专利名称：一种土拉弗朗西斯菌检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种土拉弗朗西斯菌检测试纸。
背景技术：
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，Tula)简称土拉菌，该菌能引起“土拉 热”的人畜共患病，感染者会出现皮肤溃烂、淋巴腺肿大、肺部感染和伤寒样症状，病情严重 甚至死亡。该菌具有分布广泛，传播途径多样，感染剂量低、致病性强等特点。注射lOcfu、 与皮肤接触10-50cfu、或摄入IO2-IO8Cfu该细菌都能导致土拉菌病感染。因此该细菌被列 为与鼠疫、炭疽等同列的A类恐怖源，已引起全世界的高度重视。《禁止化学武器公约》也将 土拉热也被列为最为严格的控制对象。生物安全问题已引起全球关注，美国疾病预防控制中心将土拉菌列为最有可能用 于生物武器的病原体。从国家生物安全战略高度看，我国境内，尤其是出入境口岸应加强对 土拉菌的反生物恐怖的研究。反生物恐怖的首要任务是迅速作出诊断，明确病原，以便及时 正确救治病人，减少继发性传播，迅速有效地控制和防治疫情的蔓延。胶体金标记的免疫层 析方法具有快速、简便、不需要依赖重要装备、能够实现现场检测等特点，成为目前传染病 快速诊断中研究的热点。

实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，其能快速、灵敏、特 异、准确地检测样品中的土拉弗朗西斯菌，适用于现场快速检测。为实现上述目的，本实用新型一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，包括反应支撑物、紧 密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分 重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与含有胶体金标记的i^opA-S多克隆抗体的金标抗体 保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜 上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控条带、靠近其末端处设置有兔抗重组i^opA-L 多克隆抗体检测条带。进一步，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。进一步，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚酯膜或滤纸纤维。进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯膜或滤纸纤维。进一步，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有 样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。本实用新型的土拉弗朗西斯菌检测试纸，基于纯化的R)PA多抗标记胶体金，构建 双抗体夹心法检测抗原，具有操作简单，检测时间短，无需专业人员，适合快速现场检测等 优点。
图1为土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析试纸条的目测敏感性图；[0013]图2为特异性检测试验图；图3为土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析试纸条模拟样品检测图；图4为本实用新型检测试纸的拟合直线图；图5A为本实用新型检测试纸的正面示意图；图5B为本实用新型检测试纸的侧面示意图；图6A为本实用新型检测试纸的阳性检测结果示意图；图6B为本实用新型检测试纸的阴性检测结果示意图；图6C为本实用新型检测试纸的无效检测结果示意图。
具体实施方式
如图1至图4，图5A、图5B、图6A、图6B、图6C所示，图1是土拉弗朗西斯菌胶体 金免疫层析试纸条的目测敏感性图，1-5分别表示检测的样品浓度依次为空白对照、75ug/ mL、7. 5ug/mL、750ng/mL、375ng/mL。如图 1 所示，75ug/mL、7. 5ug/mL、750ng/mL 为阳性反应； 375ng/mL无阳性反应；即肉眼可观察到的最低浓度为750ng/mL。图2为特异性检测试验图，1表示检测750ng/mL的马秋波GP2蛋白，2表示天花MlR 蛋白，3表示禽流感NP蛋白，4表示登革病毒Deng-E-D3蛋白，5表示普氏立克次体120N蛋 白。图3为土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析试纸条模拟样品检测；测试条1 阴性对 照、2 5 分别为含R)PA蛋白750ng/mL梨汁、面粉、饼干、果冻。图5A、图5B中，1 吸水垫；2 硝酸纤维膜，T 包被兔抗重组R)PA_L多克隆抗体检 测条带；C 包被羊抗兔IgG的质控条带；3 含有胶体金标记R)pA-S多克隆抗体的玻璃纤维 膜；4 样品垫；5 反应支持物。图6A、图6B、图6C是本实用新型的检测结果示意图；出现T、C两条线表示阳性； 只出现C 一条线表示阴性；T、C两条线均不出现表示无效。本实用新型采用胶体金标记，实质是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒 表面的包被过程。胶体金对蛋白质的吸附主要取决于PH值和蛋白质的最小稳定浓度，离子 浓度和蛋白质分子量等也影响二者之间的吸附。本实用新型发现在胶体金检测试纸条的制 备过程中PH值和离子浓度条件是关键，胶体金是一种很不稳定的胶体，通常认为，在pH值 等于蛋白质等电点或较高于等电点时吸附效果最好，而且易形成牢固的复合物来稳定胶体 金。此时蛋白质分子主要呈电中性，与胶体金颗粒相互静电吸引力较小，而蛋白质分子的表 面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，因此较易吸附于金颗粒的表面形成一个蛋白质 层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，使胶体金处于一个相对稳定状态。当PH值低于蛋白质 的等电点时，蛋白质主要带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易结合形成大的聚合物而失去 结合蛋白质的能力。PH值高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互 排斥而不能互相结合。因此常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作为稳定剂来防 止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀。经本实验证明本系统采用牛血清白蛋白作为稳定剂，其 特异性、敏感性都很好。本实验经过多次条件摸索得出K+对整个胶体金检测系统的影响较 大，所以在选择抗体稀释液、样品处理液等都要避免引进Κ+，也可以采用透析去除K+。本实用新型提供一种方便、快捷地检测土拉弗朗西斯菌检测试纸，同时可利用金 标免疫分析仪进行的半定量检测方法。该检测试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸上结合的捕获抗体显色。本实用新 型还涉及制备上述检测试纸的制备方法。本实用新型能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的土拉弗朗 西斯菌，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。一种方便、快捷地检测土拉弗朗西斯菌的方法，其中包括将待测标本与样品稀释 液混勻，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟 判读结果；所述检测试纸包括(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组R)pA-L多克隆抗体和质控抗体的检测条带 和质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的R)pA-S多克隆抗体；(5)样品垫，采用含有吐温20的磷酸盐缓冲液对玻璃纤维素膜进行预处理；其中反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸，硝酸纤维膜依次包被羊抗兔IgG、兔 抗重组R)pA-L多克隆抗体lmg/ml，金标抗体保护膜为含有胶体金标记的R)pA-S多克隆抗 体的玻璃纤维膜或聚酯膜或滤纸纤维，样品垫选用玻璃纤维膜或聚酯膜或滤纸纤维。本实用新型土拉弗朗西斯菌检测试纸，其中吸水垫、硝酸纤维膜、金标抗体保护 膜、样品垫和反应支持物按照附图5A所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2 位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗重组R)pA-L多克隆抗体检测条带，并且C 处是羊抗兔IgG包被的质控条带；玻璃纤维膜3位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重 叠，该膜含有胶体金标记的i^opA-S多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于 玻璃纤维膜3而言的另一侧并与2部分重叠。样品垫4位于2上与1相反的一侧并与3部 分重叠。本实用新型土拉弗朗西斯菌检测试纸，以吸水垫一侧为末端，样品垫一侧为末端， 兔抗重组！^叩々-!^多克隆抗体检测条带位于接近起始端，羊抗兔IgG包被的质控条带接近于 起始端。本实用新型土拉弗朗西斯菌检测试纸的制备方法，该制备方法包括以下步骤胶 体金探针的制备，金标垫的制备，硝酸纤维膜的喷涂包被，样品垫的预处理。1、胶体金探针的制备(1)将HAuC14先配制为0. 01%水溶液。磁力搅拌下准确加入Iml 的HAuC14， 同时加入1. 5-3ml 的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水补 足至100ml，4 °C避光保存。(2)用K2CO3调PH值为约6-8，优选为约7. 0-8. 0，更优选约7. 0-7. 5后。(3)将胶体金调至pH 7. 0-7. 5，用PBS稀释抗体至0. 2mg/ml。(4)保持胶体金稳定。本实用新型还提供一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的方法，该方法 包括a.取10支洁净的1. 5ml离心管，分别加入胶体金溶液Iml。b.在 1-10 号管内分别加入 10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、IOOml的PB,再依次加入稀释好的0. 2mg/ml的待标记抗体90ml、80ml、70ml、60ml、50ml、 40ml、30ml、20ml、10ml、0ml，混勻，静置 2 分钟。c.在10个管内分别加入10% NaCl溶液100ml，混勻后室温静置2小时，观察颜色变化。未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化， 而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(1号管)相 比，颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为Iml胶体金所必须的抗体稳 定剂量，在此基础上再加20%抗体，即为抗体最佳标记剂量。本实用新型经过反复试验和 分析，得出的结果表明维持胶体金溶液适宜抗体量为2-lOug，优选抗体量2-8ug，更优选 3-6ug，最优选为3-5ug。2、金标垫的制备取上述pH的胶体金以Iml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中为2_10ug， 优选抗体量2-8ug，更优选3-6ug，最优选为3-5ug，轻摇混勻后放置。每管中加入10%的 BSAlOOul，混勻放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000rpm、4°C下离心30分钟，弃上 清液。每支离心管中加入Iml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液，管底得到暗红色的 疏松状沉淀，加入500ul重悬液重悬后于4°C，lOOOrpm，离心10分钟；取上清液，均勻滴加 在Icm宽的玻璃纤维上，37°C干燥。3、硝酸纤维膜的喷涂(1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被检测兔抗重组R)pA_L多克隆 抗体和质控羊抗兔IgG两个条带的硝酸纤维膜；在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是lO-lOOmm/s，更优选是45-55mm/s，最 优选是50mm/s ；所述兔抗重组R)pA-L多克隆抗体，其加入量为l_5mg/ml，该多克隆抗体的 稀释液可以为PB ；质控羊抗兔IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0. l-5mg/ml更优 选是 0. 5-2. 5mg/ml，最优选为 lmg/ml ；(2)制备一种含有胶体金标记的R)pA-S多克隆抗体的玻璃纤维膜，将胶体金标记 的R)pA-S多克隆抗体均勻涂布在玻璃纤维膜上。抗体用PBS稀释，pH为6-8，优选7_8，最 适 PH 值为 7. 0-7.5。本实用新型还公开了所述试纸在检测土拉弗朗西斯菌中的应用，参见附图3。在本实用新型检测土拉弗朗西斯菌的方法中，先将待测标本放入装有稀释液的小 瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸的样品垫4处(即末端)，样品中的液体依靠虹吸 作用上行，一般需10-15分钟判读结果如标本中含有土拉弗朗西斯菌，则它将与试纸上胶体金标记的R)pA-S多克隆抗 体形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维膜上的兔抗重组i^opA-L多克隆抗体结 合，形成红色线条，即在“T”处形成红色条带。无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多克隆抗体继续随液体继续上行并与该 膜上的羊抗兔IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失 效，此线就不会出现，说明试纸失效。如图6所示。阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说 明试纸失效。如若肉眼无法辨别T处红色条带，可利用金标免疫分析仪进行半定量检测。[0061]本实用新型的技术方案是采用兔抗重组R)pA-L多克隆抗体和羊抗兔IgG分别固 相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的i^opA-S多克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原 理检测标本中的土拉弗朗西斯菌。本实用新型还提供一种将胶体金测试条与胶体金生物传感器有机整合的定量检 测土拉弗朗西斯菌的检测系统。运用胶体金测试条判读仪的优势在于，判读仪能够在人眼 无法正确识别可疑物检测是否存在阳性的情况下，正确判读该试纸条检测结果。减少了因 人为主观判读带来的错误率，增加了客观性、准确性；并且可实现定量检测。此外，胶体金判 读仪携带方便、使用简单、判定准确、结果客观、易保留，为检验检验工作带来了方便。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌检测试纸，它还包含金标抗体保护膜。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌检测试纸，其中金标抗体保护膜选用聚酯 膜、玻璃纤维或滤纸纤维。实施例1 胶体金免疫层析试纸条的制备材料和方法1、抗原及抗体兔抗重组R)pA-L多克隆抗体、FopA-S多克隆抗体由中国检科院卫生检疫所提供。 羊抗兔IgG(购自鼎国生物技术公司)2、层析测试条耗材结合垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF 1350225)、样品垫及吸水垫、滤纸 购自Minipore公司。3、实验仪器金标免疫分析仪可购自中国科学院上海光学精密机械研究所、中国检验检疫科学 研究院联合研制的分析仪。4、胶体金免疫层析试纸条的制备4. 1胶体金结合垫将pH值7. 0 7. 5、浓度0. 2mg/ml的R)PA_S多克隆抗体标记于柠檬酸钠法制备 25nm的胶体金颗粒的胶体金颗粒，37 °C干燥。4. 2硝酸纤维素膜检测带兔抗重组R)pA-L多克隆抗体lmg/ml ；质控带羊抗兔IgG :lmg/ml，37°C干燥。4. 3 组装将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在带有豁合剂的底衬卡，切成0. 4cm的条，干燥， 装壳，室温贮存备用。实施例2 样品的定性和定量检测的判定1、样品的处理(1)液体一梨汁首先用缓冲液分别以适当的比例稀释混勻；(2)固体/半固 体一称取白色粉末(面粉、饼干)和半固态果冻加入缓冲液溶解后，取溶解后的上清溶液 将重组土拉菌R)pA蛋白分别加入其中使R)PA蛋白的终浓度达750ng/mL。
7[0085]表1 土拉菌样品检测及灵敏度
权利要求1.一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，其特征在于，该检测试纸包括反应支撑物、紧密连接 于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连 接、硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面 部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控 条带、靠近其末端处设置有兔抗重组i^opA-L多克隆抗体检测条带。
2.如权利要求1所述的土拉弗朗西斯菌检测试纸，其特征在于，所述反应支持物为PVC 板，吸水垫为滤油纸。
3.如权利要求1所述的土拉弗朗西斯菌检测试纸，其特征在于，所述金标抗体保护膜 为玻璃纤维膜、聚酯膜或滤纸纤维。
4.如权利要求1所述的土拉弗朗西斯菌检测试纸，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤 维膜、聚酯膜或滤纸纤维。
5.如权利要求1所述的土拉弗朗西斯菌检测试纸，其特征在于，所述试纸整体的外部 包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检 测条带处设置有观察窗。
专利摘要本实用新型公开了一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与含有胶体金标记的FopA-S多克隆抗体的金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控条带、靠近其末端处设置有兔抗重组FopA-L多克隆抗体检测条带。本实用新型利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的土拉弗朗西斯菌，并可实现定量，适用于现场快速检测。
文档编号G01N33/52GK201903545SQ20102028702
公开日2011年7月20日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者景滢滢, 杨宇, 王振东, 王静 申请人:中国检验检疫科学研究院