专利名称：一种化学发光增强型检测农药残留的方法
技术领域：
本发明涉及一种农用化学品的分析方法，特别涉及一种痕迹量农用化学品的化学发光分析检测方法，具体地说是一种利用表面配位抑制自由基清除原理发展的化学发光增强型检测农药残留的方法。
背景技术：
农药作为一种重要的农业生产资料，在防治作物病、虫、草害，保证农业丰收，促进高产、优质、高效现代化农业发展等方面发挥着不可替代的作用。然而，无节制的农药使用已经对生态坏境、食品安全和人体健康构成了严重威胁，同时也成为国际贸易争端的焦点之一。由于实际样品中农药残留组分含量往往很小，共存组分复杂，因此建立快速、高灵敏、 高选择性的分析方法在农残检测中显得尤为迫切，这对于保护生态环境、保障人类健康、减少农业损失、促进经济发展具有十分重要意义。我国的农药残留分析技术始于20世纪50 年代，近年来出现了不少行之有效的鉴别和分析检测方法。目前，农产品中农药残留的实验室分析与检测主要依赖于大型仪器来完成，例如，气相色谱法、液相色谱法、气-质联用分析法等。这些方法灵敏度高，但是所需要仪器昂贵，样品前处理复杂、耗时长并且无法做到现场检测。未来的农残检测要求向快速现场、廉价、减少溶剂、减少对环境污染、微型化和自动化方向发展，这是国家和社会亟待解决的挑战性难题。化学发光分析以其灵敏度高、仪器设备简单、分析快速和容易实现自动化等优点， 在生化分析、环境监测及食品安全等领域发挥着重要作用。近年来，利用化学发光方法检测农药残留也受到人们的关注。Roda等人利用农药抑制乙酰胆碱酶(AchE)活性的原理，采用流动注射化学发光法检测了对氧磷、涕灭威等有机磷农药，对氧磷和涕灭威的检测限分别是0. 75y g I71和g L'与其它检测系统相比，该方法简单、快速，而且有更高的灵敏度和重现性。Ayyagari等报道了基于碱性磷酸酯酶催化化学发光检测了乐果。碱性磷酸酯酶可以催化含磷酸酯发生去磷酸化作用，乐果抑制磷酸酯酶的行为，产生微弱的发光信号， 检测限为500ppb。Gao等将酶固定在纤维尖端催化反应，产生的发光信号通过同一根纤维收集、传递到CCD检测器检测。此外，Pande等利用生物共聚物固定碱性磷酸酯酶在一个玻璃毛细管内壁，对甲基对硫磷等进行了检测，检测限达500-700ppb。这些检测农药残留的化学发光体系都利用酶来改善检测敏感性和选择性，因此使用寿命短、价格昂贵，不利于推广使用。此外，有人报道利用有机磷农药形成氧化能力更强的过氧化磷酸酯发展出化学发光增强型农残检测传感器，然而这种增强检测方法敏感性和选择性均较差。目前，利用表面配位抑制自由基清除原理构成的化学发光增强型传感器尚无文献报道，其对农药残留的检测更是无人涉及。

发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，旨在提供一种快速检测灭线磷、丙溴磷等含至少一个硫磷单键的有机磷农药(硫赶式硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)残留量的方法，所要解决的技术问题是利用农药在类酶活性粒子表面的配位去抑制自由基清除以实现化学发光增强检测。所述的化学发光信号是由于类酶活性粒子催化水中的溶解氧产生过氧负离子，继而氧化化学发光剂鲁米诺产生化学发光；这时若加入自由基清除剂，由于产生的自由基被消耗(亦称自由基清除)，因此化学发光信号减弱直至消失(猝灭)。发光信号减弱直至猝灭与自由基清除剂含量之间存在一定的线性关系。含至少一个磷硫单键的有机磷农药在类酶活性粒子表面的配位作用有抑制自由基清除剂清除自由基的作用，因此与只加入自由基清除剂的空白相比，化学发光强度明显增强，据此可确立样品浓度与化学发光强度之间的线性关系。本发明正是利用类酶活性粒子催化溶解氧形成过氧负离子以及表面配位抑制自由基清除等性质，将其联合应用到化学发光检测中，开发出一种化学发光增强型检测方法。所述的化学发光增强是指以只加入自由基清除剂的鲁米诺化学发光体系(空白) 为参考，将农药和自由基清除剂一起加入到类酶活性粒子溶液后，再加入发光剂鲁米诺溶液，这时体系化学发光强度与空白相比明显增强，当自由基清除剂的含量和鲁米诺的含量一定时，随着农药浓度的增加，化学发光强度逐渐由弱到强。待测样品浓度变化范围对应化学发光强度变化的过程。这就是说通过化学发光增强模式确立起待测样品浓度与化学发光强度之间的线性关系，从而实现待测样品的定量检测。本发明技术方案的关键是确立待测样品浓度的增加与化学发光强度由弱到强的变化之间的线性关系，发光强度的变化是以空白体系为参考比较得到的。本发明的技术方案包括类酶活性粒子的制备和鲁米诺化学发光体系的建立，与现有技术的区别是所述的化学发光增强是将含至少一个磷硫单键的系列浓度有机磷农药样品和自由基清除剂一道加入类酶活性粒子溶液中，然后加入化学发光剂鲁米诺溶液，此时与只加入等量自由基清除剂的空白相比，化学发光强度明显增强，据此确立样品浓度与化学发光强度之间的线性关系。所述的鲁米诺化学发光体系是由鲁米诺水溶液(水中有溶解氧)和类酶活性粒子所构成。若在该体系中加入自由基清除剂则构成空白体系。所述的类酶活性粒子是具有类酶催化活性的纳米粒子，选自磁性Fe3CVCoFe2O4粒子或ZnO、ZnS等半导体粒子或Au、Pb等贵金属粒子以及各种复合结构。所述的自由基清除剂选自乙醇或甲醇。在本发明中由于化学发光源自两种溶液的混合，为获得最大的化学发光强度，每种溶液存有一最佳使用浓度，鲁米诺溶液最佳使用浓度为I X 10_4M，对磁性Fe3O4纳米粒子最佳使用浓度为25 μ g/mL。当选择磁性Fe3O4纳米粒子和质量百分浓度99%乙醇为自由基清除剂时，可以将含至少一个磷硫单键有机磷农药样品溶于99%乙醇后加入浓度为25 μ g/mL、pH = 2的磁性Fe3O4纳米粒子溶液中，然后加入浓度I X 10_4M的鲁米诺溶液，与只加入等量99%乙醇的空白相比，发光强度明显增强，据此确立样品浓度和发光强度之间的线性关系。当线性关系确立后就可按常规操作对实样进行农药残留的检测。本发明的优点和积极效果本发明首次利用表面配位抑制自由基清除的原理，设计出化学发光增强型传感器，可用于特定农药成分的敏感检测。以有机磷农药灭线磷为例，其线性范围为0. I 1000nmol/L 和 I 100 u mol/L,检出限为 0. lnmol/L。本发明方法具有化学发光传感器的一切优点，如无需大型仪器，方便快速，灵敏度高，效果显著。化学发光抗干扰能力差，由于实样中成分复杂因此会严重干扰化学发光信号。在该方法中，可通过磁性分离的方法克服实样成分的干扰。因此不需要富集等复杂的前处理过程，操作更简单，成本更低。
四

图I是利用表面配位抑制自由基清除原理构筑的化学发光增强型传感器示意图。图2是对灭线磷的化学发光增强检测以及对应的线性关系图。图3是化学发光增强型传感器对果汁、绿茶中添加农药的检测原理和结果图。图4是化学发光增强型传感器的选择性测试图。
五具体实施例方式现以质量百分浓度99%乙醇为自由基清除剂和磁性Fe3O4纳米粒子为例非限定实施例叙述如下I、磁性Fe3O4纳米粒子的制备参考文献L. Z. Gao et al, Nat. Nanotech.，2007，2，577 报道的共沉淀方法。将10 ii L的HCl加入20mL去离子水中，通氮除氧30分钟后，加入2. 4g的 FeCl2 *4H20和4. 6g的FeCl3 6H20，超声溶解后经过滤转移到80mL通氮除氧过的去离子水中，并保持氮气气氛。随后，将IOmL的氨水逐滴加到上述溶液中，溶液迅速变黄，且颜色逐渐加深，进而变黑。滴加完毕，将体系升温至40°C，反应0. 5小时，再升温到85°C反应2小时。经离心洗涤后重新分散到去离子水中，备用。从XRD花样可以看出得到的粒子是立方相Fe3O4,晶粒尺寸10nm。使用前将磁性粒子稀释到pH = 2的去离子水中，浓度为25 u g/
mLo2、灭线磷浓度与发光强度之间线性关系的确定将灭线磷溶解在乙醇溶液中，配成系列浓度(1-60 U M)的溶液。将30 ii L的磁性粒子稀释液加入化学发光仪96孔板的孔中，再加入30 y L的灭线磷乙醇溶液，振荡IOs后， 加入90 y L鲁米诺溶液测试该孔的化学发光，以最强峰为标准。为确定化学发光检测信号， 需以单纯加入30y L乙醇的体系发光为参考，通过对比可以看出，灭线磷增强了化学发光， 并且随着灭线磷浓度的增加化学发光强度逐渐增加，如图2A所示。因此可通过计算化学发光的增强量来定量分析灭线磷的浓度，图2B所示，其线性范围有两部分构成，分别为0. I 1000nmol/L 和 I 100 u mol/L,检出限为 0. lnmol/L。3、对葡萄汁和绿茶中添加农药的检测如果直接检测葡萄汁中的农药分子，由于内部成分的干扰将不能获得化学发光信号。而在本方法中，通过磁性粒子的吸附-分离-再分散的过程(图3)，可有效克服实样成分的干扰，从而实现对实际样品的检测。典型的，将含一定浓度农药灭线磷的乙醇溶液添加进葡萄汁中，搅拌5分钟后加入磁性粒子，继续搅拌10分钟使农药配位结合到粒子表面，然后，通过外加磁场将磁性粒子分离，弃去果汁溶液再添加一定量的去离子水(pH = 2)，控制粒子浓度为25μ g/mL。按照同样的步骤，在葡萄汁中加入不含农药的乙醇溶液得到参考粒子溶液。按照步骤2进行化学发光测试与检测，由于农药分子已经配位结合到磁性粒子上， 因此只需加入30 μ L的乙醇即可。同样的过程也被用于绿茶中添加农药的检测，但是由于更加复杂的成分，需要进行两次分离-再分散的过程。4、磁性Fe3O4纳米粒子的选择性测试化学发光敏感性高，但选择性差。本发明对磁性Fe3O4纳米粒子选择灭线磷ΕΡ、丙溴磷PF、敌百虫DL、毒死蜱CP、甲基对硫磷ΡΜ、2，4- 二氯苯氧乙酸2，4_D进行测试。如图4 所示，在浓度均为I X KT4M的条件下，灭线磷引起化学发光强度18倍的增强，丙溴磷的增强倍数为10，而其它农药对化学发光基本没影响。对比上述几种农药的分子结构，可以看出该体系可以选择性检测含有硫磷单键的农药成分如灭线磷、丙溴磷。
权利要求
1.一种化学发光增强型检测农药残留的方法，包括类酶活性粒子的制备和鲁米诺化学发光体系的建立，其特征在于所述的化学发光增强是将含至少一个磷硫单键的系列浓度有机磷农药样品和自由基清除剂一道加入类酶活性粒子溶液中，然后加入化学发光剂鲁米诺溶液，此时与只加入等量自由基清除剂的空白相比，化学发光强度明显增强，据此确立样品浓度与化学发光强度之间的线性关系。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的类酶活性粒子是具有类酶催化活性的纳米粒子，选自磁性Fe3O4XoFe2O4粒子或ZnO、ZnS半导体粒子或Au、Pb贵金属粒子以及各种复合结构。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的自由基清除剂选自乙醇或甲醇。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于将含至少一个磷硫单键的系列浓度有机磷农药样品溶于99%乙醇后加入浓度为25 μ g/mL、pH = 2的磁性Fe3O4纳米粒子溶液中， 然后加入浓度1X10_4M的鲁米诺溶液，与只加入等量99%乙醇的空白相比，发光强度明显增强，据此确立样品浓度和发光强度之间的线性关系。
全文摘要
一种化学发光增强型检测农药残留的方法，包括类酶活性粒子的制备和鲁米诺化学发光体系的建立，所述的化学发光增强是将含至少一个磷硫单键的系列浓度有机磷农药样品和自由基清除剂一道加入类酶活性粒子溶液中，然后加入化学发光剂鲁米诺溶液，此时与只加入等量自由基清除剂的空白相比，化学发光强度明显增强，据此确立样品浓度与化学发光强度之间的线性关系。本发明首次利用表面配位抑制自由基清除的原理，设计出化学发光增强型传感器，可用于特定农药成分的敏感检测。以有机磷农药灭线磷为例，其线性范围为0.1～1000nmol/L和1～100μmol/L，检出限为0.1nmol/L。
文档编号G01N21/76GK102590192SQ20121003733
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者关贵俭, 张忠平 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院