专利名称：异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异 柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术：
异柠檬酸isocitricacid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在 于生物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子 类中特别多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。 柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠 檬酸脱氢酶(EC1丄1.41; EC1丄1.42)的作用下变成oc-酮戊二酸，在 异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase， EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀 酸与乙醛酸。
中华人民共和国国家标准，GBT16771-1997，规定了橙、柑、桔汁 及其饮料中D-异柠檬酸的测定方法一紫外分光光度法。该方法适用于 判定橙、柑、桔浓縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、 桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱氢酶 isocitrate dehydrogenase 有两禾中类型以 NAD 为辅酶的酶 (EC1. 1. 1. 41)和要NADP为辅酶的酶(EC1. 1. 1. 42)，两者 催化同一反应。
异柠檬酸+NAD(P)+# ot-酮戊二酸十C02 + NAP(P)H + fT在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP 作用，生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在 波长340nm处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶双倍扩增法 (Enzymatic Doubling Method)、 酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以 测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的 异柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或 半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、 准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明异柠檬酸浓度测定方法原理如下
D-异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳+
酮戊二酸+还原型辅酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
草酰乙酸+磷酸根 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l，3-双磷酸+还原型辅酶 这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1丄1.41 ; EC 1丄1.42)酶(偶)联磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、甘油醛-3陽磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶《足反应 速率比色法/终点法。异柠檬酸脱氢酶酶解异柠檬酸反应产生二氧化 碳，再通过(偶)联合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢 酶的作用，二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅 酶(在340nm处有吸收峰)，使灵敏度提高二倍，从而得以测定还原 型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光 度上升的程度/速度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异拧檬酸测 定试剂盒较为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
异拧檬酸脱氢酶10000U/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶12000U/L
磷酸烯醇式丙酮酸6 mmol/L
甘油醛-3-磷酸20 mmol/L
本发明的异柠檬酸测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成
液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化
酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其
辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸 6mmol/L 甘油醛-3-磷酸 20mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；
使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始
吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬
酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延
迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出异
柠檬酸的浓度大小.
实施例二
本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括:
试剂1
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 辅酶
磷酸烯醇式丙酮酸
甘油醛-3-磷酸
50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L
20 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
异柠檬酸脱氢酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
500 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬 酸样品与试剂i、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上 升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
10加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出异
柠檬酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 辅酶
磷酸烯醇式丙酮酸 甘油醛-3-磷酸 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸—盐酸缓冲液 稳定剂
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L
20 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000 U/L
试剂
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
10000U/L
异拧檬酸脱氢酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用 测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波 长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右， 检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出异 柠檬酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能 达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一 一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化
分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《 0.0020;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效 (R》0.99)线形范围可达10.5mmol/L;试剂测试的不准确度，其相 对偏差不超过±6%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV) 《3.6 %;试剂的灵敏度可达0.0675±0.034 AA/ mmol /L——本发明灵 敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶双倍扩增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法原理如下D-异柠檬酸+辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 草酰乙酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 <u>甘油醛-3-磷酸脱氢酶</u> 甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
2. —种异柠檬酸测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 稳定剂 试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸组 成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸 组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙 酮酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸 脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅 酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱 氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。
5. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸 组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙 酮酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油 醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫 酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶双倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸、异柠檬酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464284SQ20071019143
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司