血糖阻断胰岛素释放作用(主要控制II型糖尿病)。尽管发明人陈述毛地黄黄酮是Kv1.3“糖尿病开关”的优选调节剂，但是，其它与Kv1.3结合并且阻断Kv1.3的分子无疑落入本发明的保护范围。扼要重述的是，发明人已经发现Kv1.3是糖尿病疾病的中心分子。该开关以两种方式运行。第一，它熄灭自身免疫攻击β-细胞所需的T-细胞活化。发明人也已发现，这种被与Kv1.3结合的分子调节的自身免疫在其它自身免疫疾病中也是重要的。第二，与Kv1.3结合的分子，如毛地黄黄酮，直接阻断在II型糖尿病中发现的高血糖阻断胰岛素释放的情形。无庸置疑地，这两种效应均与毛地黄黄酮和类似的Kv1.3结合分子所显示的改善I型糖尿病的作用有关。
以前已经有关于类黄酮可能显示降血糖性质的一些征象。本发明证实，这种性质是由于与Kv1.3结合，并且因此，可以通过测定对Kv1.3的作用而筛选具有降血糖效力的类黄酮和其它化合物。
LW是自13发病的I型胰岛素依赖性的女性患者，使用量滴泵(MiniMed pump)10年。她大约34岁。在接受150mg治疗的基础上，在34天里，每日毛地黄黄酮用量减少到20mg，她减少胰岛素用量50％。观察到，在首次剂量的毛地黄黄酮之后，所需胰岛素用量立即开始减少50％。试验第4周，LW在夜间取下了她的量滴泵。在第2周减少剂量，之后的剂量维持一个控制的线性发展。LW从每日27单位胰岛素开始，到PK(药物代谢动力学)剂量25mg时，每日胰岛素用量为13.5单位。见图1所示，其中粗的水平线表示胰岛素剂量，以mg为单位(左侧是数值)。对角线表示34天期间血糖(右侧数值)从约350mg/dl到约200mg/dl的总落差。
KT是一个II型胰岛素抵抗性的病态肥胖的男性患者，有由于糖尿病和神经病变引发的10年的心脏病病史。他大约50岁。KT每日使用220单位胰岛素而血糖并不下降或者症状并无减轻(见图2七天基线)。在施用毛地黄黄酮3天之内，KT显示出神经病变减轻，正常的神经功能恢复。甚至肢体末端的知觉和触觉功能恢复了。使用毛地黄黄酮19天，血糖从475mg/dl(milliliters per deciliter)下降到74mg/dl(图3)。由于KT的医生评定他不再是糖尿病患者，所以KT回到了他带有复原保险费的工作中。他的血液测试是正常的，HbAlc下降5.9点至接近正常，从13.9到8.0。如图4所示，TC，另一II型糖尿病男性患者，也证实对于毛地黄黄酮具有显著的反应。
CL是一个7岁的I型糖尿病男孩。他的父亲是一个糖尿病患者，同时是个医师。施用毛地黄黄酮之后，CL减少了他的胰岛素用量，完全停止胰岛素点滴5个月。CL的内分泌专家讲，CL的血液检验完全恢复正常。FA是一个II型糖尿病患者，他失去空间定向能力，并且不能工作，甚至不能与他的孩子和妻子在家生活。他大约40岁。在使用称作Setebaid制剂(用非低血糖(nonhypoglycemic)材料制造)的毛地黄黄酮30天内，FA恢复家庭生活，恢复了脸色和健康，回到了工作中，目前他每日胰岛素的用量是从前的1/5。他保持着良好和稳定的行为与亲情关系。DS是一个II型糖尿病女性患者，她45岁(midforties)。她疲劳、谵妄，过量糖在250毫升/DL的范围。服用Setebaid制剂形式的毛地黄黄酮之后，不用其它降血糖物质，她恢复了体力、精力，并且能够恢复全职工作。用单位为毫升/分升糖度计测量，她的糖数值下降至150(mid one hundreds)。
在BRM(Biomedical Research Models，Inc.)，东海岸一个专门进行糖尿病研究的合作研究机构(contract researchorganization，CRO)进行了毛地黄黄酮的动物试验。BRM完成的研究是在保密情况下，使用公认的I型(BB/Wor)和II型(BBZDR/Wor)糖尿病遗传性啮齿动物模型，调查营养制品Setebaid(毛地黄黄酮)的效力而进行的。历史上，这些品种的动物已被广泛地用于类似的临床前研究以预测抗-糖尿病效力。
在慢性I型糖尿病大鼠检验了毛地黄黄酮治疗的效力。在该研究中，把瘦的糖尿病雄性鼠随机分为3试验组(3-4只大鼠/组)。每组接受或者(1)3mg毛地黄黄酮灌胃；(2)皮下注射PZI胰岛素(0.9-1.2mU day)；或者(3)不予以治疗。评价0到6小时(11AM-5PM)的血糖。数据用相对于治疗后的血糖平均值来表示。接受单次注射胰岛素的大鼠显示注射6小时内血糖水平降低75％(从415到112mg/dl)。这种反应与以前使用I型大鼠模型进行研究的结果完全一致。更为显著的是，接受Setebaid(毛地黄黄酮)的糖尿病大鼠显示6小时内血糖水平下降31％(从445到307mg/dl)。相比较而言，对照组在相同间隔时间内高血糖状况并无减少(从414到404mg/dl)。此外，同时施用胰岛素和胰岛素治疗未观察到附加的效应或者协同效应。因此，单次3mg剂量毛地黄黄酮能够在6小时内降低胰岛素-依赖性糖尿病(I型)大鼠的高血糖多达31％。
其次，我们还评价了毛地黄黄酮治疗减少慢性II型糖尿病大鼠高血糖的能力。该研究中，增加毛地黄黄酮治疗的剂量和次数以补偿肥胖大鼠的增强了的代谢能力。首先，在9只慢性II型大鼠进行24小时的基线研究。我们发现在这24小时分析期限内糖尿病大鼠的高血糖无显著的变化。接下来，将前述的这些大鼠随机分为3组并在24hr期间内施用不同剂量的毛地黄黄酮三次(11AM、2PM和8PM。每2小时做血糖分析，予以评价。
一日接受三次50mg最低剂量(共150mg)治疗的大鼠显示，在24小时治疗期间内血糖水平下降10.2％。相比较而言，150mg中等剂量(共450mg)治疗的大鼠显示血糖下降22.9％。接受250mg最高剂量(共750mg)的第三组大鼠显示，葡萄糖的变化最大，下降27.7％。有趣的是，一只被给予中等剂量的大鼠，其血糖在治疗的18hr之内降低52％(777到372mg/dl)。不幸的是，该动物在24小时之前某个时间点由于在灌胃过程中偶然的食管穿孔而致死亡。这些结果表明，毛地黄黄酮治疗明显地降低II型糖尿病大鼠的高血糖，24小时期间降低10-28％，而且这些观测到的结果呈剂量依赖性。
在下一个实验中，我们选择了在延长期限内为前述这些大鼠提供标准剂量的治疗。治疗方案的变化导致血糖的进一步下降。数据用每只大鼠血糖水平相对于各自治疗前水平的变化百分比来表示。
在图5中，除一只大鼠外，几乎所有的用50mg(3次/日)治疗两周的肥胖糖尿病(II型)大鼠显示血糖水平降低(范围36％-54％)。一只显示血液葡萄糖增加9.3％、尸检被发现食管瘘的大鼠，很可能是阻止了有效的给药量和对治疗的反应。总之，II型糖尿病大鼠的血糖水平平均下降41.1％(从660到389mg/dl)这些发现表明，毛地黄黄酮是一个有效的抗糖尿病药物，有应用于临床的前景。
发明人在做草药降血糖试验中首先发现了毛地黄黄酮的效力。确定和采集了若干Brickellia californica活植物。Brickellia是小到中等大小的灌木，具有相对小的裂叶。从采集的植物中砍下约4小枝叶子和茎。每小枝大约3英寸长。把小枝放置于半加仑水中，加热至沸。连续煮沸5分钟，此时从容器中滗出提取物并冷却之。滗出液的颜色是淡褐色。把从Brickellia californica小枝提取出的冷却的提取物施用给4个30到40岁的成年男性。这四个男性均患有糖尿病。每个患者的剂量是每日4至5杯提取物。最初，所有这几名患者每日均自己施用70-80单位的胰岛素。定期测定血糖水平。大约三周后，各个患者的葡萄糖水平开始下降。于是，减少了施用于患者的胰岛素用量。大约6周后，所有患者停止服药就能控制他们的糖尿病病症而无需使用外源性胰岛素。
这些患者患的是成年发病型糖尿病，由于证明普通的抗糖尿病药物无效而使用胰岛素。目前，尚不清楚Briekellia提取物是否引起胰岛素产生增加、胰岛素功能增强(例如，更高数量或更有效的胰岛素受体)或者通过一些非胰岛素介导的机制降低血糖。提取物对于胰岛素依赖性糖尿病好像同样地有效。这表明该型糖尿病残留有胰岛素产生。也据信，β-细胞的连续炎性破坏(前面讨论过)在胰岛素依赖性糖尿病中继续存在。看来很可能Brickellia提取物调节使β-细胞幸存和胰岛素产生的过程。也可能是，提取物也增强残留胰岛素的效力或通过另一尚属未知的机制发挥作用。
采集Brickellia californica植物并予以干燥。使用研钵和杵浸渍干燥的植物体，移入125ml锥形瓶中，用比值为1∶1的氯仿和甲醇混合物进行提取。用磁力搅拌器搅拌混合物4个小时。从烧瓶中倒出并过滤以去除纤维碎屑，在“rotavap”中真空浓缩，得到胶质残留物粗品。残留物在氯仿和甲醇中进行配分(was partitioned)，得到两种标号的馏分，一种是CHCl3标号(更疏水的氯仿可溶组分)，一种是MeOH标号(更亲水的甲醇可溶组分)。
使用装有HP 5MS毛细管柱(30米×250μm×0.25μm)的Hewlett Paekard 6890气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析CHCl3和甲醇馏分。分析条件如下起始温度125℃，保持5分钟，继之以每分钟10℃的的速度升高到275℃，最终温度275℃保持15分钟。用GC-MS分析CHCl3馏分表明，存在一组保留时间在13-15分钟之间的极性类黄酮，一组保留时间在16-18分钟之间的倍半萜烯，和一小组保留时间在20-25分钟之间的脂肪族烃。用GC-MS分析的MeOH馏分产生类似的结果，除外甲醇馏分基本上不含脂肪族烃。
据信Brickellia californica提取物包括类黄酮二氢山萘酚、5，7，4′-三羟基黄酮、毛地黄黄酮、杨梅黄酮和槲皮黄素。此外，许多其它种类的Briekellia含有这些或类似的类黄酮，虽然在比例上不同，但对于治疗糖尿病应当也是有效的。用糖尿病的试验动物(大鼠和小鼠)进行了试验。Brickellia提取物在控制这些模型体系的血糖方面是有效的。并且，施用合成型Brickellia类黄酮在降低葡萄糖水平方面也有效。在涉及单种类黄酮的治疗中，毛地黄黄酮是最有效的药物。然而，有这样的一些迹象毛地黄黄酮与另一个类黄酮特别是二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮联合使用，产生增加的效力，在这点上，用较低的总类黄酮剂量可以最大限度地降低血糖。在毛地黄黄酮的摩尔浓度至少2倍于联合使用的二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮时，这种协同效力似乎最为显著。
无论类黄酮作用的途径是怎样的，结果不是瞬间的。如前面所阐述的那样，Brickellia提取物最大限度地降低血糖需要若干星期。在动物模型中，明显的降低血糖作用需要数天，最大效力需要高达几个星期。这种滞后结果可以解释为什么迄今没有观察到许多含有在本发明中被证明有效的类黄酮的普通水果和蔬菜具有这种效力。看来持续摄入足够量的有效类黄酮是必要的。作为旁白，众所周知，原始人的膳食富含类黄酮，而工业化国家通常的精制膳食相对缺少类黄酮。新的研究已经指出，饮食缺乏类黄酮是心脏和血管疾病的部分原因。如今，糖尿病在世界范围的“流行”似乎也是类黄酮不足的结果。人们已知，素食者发生糖尿病和大量其它退化性疾病的发病率低。世俗之见是，不患糖尿病可能与素餐中精制糖相对少有关。另一种解释是这些膳食中富含类黄酮。
除权利要求要素等同物之外，现在和以后进行对于本领域技术人员而言显而易见的替代也落入权利要求要素限定的保护范围之内。因此，应当将权利要求理解为包括具体例举说明的和前面描述的那些，包括概念等同的那些，包括显而易见替代的那些，还包括本质上体现本发明基本思想的那些。所属领域技术人员将认识到，可以对刚刚描述的优选实施方案进行不背离本发明范围的各种改进和改良。图解的实施方案是为了举例的目的而给出的，它们不作为对本发明的限制。
权利要求
1.抗糖尿病组合物，包括Brickellia种属的植物的水提物。
2.权利要求1的抗糖尿病组合物，其中提取物来自Brickelliacalifornica。
3.抗糖尿病组合物，包括选自下组的类黄酮毛地黄黄酮、杨梅黄酮、二氢山萘酚、5，7，4′-三羟基黄酮、槲皮黄素和它们的混合物。
4.抗糖尿病组合物，由毛地黄黄酮、二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮的混合物组成。
5.权利要求4的抗糖尿病组合物，其中毛地黄黄酮的摩尔浓度至少是同时加入的二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮的2倍。
6.治疗糖尿病的方法，包括施用大量Brickellia属植物的水提物的步骤以使血糖降低。
7.权利要求6的方法，其中提取物来自Brickelliacalifornica。
8.治疗糖尿病的方法，包括施用选自下组的类黄酮的步骤以降低血糖毛地黄黄酮、杨梅黄酮、二氢山萘酚、5，7，4′-三羟基黄酮、槲皮黄素和它们的混合物。
9.权利要求8的方法，其中施用的是毛地黄黄酮、二氢山萘酚和5，7，4′-三羟基黄酮的混合物。
10.权利要求9的方法，其中毛地黄黄酮的摩尔浓度至少是同时加入的二氢山萘酚和5，7，9′-三羟基黄酮的2倍。
11.控制哺乳动物糖尿病的方法，包括向哺乳动物施用与Kv1.3离子通道结合的分子的步骤。
12.权利要求11的方法，其中分子是类黄酮。
13.权利要求书12的方法，其中类黄酮是毛地黄黄酮。
14.控制哺乳动物T-细胞不需要的增殖的方法，包括向哺乳动物施用与Kv1.3离子通道结合的分子的步骤。
15.筛选一组具有抗哺乳动物糖尿病活性的化合物的方法，包括测定该组成员与Kv1.3离子通道结合并阻断之的步骤，其中与Kv1.3离子通道结合并阻断之的成员被选为具有潜在抗糖尿病活性的化合物。
16.筛选一组具有抑制哺乳动物自身免疫反应活性的化合物的方法，包括测定该组成员与Kv1.3离子通道结合并阻断之的步骤，其中与Kv1.3离子通道结合并阻断之的成员被选为具有潜在抑制自身免疫反应活性的化合物。
17.控制哺乳动物糖尿病的化合物，其特征在于该化合物与Kv1.3离子通道结合并阻断之。
全文摘要
类黄酮特别是毛地黄黄酮显示出对胰岛素依赖性(I型)和胰岛素非依赖性(II型)糖尿病均有效。据证实，毛地黄黄酮在哺乳动物体内通过与T－细胞和β－细胞的K
文档编号G01N33/68GK1592628SQ02823420
公开日2005年3月9日 申请日期2002年9月25日 优先权日2001年9月27日
发明者兰迪H·齐格勒 申请人:兰迪H·齐格勒