专利名称：用于诊断肺炎链球菌的试验的制作方法
技术领域：
在此描述了用于诊断细菌性感染的试剂和方法。
背景技术：
社区获得性肺炎(CAP)是最常见的儿科感染之一，是工业化国家发病率的主要原 因，是全世界五岁以下儿童发病率的最重要原因(Mulholland K5Lancet 2007 ；370 (9583) 285-9) ；Pio A, BffHO ；2003 ；81(4) :298_300)。CAP可由多重因子单独或组合引起，包括 呼吸道病毒(respiratory viruses)、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原 体(Yin CC Respirology,2003 ；8(1) 83-9 ；Chiang WC Respirology2007 ； 1 2(2) 254-6 1 Juven T PIDJ 2000 ； 19 (4) :293_8)。在幼儿中病因诊断是特别具有挑战性的，在幼儿 中血培养通常仍然是阴性的，支气管分泌物是罕见地可取得的，并且频繁的鼻咽部带菌 (carriage)限制了微生物检测的有用性。尽管如此，越来越多的用于病原体检测的试验提 高了鉴定致病因子的可能性(Wang Pediatr Pulmonol 2008 feb43(2) 150-9 ；Nakayama E J Infect Chemother 2007,13(5) :305_13)，并且使用现代诊断工具的最新研究已经重复地 将肺炎链球菌鉴定为CAP的最重要原因，在初级保健和医院环境中均是如此(Juven T PIDJ 2000 ； 19 (4) 293-8 ；Michelow IC ；Pediatrics 2004 ； 113 (4) :701_7)。防备肺炎球菌感染的保护基本上是由促进调理吞噬的抗体介导的。这样的抗体可 指向肺炎球菌多糖(PPS)或肺炎球菌表面蛋白(PSP)。在不存在肺炎球菌免疫的情况中，这 样的抗体是由肺炎球菌的暴露、定植和/或感染引出的。因此，对抗肺炎球菌抗原的保护性 抗体的缺乏是婴儿和幼儿对肺炎球菌疾病易获病性的基础。尽管某些具有极好特异性和阳 性预测价值的PSPs已经被用于肺炎球菌感染的血清学诊断，但这样的研究已经时常被儿 童中的低灵敏度所限制。这在很大程度上归因于干扰血清学分析的更高定植传播(Scott， et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005)。肺炎球菌性肺炎的病因诊断仍然是具有挑战性的，特别是在幼儿中。基于血培养 或DNA扩增的微生物诊断具有高的特异性但在罕见菌血症的儿童中具有低的灵敏度。相 反，鼻咽定植的高比率限制了在鼻咽样品或尿样中检测细菌和/或其片断的试验的灵敏度 (Dowel 1, S. F.，Clin. Infect. Dis. 2000 32 :824_825)。对肺炎球菌性肺炎血清学诊断的稳 健方法学的探索已经遇到了许多困难{Kanclerski，J Clin Microbiol 1988 ；Korppi Μ, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007)。社区获得性肺炎(CAP)在幼儿中经由传统实验室方法的诊断是特别具有挑战性 的。本领域需要用于准确和快速诊断CAP的试剂和方法，特别是在幼儿中。这种需要涉及 个体诊断，它要求提供具有高灵敏度和阴性预测值的快速结果的试验以避免无用的抗生素 给药，并且在流行病学研究中要求具有用于最佳诊断标准的高特异性和阳性预测值以及适当灵敏度的试验以正确地估计疾病负担。在此描述了用于准确和快速诊断CAP的试剂和方法。附图简述

图1.入院时的抗-PSP血清IgG抗体。图2.抗-PhtD IgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。图3.抗-PhtE IgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。图4.抗-Ply IgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。图5.抗-PcPA IgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。发明概述在此描述了使用一种或更多链球菌抗原检测生物样品中的抗-链球菌抗体的试 验。多种抗原单独或抗原的组合可用于这些试验中。例如，可进行该试验以检测与下列发 生免疫反应的抗体Ply和一种或更多的PhtD、PhtE, LytB和PcpA ；PhtD和一种或更多的 Ply、PhtE, LytB 和 PcpA ；PhtE 和一种或更多的 Ply、PhtD、LytB 和 PcpA ；LytB 和一种或更 多的Ply、PhtD、PhtE和PcpA ；和/或PcpA和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和LytB。在此 描述的这些试验也可与其他链球菌抗原相互和/或一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和 /或PcpA组合使用。以这种方式，增加了试验的灵敏度并改善了阴性预测值。发明详述在此描述了在此提供的用于准确和快速诊断社区获得性肺炎(CAP)的试剂和方 法。在此描述的这些试验克服了在儿童中由只有一种或少数免疫原性肺炎球菌抗原的传统 使用造成的基于肺炎球菌表面蛋白(PSP)的免疫测定的低灵敏度。通过检测患者的血清或 其他生物液体中针对细菌抗原组合的抗体，可做出CAP诊断。如在此所显示的，多种PSPs 被用作免疫学探针以评价因CAP住院的幼儿中由既往暴露和急性肺炎球菌感染驱动的体 液免疫模式。在一个实施方式中，所述抗原可选自肺炎球菌溶血素(pneumolysin) (Ply)、 PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA。这五种肺炎球菌表面蛋白的序列在肺炎球菌菌株之间在很 大程度上是保守的(> 95-98% )，使得它们可用作暴露于肺炎链球菌的标志物以及疫苗候 选者。肺炎球菌溶血素(Ply)是细胞溶解激活的毒素，它牵涉于肺炎球菌发病机制的多 个步骤，包括纤毛搏动的抑制和上皮细胞之间紧密连接部的断裂(Hirst et al. Clinical and Experimental Immunology (2004))。几种肺炎球菌溶血素是已知的，并适用于实践在此 描述的试验，包括，其中例如GenBank登记号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和AB021381中的那 些。在一个实施方式中，Ply具有SEQ ID NO. :1中所显示的氨基酸序列。适用于实践在此描述的试验的PhtD多肽包括，其中例如，GenBank登记号 AAK06760、YP816370和NP358501中的那些。在一个实施方式中，PhtD具有SEQ ID NO. 2 中所显示的氨基酸序列。适用于实践在此描述的试验的PhtE多肽包括，其中例如，GenBank登记号 AAK06761、YP816371和NP358502中的那些。在一个实施方式中，PhtE具有SEQ ID N0. 3 中所显示的氨基酸序列。 适用于实践在此描述的试验的LytB多肽包括，其中例如，GenBank登记号 CAA09078、YP816335、ABJ55408、AAK19156、NP358461 和 AAK75086 中的那些。在一个实施方
5式中，LytB具有SEQ ID N0S. :4、5或8中所显示的氨基酸序列。PcpA在1998年被首次克隆并鉴定为具有推定的粘附角色的胆碱结合蛋白 (Sanchez-Beato A FEMS Microbiology Letters 164(1998)207-214)。适用于实践在此 描述的试验的PcpA多肽包括，其中例如，GenBank登记号CAB04758、YP817353、AAK76194、 NP359536、ZP01835022和ZP01833419中的那些。在一个实施方式中，PcpA具有SEQ ID N0S. :6或7中所显示的氨基酸序列。抗原可单独或相互组合用于在此所描述的试验中。假如试验证明了期望的灵敏度 和阴性预测值，则单个抗原或抗原的任何组合的用途可适合用于在此所描述的试验中。在 某些实施方式中，使用抗原的组合可能导致大约0. 80,0. 85,0. 90,0. 91,0. 92,0. 93,0. 94、 0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 或 1. 0 的灵敏度，具有大约 0. 80,0. 85,0. 90,0. 91,0. 92,0. 93、 0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1.0的阴性预测值。在一些实施方式中，所述数值是 显著的。可进行比较，并使用可用的统计分析工具测定显著性，单独或相互组合，包括，例 如，t检验、卡方检验、Fisher' s确切检验、方差分析(ANOVA)、单变量统计分析、对数回 归分析以计算校正的比值比(odds ratio) (OR)和95%置信区间(Cl)。也可利用针对可 能充当混杂因素(confoimders)(性别等)的任何统计学上显著的人口统计变异值的控制 (Conrols) 0数值之间的差异通常被认为在例如ρ < 0. 05或ρ < 0. 01下是显著的。也可 使用其他统计分析工具。例如，可进行这些试验以检测与Ply、PhtD、PhtE、LytB或PcpA中只有一种发生免 疫反应的抗体，不测定与任何其他抗原发生反应的抗体。备选地，可进行该试验以检测与 Ply、PhtD, PhtE, LytB和/或PcpA中超过一种发生免疫反应的抗体。例如，可进行该试验 以检测与下列发生免疫反应的抗体Ply和一种或更多的PhtD、PhtE、LytB和PcpA ；PhtD和 一种或更多的 Ply、PhtE、LytB 和 PcpA ；PhtE 和一种或更多的 Ply、PhtD、LytB 和 PcpA ；LytB 和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和PcpA ；和/或PcpA和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和 LytB。也可进行该试验以鉴定与抗原的组合发生免疫反应的抗体，所述抗原的组合诸如 PcpA 和 Ply ；PcpA 和 PhtD ；PcpA 和 PhtE ；PcpA 和 LytB ；PcpA,Ply 和 PhtD ；PcpA,Ply,PhtD 和 PhtE ；Ply,PhtD,PhtE 和 LytB ；PcpA,PhtD 和 PhtE ；PcpA,PhtD,PhtE 和 LytB ；PcpA,PhtE 和 LytB ；PcpA, Ply、PhtE 和 LytB ；PcpA, PhtD 和 LytB ；PcpA, Ply、和 LytB ；PcpA, Ply、PhtD 和LytB ；PcpA、Ply和PhtE ；和/或PcpA、PhtD和PhtE。给定了该公开内容，则其他组合对 本领域的技术人员而言将是显而易见的。在此所描述的试验也可与其他链球菌抗原相互和 /或一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA组合使用。在某些实施方式中，可使用经分离和纯化的PcpA蛋白或其免疫反应性片段用于 检测受试者中由肺炎链球菌引起的既往感染(past infection)或活动性感染(active infection)，通过检测从受试者获得的样品中的抗体与所述经分离和纯化的PcpA抗原(例 如，蛋白质或其免疫反应性片段)的结合。在其他实施方式中，经分离和纯化的PcpA抗原 可与至少一种其他抗原(例如，PhtD,PhtE, LytB和/或Ply蛋白质或其免疫反应性片段) 一起使用。因此，提供了检测受试者中肺炎链球菌的存在和/或诊断由肺炎链球菌引起的 肺炎或感染的方法，其包括检测来自所述受试者的生物样品中对抗一种或更多PcpA、PhtD、 PhtE、LytB和/或Ply抗原的抗体，其中与所述抗原结合的抗体的存在指示感染。在某些 实施方式中，所述方法包括使来源于受试者的生物样品与经分离或纯化的肺炎链球菌的PcpA, PhtD, PhtE, LytB和/或Ply抗原接触一段时间，并且在对抗原-抗体复合物形成而 言充分的条件下，然后检测抗原-抗体复合物的形成。抗原-抗体复合物的检测可通过检 测复合物中的人免疫球蛋白而达到。在某些实施方式中，抗体的检测可通过使抗原-抗体 复合物与“第二”抗体(与人免疫球蛋白有免疫反应性的抗体(例如，抗-人免疫球蛋白抗 体))接触一段时间，并且在对所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋白结合而言充分的 条件下，然后检测结合的抗_人免疫球蛋白。优选将所述第二抗体用标志物或报告分子标 记。同样提供了测定患有由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的受试者对采用治疗学化 合物治疗的响应的方法。该方法涉及检测治疗后受试者的生物样品中对抗PcpA抗原的抗 体，其中所检测的抗体量是增加的、不变的或降低的，与在治疗之前所获得的受试者的生物 样品中可检测到的抗体量或者在正常或健康的受试者的生物样品中可检测到的抗体量相 比。在一个实施方式中，治疗后不变的或降低的抗体量可能指示所述受试者对治疗没有响 应。在另一实施方式中，治疗后不变的或降低的抗体量可能指示所述受试者对治疗响应。在 另一实施方式中，治疗后增加的抗体量可能指示所述受试者对治疗响应。然后可相应地调 整治疗方案。抗原可作为全长(full-length)多肽用于这些试验中。然而，抗原可为相关的 抗原诸如，例如，片段、变体(variants)(例如，等位基因变体、剪接变体)、同源体、类似 物和衍生物(例如，肽、融合物(fusions))，它们存在于生物样品中保持对抗体的反应性。 片段、变体或衍生物可具有一个或更多序列置换、删除和/或添加，与主体序列(subject sequence)相比。片段或变体可为天然存在的或人工构造的。在一个实施方式中，这样的相 关抗原可从相应的核酸分子制备。在优选的实施方式中，相关抗原可具有从1至3、或从1 至5、或从1至10、或从1至15、或从1至20、或从1至25、或从1至30、或从1至40、或从 1至50、或超过50个氨基酸置换、插入、添加和/或删除。相关抗原可包括肽，它们通常为 一系列连续的氨基酸残基，具有相应于得到它的多肽的至少一部分序列。在优选的实施方 式中，肽可包括约5-10、10-15、15-20、30-20或30-50个氨基酸。置换可为保守的，或非保守的，或其任何组合。对抗原序列的保守氨基酸修饰(和 /或对编码核苷酸的相应修饰)可能产生具有与亲代抗原相似的功能特征和化学特征的相 关抗原。例如，“保守的氨基酸置换”可能涉及先天的(native)氨基酸残基被非先天的残基 置换，如此以致，对那个位置上氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性几乎没有或 没有影响，特别是，不导致抗原改变的功能(例如，不引起与生物样品中抗体的降低的免疫 原性或反应性)。适宜的、示例性保守氨基酸置换如下所示
权利要求
Pcp A抗原用于检测受试者中由肺炎链球菌引起的既往感染或活动性感染的用途，其中所述感染是通过使从受试者获得的样品中的抗体与所述PcpA抗原结合而测定的。
2.PcpA抗原和至少一种选自PhtD、PhtE, LytB和Ply的另外的抗原的用途。
3.根据权利要求2的用途，其中抗原的组合选自PcpA和Ply；PcpA和PhtD ；PcpA和 PhtE ；PcpA 禾口 LytB ；PcpA, Ply 禾口 PhtD ；PcpA, Ply、PhtD 禾口 PhtE ；Ply、PhtD、PhtE 禾口 LytB ； PcpA,PhtD 和 PhtE ；PcpA,PhtD,PhtE 和 LytB ；PcpA,PhtE 和 LytB ；PcpA,Ply,PhtE 和 LytB ； PcpA, PhtD、和 LytB ；PcpA, Ply 和 LytB ；PcpA, Ply、PhtD 和 LytB ；PcpA, Ply 和 PhtE ；以及 PcpA, PhtD 和 PhtE。
4.一种诊断受试者中由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的方法，其包括检测来自所述受 试者的生物样品中的抗PcpA抗原的抗体，其中所述抗体在样品中的存在是感染的指示。
5.根据权利要求4的方法，其又包括检测抗至少一种另外的抗原的抗体，其中所述另 外的抗原选自PhtD、PhtE, LytB和Ply，或一种或更多其免疫反应性片段。
6.根据权利要求5的方法，其中所述抗原选自PcpA和Ply；PcpA和PhtD ；PcpA和 PhtE ；PcpA 禾口 LytB ；PcpA, Ply 禾口 PhtD ；PcpA, Ply、PhtD 禾口 PhtE ；Ply、PhtD、PhtE 禾口 LytB ； PcpA,PhtD 和 PhtE ；PcpA,PhtD,PhtE 和 LytB ；PcpA,PhtE 和 LytB ；PcpA,Ply,PhtE 和 LytB ； PcpA, PhtD 和 LytB ；PcpA, Ply 和 LytB ；PcpA, Ply、PhtD 和 LytB ；PcpA, Ply 和 PhtE ；以及 PcpA, PhtD 和 PhtE。
7.根据权利要求4-6中任一项的方法，其包括使来源于受试者的生物样品与抗原接触 一段时间，并且在对抗原-抗体复合物形成而言充分的条件下，然后检测抗原-抗体复合物 的形成。
8.根据权利要求7的方法，其中检测抗原_抗体复合物的形成包括检测抗原_抗体复 合物中的人免疫球蛋白。
9.根据权利要求8的方法，其中检测人免疫球蛋白包括使抗原-抗体复合物与结合人 免疫球蛋白的第二抗体接触一段时间，并且在对所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋白 结合而言充分的条件下，然后检测结合的抗_人免疫球蛋白。
10.根据权利要求8的方法，其中所述第二抗体标记有可检测的标志物或报告分子。
11.一种用于测定患有由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的受试者对采用用于所述肺 炎或感染的治疗学化合物治疗的响应的方法，所述方法包括检测治疗后受试者生物样品中 的抗PcpA抗原的抗体，其中所检测的抗体量是增加的、不变的或降低的，与在治疗之前所 获得的受试者的生物样品中可检测到的抗体量或者在正常或健康的受试者的生物样品中 可检测到的抗体量相比，其中治疗后不变的或降低的抗体量指示所述受试者对治疗没有响 应。
12.根据权利要求11的方法，其包括检测与至少一种选自PhtD、PhtE,LytB和Ply的 抗原发生免疫反应的抗体。
13.根据权利要求11或12中任一项的方法，其包括使生物样品与抗原接触一段时间， 并且在对抗原-抗体复合物形成而言充分的条件下，然后检测抗原-抗体复合物的形成。
14.根据权利要求13的方法，其中检测抗原-抗体复合物的形成包括检测抗原_抗体 复合物中的人免疫球蛋白。
15.根据权利要求14的方法，其中检测人免疫球蛋白包括使抗原-抗体复合物与结合人免疫球蛋白的第二抗体接触一段时间，并且在对所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋 白结合而言充分的条件下，然后检测结合的抗-人免疫球蛋白。
16.根据权利要求15的方法，其中所述第二抗体标记有可检测的标志物或报告分子。
17.根据权利要求7或13中一项的方法，其包括进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。
18.根据权利要求17的方法，其中所述ELISA是使用捕获抗体和检测抗体的夹心 ELISA0
19.一种用于在生物样品中检测肺炎链球菌感染的试剂盒，所述试剂盒包括(i)经分 离和纯化的Pcp A抗原，以及(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的试剂。
20.根据权利要求19的试剂盒，其还包括使用说明书。
21.根据权利要求4-18中任一项的方法，其还包括检测生物样品中的肺炎链球菌核酸。
22.根据权利要求21的方法，其中所述核酸相应于编码PcpA蛋白的核酸。
23.一种固体基质，其包括吸附于其中的选自PcpA、Ply、PhtD、PhtE和LytB的抗原。
24.一种固体基质，其包括吸附于其中的经分离和纯化的抗原的组合，所述组合选自 PcpA 和 Ply ；PcpA 和 PhtD ；PcpA 和 PhtE ；PcpA 和 LytB ；PcpA,Ply 和 PhtD ；PcpA,Ply,PhtD 和 PhtE ；Ply,PhtD,PhtE 和 LytB ；PcpA,PhtD 和 PhtE ；PcpA,PhtD,PhtE 和 LytB ；PcpA,PhtE 和 LytB ；PcpA, Ply、PhtE 和 LytB ；PcpA, PhtD 和 LytB ；PcpA, Ply 和 LytB ；PcpA, Ply、PhtD 和 LytB ；PcpA, Ply 和 PhtE ；以及 PcpA、PhtD 和 PhtE。
25.根据权利要求23或24的固体基质，其中所述固体基质选自微量滴定板或微阵列。
26.—种诊断由肺炎链球菌引起的感染的方法，其包括使生物样品与权利要求23、24 或25中任一项的固体基质在适合于抗体与结合于固体基质的一种或更多抗原反应的条件 下接触，并检测所述抗体与至少一种所述抗原结合，或者不与所述抗原结合。
全文摘要
在此描述了使用一种或更多链球菌抗原检测生物样品中的抗-链球菌抗体的试验。在试验中可使用抗原的多种组合。例如，可利用一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和PcpA。也可使用另外的链球菌抗原。这些试验也可与检测链球菌核酸的试验组合使用。
文档编号G01N33/543GK101952728SQ200980103761
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月2日 优先权日2008年2月1日
发明者C-A·西格雷斯特, M·奥克斯, R·布鲁克斯 申请人:圣诺菲·帕斯图尔有限公司