专利名称：人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的b细胞表位肽段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域，特别涉及急性肾损伤的诊断技术。
背景技术：
急性肾损伤(acute kidney injury, AKI),有时混淆于急性肾功能衰竭(acuterenal failure, ARF),尚无统一的定义。目前普遍接受的AKI概念是指各种原发或继发损伤因素导致的肾脏结构的改变、肾功能下降以及最终肾衰竭的整个过程。有研究表明，冠状动脉旁路移植术后病人AKI发病率达到26. 6 %，严重创伤后AKI发病率达到50 %，而AKI在重症监护病房(I⑶)中病死率高达37% 76. 19%，是一种发病率和病死率很高的临床综合症。早期治疗对AKI的逆转十分重要，而早期诊断是早期治疗的前提和关键所在。目前AKI的诊断和分级标准，主要是AKIN (Acute Kidney Injury Network)国际组织于2007年提出的AKIN标准，该标准将AKl分为三级一级为血肌酐(sCr)升高到基础值的150 200% ;二级为sCr升高到基础值的200 300% ;三级为sCr升高到基础值的300%以上。这种主要以sCr水平为基础的标准，对AKI的早期诊断缺乏敏感性和特异性。如当肾功能下降50%时，sCr水平才开始上升，因此将sCr作为AKI诊断指标几乎起不到肾功能保护的作用，这也是长期以来AKI临床治疗效果不佳的主要原因。为更好地进行AKI的预防、诊断、治疗以及预后评估，发现和鉴定AKI新的敏感生物标志物并建立准确的测定方法是AKI防治研究的重要方向。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是Kjeldsen L等人1993年在中性粒细胞特异性颗粒中发现的一种小分子分泌型蛋白。后续的研究发现NGAL也在人体多种组织如肾、前列腺、呼吸道和消化道上皮中低水平表达，而在炎症时的中性粒细胞、乳腺癌及膀胱上皮癌细胞中表达显著增高。更为重要的发现是Mishra J等2003年研究观察到在缺血再灌注损伤后的小鼠肾脏和顺钼诱导的中毒性肾损害中，小鼠尿液中NGAL在损伤后3h测定值升高大于三倍，在12h可达正常的12倍，72h恢复到正常水平，能很好地反应AKI的病程和损伤程度；2005年Lancet杂志上报道了 71例接受心脏手术的患儿的研究发现，体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)后2h的血和尿NGAL是预测AKI的可靠指标，其曲线下面积(under the curve, AUC)分别为O. 910和O. 998。2008年Nickola等另一项研究监测了 635例急诊科患者的尿NGAL水平，结果发现，尿NGAL在诊断AKI具有较高的敏感性和特异性(分别为90%和99% )，引起了人们对NGAL检测的广泛关注。为了在理论上回答NGAL是否是检测诊断AKI理想的标志物，美国哥伦比亚大学Barasch研究小组进行了深入研究，并在2011年Nature Medcine上报道了用Luciferase-2和mCherry双萤光报告基因在NGAL启动子和其5’ UTR驱动下的knock in小鼠模型的实验结果，揭示了缺血性和细胞毒性AKI时NGAL基因表达活性在肾组织中的Henles管和集合管的上皮细胞呈剂量依赖性的显著变化;AKI时尿中NGAL主要来自肾组织，而不是来自正常时也低表达NGAL的中性粒细胞、肝细胞、呼吸道和肠道等上皮细胞；尿NGAL的检测、比血和尿Cr检测更能特异性地代表AKI的损伤程度，其检测的敏感性有极为显著的差异(P < O. 001)。这项重要的研究发现，不仅从理论上说明了肾上皮特征性尿NGAL检测诊断AKI的高特异性和高灵敏性的原因和临床应用前景，也解释了过去一段时间里NGAL免疫检测中存在的主要问题。2010年Linjun Cai等用ELISA发现AKI、细菌感染和结肠癌患者尿NGAL与正常对照相比均显著增高，进一步实验发现，AKI时增加的是NGAL单体(25KD)，细菌感染增加的主要是NGAL同源二聚体(45KD)，而结肠癌增加的是NGAL与金属蛋白酶9(MMP-9)结合形成的异源二聚体(135KD)。根据Barasch研究小组实验动物的研究结果推测患者发生AKI时，其肾Henles管和集合管上皮细胞NGAL基因反应性高表达参与了肾上皮的抗损伤作用，因为已有研究揭示NGAL可通过介导铁的转运促进原始肾上皮细胞的成熟时同时以肾上皮特征性单体形式分泌入尿液。丹麦Bioporto Diagnostic公司研发的人NGAL快速ELISA检测试剂盒,所用的NGAL抗体均是用人外周血白细胞来源的NGAL同源二聚体免疫动物后制备，忽略了不同组织来源NGAL之间可能存在的差异。事实上，这些试剂盒检测结果在人群中存在太大的变 异，例如Bioporto Diagnostic报道医院IQJ病人尿液中NGAL浓度在110 40000ng/ml之间，血液中NGAL浓度在25 3491ng/ml，这种个体间巨大差异，其原因可能就是AKI损伤时，尿液中的主要NGAL形式是损伤上皮重新合成和分泌的单体NGAL，未能开发出针对肾上皮特征性NGAL特异性的抗体，影响了其对AKI诊断的应用。上述的研究发现和目前NGAL检测试剂的不足，迫切地要求对临床AKI患者尿中的肾上皮特征性NGAL分子形式进行深入的研究并获得特异性的检测抗体，用以建立适合临床AKI诊断的尿NGAL定量检测方法。

发明内容
本发明的目的之一在于提供NGAL B细胞表位肽段，其能作为NGAL单克隆抗体的抗原。为实现上述技术目的，本发明的技术方案为人NGAL的B细胞表位肽段，所述人NGAL的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQID N0:3所示。上述氨基酸序列是通过如下手段获取的从NCBI Protein数据库中获取如SEQ ID NO 2所示的NGAL蛋白序列；分别对NGAL蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性、柔韧性以及可能的糖基化位点，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域，其序列如SEQID NO 3所示。所述的B细胞表位肽段化学合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA或KLH交联。将所述的B细胞表位肽段与载体蛋白BSA或KLH交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌NGAL单克隆抗体。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的人NGAL的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述NGAL的B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的最强阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出最强阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO :C201262，其可稳定分泌所述单克隆抗体。本发明的目的之三在于提供所述一种特异性抗体，其可作为检测NGAL抗原的试齐U。同时，还提供含有上述抗体的试剂盒，该试剂盒可用于急性肾损伤的诊断。所述的人NGAL的B细胞表位肽段制备的特异性抗体。所述特异性抗体为所述人NGAL的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。作为优选的，所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC N0:C201262。基于诊断急性肾损伤的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO C201262的杂交 瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体。本发明的目的之四在于提供三种新应用，该应用为急性肾损伤的诊断提供了新的思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的人NGAL的B细胞表位肽段在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。所述的人NGAL的B细胞表位肽为免疫原性多肽，其可被B细胞抗原受体(BCR)识别并结合，或与人NGAL抗原的抗体特异性识别并相互结合；所以，所述B细胞表位肽段可以制备成诊断试剂，用于检测标本中的NGAL抗原的特异性抗体含量，进一步判断是否为急性肾损伤患者提供指标参数。人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。或人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。所述人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体或人NGAL的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物，可用于免疫原及筛选原的检测，或建立NGAL定量检测。当NGAL的含量超过正常人的标准，NGAL的含量可作为判定急性肾损伤的判定辅助参数。本发明的有益效果在于本发明制备的人NGAL是高纯度的NGAL单体重组蛋白(rhNGAL),该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立NGAL定量检测时的校准品。通过NGAL蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度> 96% )、效价高(ELISA效价达I : 256000)、特异性好、可大批量制备等优点。人NGAL蛋白中B细胞表位肽段化学合成时在其N端引入半胱氨酸，提高了其与KLH或BSA交联率(> 50% )，可作为优质免疫原。通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人尿液NGAL含量的检测，如可采用“双抗体夹心” ELISA反应模式，即酶标记人抗NGAL单抗、酶标板包被抗NGAL多抗(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体)和被测样品NGAL抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。


图I为重组pET42a_NGAL质粒经Sal I.BamH I酶切鉴定图，箭头显示目的酶切产物。
图2为NGAL重组蛋白的非变性PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果。图3为Western Blot分析重组NGAL的免疫特异性，图中MIF为对照蛋；NGAL(左)为上样量结果；NGAL (右)为上样量20 μ g结果。图4为人NGAL表位特异性单克隆抗体的纯化图。图5为人NGAL多克隆抗体(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体)的纯化图。图6为人NGAL多克隆抗体斑点杂交图。本发明中杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6-NGAL送中国 典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC N0:201262，地址位于中国武汉武汉大学，保存日期为2012年6月27日，保藏的培养物名称为小鼠杂交瘤细胞。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆实验手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。实施例INGAL重组蛋白的制备从GENBANK获取NGAL编码基因的基础上，进行密码子偏嗜性改造，化学合成编码基因片段，克隆入原核表达载体经DNA测序鉴定后诱导蛋白表达，经性质鉴定后，大量纯化制备NGAL重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为后续实验中建立NGAL定量检测时的校准品，具体的一 NGAL重组蛋白基因克隆从GENBANK获得人NGAL蛋白的基因序列(登录号为匪005564. 3)，将其递交于Graphical codon usage analyzer (http://guca. schoedl. del),分析其密码子偏性情况;具体的，将人NGAL基因密码子在大肠杆菌中使用率< 10%的同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，使其更加容易在大肠杆菌中表达，优化后的NGAL⑶S核苷酸序列为SEQ ID NO 1 ；相应的多肽序列如SEQ ID NO 2所示。为进行有效表达及纯化，在序列SEQ ID NO :1的5'-及3'-端分别添加限制性酶切位点 Sal 1(5' GTCGAC3 ' )、BamH 1(5' GGATCC3 ')，其中 BamH I 位点后加入gatgatgatgataag序列，其编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys多肽序列为EK酶的识别位点。然后委托上海英骏生物工程有限公司进行全基因合成。合成的过程为常规基技术，可参考分子克隆实验手册一书。二 pET42a_NGAL 重组质粒构建将pET42a载体与合成基因经Sal I、BamH I酶切4小时后用T4 DNA连接酶4°C过夜连接。将制备好的感受态DH5a菌200 μ 1，冰浴，吸取1μ I连接产物加入管中，转化DH5 a菌，轻拍混匀，冰浴30分钟，42°C水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800 μ I室温的2 X YT培养液混匀，37°C摇床220rpm振荡培养I小时，分别将50 μ 1、200 μ I及剩下的全部转化菌涂于3个含卡那霉素抗性的2 X YT培养板上，37°C恒温培养箱过夜培养，次日挑去白色菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用Sal I、BamH I双酶切 4 小时，酶切体系为pET42a-NGAL 质粒 DNA 10 μ 1，Sal I I μ I,BamH I I μ 1，IOX 缓冲液K 2 μ 1，ddH20 6 μ 1，并取酶切产物10 μ I行I. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定(详见图I)。
三NGAL重组蛋白诱导表达将转化pET42a_NGAL的细菌扩大培养及诱导表达，测细菌OD值达O. 6-0. 8时加入IPTG (至终浓度lmmol/L)诱导表达6小时。培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH7.3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4°C 10，000印111离心151^11，上清以0.454 111微孔滤膜过滤。分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性，经鉴定表达蛋白破菌后几乎都存在上清中，为可溶性表达。 四NGAL重组蛋白纯化上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱纯化，Binding buffer平衡后用Elution buffer线性洗脱，收集主洗脱峰，用His-Binding buffer稀释10倍后进行HisTrap HP再次纯化，纯化后的产物用PBS平衡过的分子筛，收集蛋白。将获得的蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为 EK切割buffer (50mmol/L Tris_HCl，PH8. O)，按EK酶与蛋白I 1000的质量比加入EK酶，4°C摇床60rpm切割24h。切割后用His-Binding buffer稀释后HisTrap HP纯化，15% SDS-PAGE电泳鉴定，NGAL重组蛋白分子量为25Kda左右，详见图2，纯化后目的蛋白纯度达到95 %以上。五NGAL重组蛋白浓度、纯度测定I Lowry法测定NGAL蛋白含量Lowry法测定的试剂盒购于上海美季生物技术有限公司。试剂A : I) 10 克 Na2CO3, 2 克 NaOH 和 O. 25 克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6 · 4H20)。溶解于500毫升蒸馏水中；2)0. 5克硫酸铜(CuSO4 · 5H20)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份㈧与I份⑶混合，即为试剂甲。试剂B:在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4 · 2H20)，25克钥酸钠(Na2MoO4 · 2H20)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li2SO4)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至I升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水I倍，使最终的酸浓度为IN左右。标准蛋白质溶液精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用O. 9% NaCl溶液。详见下表
权利要求
1.人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段，其特征在于所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
2.根据权利要求I所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段，其特征在于所述人NGAL的B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。
3.根据权利要求I所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段，其特征在于所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段N末端引入半胱氨酸。
4.权利要求1-3任一项所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的交瘤细胞，其特征在于所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO C201262o
6.权利要求I所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段制备的特异性单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的特异性抗体，其特征在于所述特异性抗体为所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
8.权利要求I所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的B细胞表位肽段在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。
9.权利要求6所述的特异性抗体及特异性抗体的免疫复合物在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用。
10.基于诊断急性肾损伤的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，其特征在于所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO C201262的杂交瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组蛋白为抗原制备的多克隆抗体。
全文摘要
本发明属于医学领域，特别涉及急性肾损伤的诊断技术，所述人NGAL的B细胞表位肽段及其制备的杂交瘤细胞；B细胞表位肽段、其特异性抗体及特异性抗体的免疫复合物在制备急性肾损伤的诊断试剂中的应用；本发明制备的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶256000)、特异性好、可大批量制备等优点；通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人尿液NGAL含量的检测，如可采用“双抗体夹心”ELISA反应模式，即酶标记人抗NGAL单抗、酶标板包被抗NGAL多抗和被测样品NGAL抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。
文档编号G01N33/577GK102775473SQ20121026928
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者姚静, 张宪, 石延宾, 秦川, 胡伟, 魏勇, 黄洪涛 申请人:重庆业为基生物科技有限公司