专利名称：Caco-2细胞表面特异性结合的多肽及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及筛选血管特异性结合肽，特别是一种Caco-2细胞 表面特异性结合的多肽及其筛选方法。
背景技术：
结直肠癌(colorectal cancer)是消化道常见恶性肿瘤之一，随着经济发展和人 民生活水平的不断提高、生活环境、生活方式及膳食结构的改变，发病率近年来有迅猛增高 的趋势，在西方发达国家，如美国，结直肠癌的发病率居第四位，在恶性肿瘤死亡原因中居 第二位，仅次于肺癌的死亡率，在初诊患者中中晚期癌占大多数，部分病人由于临床症状不 明显或较晚发现而致延误治疗，成为威胁人类生命和健康不容忽视的疾病。结肠癌的诊断 及外科治疗已取得了长足进步，但早期结肠癌的检出率仍较低而死亡率仍较高，要提高结 肠癌术后生存率和降低死亡率的关键就在于早期发现、早期诊断和早期治疗。噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选 技术，1985年由美国Missouri大学G. P. Smith等首创，此技术可将目的基因编码的多肽以 融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和 生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(如抗 体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示 技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药 物靶向运输等方面的研究。噬菌体展示技术正逐步发展成熟，为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体 提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原，肿瘤相关配体和多肽的筛选 已成为寻找抗肿瘤药物的新热点，针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽，为肿瘤 治疗提供了新的靶点，也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的 免疫治疗提供了新的分子靶位，噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生 血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用，将多肽与脂质体或纳米药物偶联，既有助于 在达到更好的靶向治疗效果，又减小了药物的毒副作用，还可用于肿瘤血管三维成像和分 子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

发明内容
本发明的目的在于，提供一种Caco-2细胞表面特异性结合的多肽及其筛选方法， 该方法利用噬菌体展示随机十二肽库筛选出能够和人结直肠癌Caco-2细胞株结合的十二 肽，并鉴定它们与结肠癌细胞的亲和力和特异性，分析氨基酸序列组成，寻找能够和结肠癌 细胞特异性结合的配体，分析这些蛋白与细胞结合的氨基酸决定簇位点，为研究噬菌体展 示多肽在肿瘤早期诊断和靶向药物等研究方面提供实验依据。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到4条多肽片段，其氨基酸序列分别为SPSIDTRYSRLG，CVSVGMKPSPRP， SVSVGMKPSPRP 和 MVSMDSSPRDRL。4条多肽均为亲水性多肽，富含丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸和天冬氨酸。4条 多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性，含有共有序列XXSXXXXXXXRXX ；4条多肽片段能够特异性结合Caco-2细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。所述的Caco-2细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，其特征在于，该方法利 用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的结直肠癌Caco-2细胞系为靶细胞，以人胚肾细胞 HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增并滴 定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与Caco-2细胞的亲和力，排除假 阳性克隆，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同 源性比较，检索出现频率高的多肽基序，BLAST检索蛋白质数据库，检测多肽基序同源性较 高的蛋白质，及可能结合的细胞表面受体和配体；细胞免疫荧光法检测噬菌体多肽克隆的 靶向性，进一步鉴定阳性克隆的特异性。本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选结直肠癌Caco-2细胞结合的多肽序列， ELISA鉴定噬菌体克隆与结直肠癌细胞的亲和力，获得10个噬菌体克隆，测序获得4条多肽 序列，其共有氨基酸序列为XXSXXXXXXXRXX，同源性分析表明多肽基序可能为肿瘤细胞表面 受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向 性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合Caco-2细胞，筛选获得的结肠癌Caco-2细胞 特异性多肽为结直肠癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供初 步的实验依据。


图1是本发明的具体技术路线图；图2是随机十二肽pill融合蛋白的N末端序列；图3是精简遗传密码表；图4是10个噬菌体阳性克隆与Caco-2细胞亲和力的ELISA鉴定；图5A、B、C、D分别是四条噬菌体多肽的氨基酸疏水性图；图6A X分别是噬菌体阳性克隆靶向Caco-2细胞的免疫荧光检测(X200)图， 其中A，B，C，D:Caco-2 cells(A and B) and HEK293 cells(C and D)incubated with Q23 positive clone thatdisplays CCSPl peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；Ε, F, G, H :Caco-2 cells(E and F)and HEK293 cells(G and H)incubated with Q24 positive clone thatdisplays CCSP2 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；I, J, K, L :Caco-2 cells(I and J)and HEK293 cells(K and L) incubated with Q29 positive clone thatdisplays CCSP3 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；Μ, N, 0， P Caco-2 cells(Μ and N)and HEK293 cells(0 and P)incubated withQ28 positive clone thatdisplays CCSP4 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；Q, R, S, T :Caco-2cells(Q and R)and HEK293(S and T)cells incubated with unrelated phages under thelight microscope and the fluorescent microscope ；U, V, W, X :Caco-2cells(U and V)and HEK293 cells(W and X)incubated with PBS under the lightmicroscope and the fluorescent microscope.以下结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式一、技术路线本发明采用噬菌体多肽展示技术，以人结肠癌Caco-2细胞系为靶细胞，以人胚肾 HEK293细胞为阴性吸附细胞进行4轮消减筛选，从噬菌体12肽库中筛选能特异性结合结肠 癌Caco-2细胞的多肽基序，检索其可能识别的细胞表面受体，为结直肠癌早期诊断和靶向 治疗的进一步研究提供良好的实验依据，具体技术路线如图1所示。二、材料与方法2. 1主要实验材料2. 11细胞、噬菌体多肽库、宿主菌(1)细胞株人结直肠癌细胞株Caco-2，人胚肾细胞株HEK293，购于美国 ATCC(Rockville，美国)。 (2)噬菌体肽库随机十二肽噬菌体展示文库(Ph. D. -12TM Phage Display Peptide Library Kit)购自 New England Biolabs，USA，滴度 1· 5X 1013pfu/ml，贮存于含 50%甘油的TBS溶液中。复杂度 2. 7X109个转化子，于M13噬菌体cPIII蛋白的Kpn-I 和Eag-I位点之间插入外源序列。_96gIII测序引物序列为5，-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，。(3)宿主菌大肠杆菌 E. coli ER2738 :F，Iaclq Δ (IacZ) M15proA+B+zzf:TnlO(TetR)/fhuA2supEthi Δ (lac-proAB) Δ (hsdMS-mcrB) 5 (rk-mk-McrBC-)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式贮存于_80°C 非感受态细胞，购自New England Biolabs, USA02. 1.2主要试剂及耗材(1) RPMI 1640 培养基购自 Gibco 公司。(2) DMEM培养基购自Gibco公司。(3)胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。(4)青霉素、链霉素、庆大霉素及胰蛋白酶购自Amresco公司。(5) DMS0、台盼蓝购自Sigma公司。(6)PEG8000 购自北京索莱宝科技有限公司。(7) IPTG、BSA 购自西安沃尔森生物技术有限公司。(8) Xgal> DMF> NaN3>Tween-20> Agar 03 g Amresco 公司。(9) D-Glucose 购自上海生工生物工程公司。(lO)Bacto-Tryptone、酵母提取物购自 0X0ID，England。
(Il)Agarose 购自美国 Invitrogen 公司。(12)山羊抗 M13 多克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology, Inc 公司。(13)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗山羊IgG 购自北京博奥森生物技术有限 公司。(14)多聚甲醛购自Sigma公司。(15) TMB 购自 Boston Biomedica, Inc. (BBI)公司。(16)FITC标记兔抗山羊IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。(17)常规生物化学试剂购自西安沃尔森生物技术有限公司。2. 1.3主要试剂的配制(1)四环素贮液以20mg/ml的浓度溶于无水乙醇中，封装至1. 5ml无菌离心管 中，Iml/管，_40°C避光保存，用前混勻。(2)5XM9 盐溶液称取 Na2HP04 · 12H20 42. 74g, KH2P047. 5g, NaCl 1. 25g, NH4C12. 5g，溶于400ml三蒸水中，磁力搅拌至完全溶解，三蒸水定容至500ml，高压蒸汽灭
菌，室温保存。(3)20% Glucose 称取 20g Glucose，溶于 100ml 三蒸水，用 0.22 μ m 过滤器过滤
除菌，4 °C贮存。(4)含四环素抗性的1XM9基本培养基取5 XM9盐溶液100ml，称取琼脂粉7. 5g， 调节pH至7. 0，三蒸水定容至500ml，高压蒸汽灭菌，冷却至低于70°C时，加入无菌的20% Glucose 10ml，及四环素贮液625μ 1(终浓度50μ g/ml)，混勻倒平板。平板4°C避光保存。(5)含四环素抗性的LB medium (pH 7.4)称取胰蛋白胨5g，酵母提取物2. 5g， NaCl 2. 5g，溶解于400ml三蒸水中，磁力搅拌至完全溶解。用IM的NaOH调节pH值至7. 0， 三蒸水定容至500ml。高压蒸汽灭菌30min，冷却至低于50°C时，加入四环素贮液1. 25ml (终 浓度50 μ g/ml)，4°C避光保存。(6) TBS :50mM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl，高压灭菌，室温保存。(7)PEG/NaCl 20% (w/v)PEG8000, 2. 5M NaCl，高压灭菌，室温保存。(8) IPTG/Xgal 将 1. 25g IPTG 和 Ig Xgal 溶于 25ml DMF 中，充分混勻，锡箔纸包 裹，-20°C保存。(9) LB/IPTG/Xgal 平板IL LB medium,加入 15g 琼脂粉，高压灭菌 30min，室温冷 却至低于70°C时，加入Iml IPTG/Xgal，混勻倒平板。平板4°C避光保存。(10)顶层琼月旨糖(Top Agarose)称取 Bacto-Tryptone :lg，yeast extract 0. 5g, NaCl 0. 5g, MgCl · 6H20 :0. lg, Agarose :0. 7g,高压灭菌 30min,封装至无菌 50ml 离 心管中，室温保存，用时微波炉融化。(Il)PBS 磷酸盐缓冲液称取 NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HP04 · 12H20 :1· 44g，KH2PO4 0. 24g，溶于900ml三蒸水中，磁力搅拌充分溶解，用10N HCl调节pH值至7. 4，三蒸水定容
至1L。高压灭菌，室温保存。(12)Blocking buffer 3% BSA 溶于 PBS(ρΗ7· 4)，0. 22 μ m 滤器过滤除菌，4°C保存。(13) TBST :50mM Tris—HCl (pH7. 5)，150mMNaCl，不同浓度(ν/ν)的 Tween-20 (0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 5% )，高压灭菌，室温保存。
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(H)RPMI 1640完全培养基取RPMI 1640培养基干粉3包，溶于2L超纯三蒸水， 并用三蒸水清洗包装袋2 3次(洗液一并加入培养基中)，加入NaHC03 :6g，FBS :300ml, 抗生素各30ml (青霉素/链霉素终浓度为100U/ml，庆大霉素终浓度为100 μ g/ml)，磁力搅 拌至完全溶解，ION HCl调节pH值至7. 2左右(过滤后pH值会升高0. 2 0. 3)，超纯三蒸 水定容至3L。0. 22 μ m过滤器过滤除菌，分装于500ml灭菌试剂瓶，4°C保存。(15) DMEM完全培养基取DMEM培养基干粉3包，溶于2L超纯三蒸水，并用三蒸水 清洗包装袋2 3次(洗液一并加入培养基中)，加入NaHC037. 2g，FBS 300ml，抗生素各 30ml (青霉素/链霉素终浓度为100U/ml，庆大霉素终浓度为100 μ g/ml)，磁力搅拌至完全 溶解，ION HCl调节pH值至7. 2左右，超纯三蒸水定容至3L。0. 22 μ m过滤器过滤除菌，分 装于500ml灭菌试剂瓶，4°C保存。(16)0. 25% Trypsin-O. 02% EDTA 称取 0. 25g胰蛋白酶 Trypsin 粉剂，溶于 IOOml 0. IMPBS中，加入IM EDTA 54 μ 1，磁棒慢速搅拌5 6小时，0. 22 μ m过滤器过滤除菌，4°C保存。(17)4%台盼蓝母液称取4g台盼蓝，加入少量三蒸水研磨，加三蒸水定容至 100ml，用滤纸过滤，4°C保存，使用时用PBS稀释母液至0. 4%使用液。(18) 4%多聚甲醛固定液称取4g多聚甲醛粉末，溶于100ml PBS (pH7. 2)，磁力搅 拌溶解，稍许加热至60°C，加入几滴IM NaOH助溶完全，0. 22 μ m滤器过滤，4°C保存。(19)TMB底物贮液称取IOmg TMB粉末，溶于5ml DMSO中，锡箔纸包裹，4°C保存。(20) TMB 底物缓冲液(ρΗ5· 5)溶液 A 柠檬酸(C6H807 · Η20) 0. lmol/L ；溶 液B 磷酸氢二钠(Na2HP04 · 12H20) 0. 2mol/L ；将溶液Α、溶液B和三蒸水按体积比 24.3 25. 7 50的比例混合，高压灭菌，4°C保存。(21) TMB工作液依次取TMB底物缓冲液9. 5ml,0. 75% H202 42 μ 1，TMB底物贮液 0. 5ml，于IOml灭菌离心管中充分混勻，避光操作，现用现配。(22)显色终止液2M H2S04。(23)碘化物缓冲液:10mM Tris-HCl (pH 8. 0)，ImM EDTA，4M NaI。室温避光保存。2. 2实验方法2. 2. 1细胞培养2. 2. 1. 1 细胞复苏用酒精棉球擦拭超净工作台台面，紫外线照射30min以上，37 °C水浴预热 RPMI1640培养基和DMEM培养基，从液氮罐中取出冻存的Caco-2细胞冻存管，迅速将冻存 管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1 2min后冻存管内液体完全溶解，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，移入超净台内，无菌条件下 将细胞悬液转入IOml离心管中，加入5ml RPMI1640培养基，用托架天平平衡后800rpm低 速离心3min，弃上清。加入RPMI1640培养基重悬细胞，转入10cm2培养瓶中。将培养瓶移 至37°C、饱和湿度、5% C02的培养箱内培养。重复同样操作复苏HEK293细胞。2. 2. 1. 2细胞传代培养次日更换培养液一次，待细胞长至90 %融合时，小心吸弃去旧培养基，用预热的 PBS轻轻洗涤细胞，加入适量胰蛋白酶消化液37°C消化3 5min，倒置显微镜下观察，待细 胞胞质回缩变圆、细胞不再粘连成片时，吸弃消化液，加入RPMI 1640完全培养基，用滴管轻柔吹打已消化细胞成细胞悬液，将细胞悬液转移至IOml离心管，平衡后将离心管放入 台式离心机，800rpm，离心5min，小心吸弃上清，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞悬 液，封装于2 3个培养瓶，补足培养基后旋紧瓶盖。倒置显微镜下观察细胞数量，传代细 胞密度不应少于lX105cellS/ml，置于37°C、饱和湿度、5% C02孵箱，拧松瓶盖培养。2 3日待细胞铺满瓶底继续传代。2. 2. 1.3 细胞冻存冻存前24h进行细胞换液，取培养2 3天对数生长期的细胞，按细胞传代方法收 集细胞并计数，以1 5X 106cells/ml细胞浓度悬浮于含10% DMSO的RPMI 1640完全培 养基中，轻轻反复吹打均勻，Iml/管分装于冻存管中，置于冻存杯中室温放置2h，于-80°C 超低温冰箱中过夜，次日置于液氮罐中长期保存并做好冻存记录。2. 2. 2 宿主菌 E. coli ER2738 的活化(1)复苏取250 μ 1 LB-Tet液体培养基于1. 5ml无菌离心管中，以无菌技术从 E. coliER2738的甘油冻存物中取出2 3 μ 1菌液与之充分混勻，滴加至M9_Tet平板，用灭 菌玻璃珠涂布2 3min，倒出玻璃珠，平板室温放置5min，标记后置于37°C细菌培养箱倒置 培养过夜。次日长出克隆后封口膜封口，4°C避光保存备用。(2)培养取3ml LB-Tet液体培养基置于IOml灭菌离心管中，用无菌枪头以无 菌技术挑取单克隆置于其中，标记后置于恒温摇床37°C，300rpm振荡培养过夜。细菌扩 增液于4°C保存备用，取一管细菌与灭菌甘油1 1混合，分装于1.5ml无菌离心管，每管 lml, -80°C超低温冰箱保存。2. 2. 3噬菌体展示十二肽库的消减筛选以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞，结肠癌Caco-2细胞为靶细胞，参照随 机十二肽噬菌体展示文库(Ph. D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)使用 说明书，优化改良筛选方法，进行4轮消减筛选，保持每一轮筛选投入噬菌体量不少于 1. 5 X 1010PFU。第一轮筛选程序如下(1)细胞准备将生长状态良好的人结肠癌细胞Caco-2和人胚肾HEK293细胞，分 别传代，接种于10cm2细胞培养瓶，置于37°C、饱和湿度、5% C02孵箱培养24h后换液，培养 至细胞贴壁，生长状态良好，待融合度为90%以上，汇合成单层细胞时进行筛选。(2)细菌活化将过夜振荡培养的ER2738以1 100稀释于20ml LB-Tet液体培 养基中，370C，225rpm,缓慢振摇2 3h至对数前期，于紫外分光光度计上测0D600 0. 5。(3)封闭取融合度为90%以上的HEK293细胞，吸弃培养基，用PBS轻轻洗涤 两次，加无血清培养基，37°C、5% C02培养lh，吸去培养液，加入Blocking buffer (3% BSA+PBS)，37°C封闭2h ；重复同样操作，封闭结肠癌细胞Caco-2细胞。(4)洗涤吸弃封闭液，用0. 1 % TBST轻柔地洗涤6次，操作要避免细胞脱落。(5)阴性细胞吸附将10μ1噬菌体库(第2轮至第4轮筛选取扩增库 1. 5X1010PFU)与lml TBS混合，与ΗΕΚ293细胞孵育，37°C，孵育lh，孵育期间每隔15min 放脱色摇床上微摇。(6)取上清用吸管缓慢吸取上清，转移至2ml灭菌离心管，lOOOrpm，离心5min，转
移上清至新离心管，再离心一次以去除上清中可能含有的细胞。(7)结合迅速将上清与已封闭、洗涤好的结肠癌Caco-2细胞孵育，37°C，孵育2h。
(8)洗涤小心吸弃上清，消化收集细胞于离心管，IOOOrpm,离心5min，吸弃上清， 用0. 1 % TBST反复吹打洗涤Caco-2细胞20次，IOOOrpm,离心5min，重复洗涤4次，弃尽上 清获得细胞沉淀，用无菌滤纸条吸尽剩余液滴。(9)扩增将细胞沉淀加入已摇至对数前期的ER2738菌液中，置于恒温摇床， 370C，225rpm,振荡培养 4. 5h。(10)噬菌体纯化①将噬菌体扩增菌液分装于灭菌的1.5ml离心管，每管1ml，13000rpm，离心 IOmin,上清转入新离心管中，再离心，取上清上部80%转入新离心管中。②加入1/6体积的PEG/NaCl (167 μ 1/tube)，反复vertex混勻，4°C沉淀噬菌体过夜。③次日，4°C，13000rpm，离心过夜沉淀物15min。④倒掉上清，再次短暂离心，用微量移液器吸尽残留上清液。⑤每管加入1ml TBS重悬沉淀，反复vertex混勻，悬液转移至灭菌1.5ml离心管 中，4°C，13000rpm，离心5min，以去除残余细胞。⑥上清转入另一无菌微量离心管中，用l/6PEG/NaCl (170 μ Ι/tube)，反复vertex 混勻，再次沉淀，冰上孵育60min，4°C，13000rpm,离心lOmin。⑦弃上清，再次短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。⑧每管加入200μ 1 TBS/0. 02% NaN3，反复vertex混勻，短暂离心lmin，沉淀任何 残余不溶物，上清转入新1.5ml离心管中，此即为扩增后的一级库，标记，以1 1加入灭菌 甘油，-20°C保存。(11)噬菌体滴定①取2 3μ1 Ε. coli ER2738宿主菌，涂布M9_Tet平板，置于恒温培养箱37°C倒 置培养过夜。②菌操作挑取分离良好的单克隆于3ml LB-Tet液体培养基中，置于恒温摇床 37°C，300rpm，振荡培养16 18小时。③将过夜ER2738培养物1 100稀释于3ml LB-Tet培养基中，225rpm，振荡培养 1. 5h 2h，至 0D600 0. 5。④准备5个LB/IPTG/Xgal平板于37°C恒温培养箱预热(每个噬菌体稀释度对应 一个平板)。⑤预先准备45°C水浴，微波炉中融化Top Agarose，分装于IOml离心管中，3ml/ tube，置于水浴中备用。⑥将ER2738 (0D600 0. 5)分装于1. 5ml灭菌离心管中(每个噬菌体稀释度对应 一管)，200 μ 1/tube，4°C保存备用。⑦在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体扩增库，稀释范围为102 1011。⑧取107 1011不同噬菌体稀释度，每管10 μ 1，分别与200 μ 1宿主菌混合，快速 振荡混勻，室温温育5min。⑨将感染的细菌快速加入45°C预温的Top Agarose中，每次一管，快速vortex混 勻，立即倾注于37°C预热的LB/IPTG/Xgal平板上，快速旋转倾斜平版使之均勻铺展开来。 室温冷却5min，置于恒温培养箱中，37°C倒置培养过夜。
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⑩次日，待平板长出蓝斑，选择密度合适( 100个蓝斑)的平板计数，计算扩增 噬菌体库的滴度。计算方法如下扩增噬菌体库的滴度=(蓝斑数目X对应噬菌体稀释倍 数)/10μ Kpfu/μ 1)。(12)下一轮筛选将滴定后的次级库再次与ΗΕΚ293细胞和结肠癌Caco-2细胞孵 育，筛选过程如上述，分别用上一轮结合、扩增、滴定的噬菌体次级库，进行3轮筛选，每轮 筛选投入的噬菌体量均为1. 5X 1010PFU，逐轮增加筛选强度与阴性细胞HEK293细胞孵育 时间增加至1. 25h、l. 5h、2h ；与靶细胞Caco-2细胞孵育时间每轮筛选减少为1. 5h、l. 25h、 Ih ；TBST洗涤次数相应增加为6次、8次、10次；洗涤液中Tween-20浓度依次增加为0. 2%、 0. 3%,0. 5%。2. 2. 4细胞ELISA初步鉴定噬菌体阳性克隆2. 2. 4. 1噬菌体单克隆的制备(1)经过第4轮筛选获得的噬菌体不经过扩增，直接感染宿主菌E. coli ER2738， 滴定铺制LB/IPTG/Xgal平板，37°C倒置培养过夜。(2)将过夜培养的宿主菌按1 100比例稀释于LB-Tet液体培养基，分装于30个 IOml离心管，每管3ml。(3)无菌操作，从长出蓝斑数目 100的平板上，随机挑取30个噬菌体克隆，接种 到分装好的离心管中，于37°C恒温摇床，225rpm，缓慢振摇4. 5h。(4)将每个噬菌体单克隆扩增液分装于灭菌1. 5ml离心管中，按照上述“噬菌体纯 化”方法纯化每个单克隆。(5)滴定每一个噬菌体单克隆。(6)以同样方法滴定原始噬菌体肽库，从滴定平板上随机提取一个克隆扩增、滴 定，以作为阴性噬菌体克隆对照。2. 2. 4. 2 ELISA法鉴定噬菌体单克隆与结肠癌细胞结合的特异性以人胚肾细胞系HEK293细胞为阴性对照细胞，人源结肠癌细胞系Caco-2细胞为 靶细胞，用全细胞酶联免疫吸附实验(ELISA)鉴定随机挑取的30个噬菌体克隆结合特异性 和亲和力，以排除假阳性和非特异性克隆，同时设立PBS对照及原始噬菌体肽库单克隆对 照(无关克隆对照)。具体操作方法如下(1)取生长状态良好的结肠癌细胞Caco-2和HEK293细胞，传代消化，细胞计数，接 种96孔细胞培养板，密度4X 105cellS/ml，每孔200 μ 1，每组设两个复孔，置于37°C，5% C02细胞培养箱中孵育24 36h，待细胞贴壁长满单层进行下步实验。(2)吸弃培养基，用预热的PBS洗涤2次，每孔加入200 μ 1无血清培养基，置细胞 培养箱孵育Ih。(3)吸弃培养基，PBS洗涤2次，加入4%多聚甲醛，100μ 1/孔，室温固定30min。(4)吸弃固定液，在吸水纸上轻轻拍干，PBS洗涤5minX3次。(5)在吸水纸上轻轻拍干，滴加3% H2O2，100 μ 1/孔，室温孵育20min，以阻断内源 性过氧化物酶活性。(6)弃H2O2，在吸水纸上轻轻拍干，PBS洗涤5minX3次。(7)加入 Blocking buffer (3% BSAin 0· 5% TBST)，250 μ 1/孔，室温封闭 2h。(8)吸去封闭液，0. TBST洗涤5次，分别加入噬菌体单克隆，1X1010PFU，100 μ 1/孔(稀释于0.2% TBST)，设PBS对照和原始噬菌体肽库单克隆对照，37°C孵育 1. 5h，间隔20min置脱色摇床缓慢振摇。(9)吸去噬菌体克隆，在吸水纸上轻轻拍干，PBS振荡洗涤5minX5次。(10)加入山羊抗 M13 多克隆抗体(1 2000 稀释于 Blocking buffer), 100 μ 1/ 孔，37°C孵育lh，并间隔15min放脱色摇床上缓慢振摇。(11)吸弃一抗，在吸水纸上轻轻拍干，PBS振荡洗涤5minX5次。(12)加入 HRP 标记兔抗山羊 IgG(l 8000 稀释于 Blocking buffer), 100 μ 1/ 孔，37°C孵育lh，并间隔15min放脱色摇床上缓慢振摇。(13)吸弃二抗，在吸水纸上轻轻拍干，PBS振荡洗涤5minX5次。(14)在吸水纸上轻轻拍干，加入现配TMB显色工作液，100 μ 1/孔，37°C孵育10 30min,肉眼观察(白色背景)，阳性孔应为蓝色或深蓝色，阴性孔和对照孔应无色或淡蓝 色。(15)加入显色终止液(2M H2S04)终止反应，50 μ 1/孔，立即用酶标仪于450nm波 长下测OD值，记录数据。(16)判定结果，分析酶标测定仪取λ = 450nm, Ρ/η彡2. 1时阳性，Ρ/η彡1. 5阴 性，1. 5 ^ P/n ^ 2. 1可疑阳性。重复上述步骤3次，3次ELISA检测Ρ/η彡2. 1的克隆为 阳性克隆。Ρ/η =结肠癌Caco-2细胞孔0. D值/人胚肾HEK293细胞孔0. D值(用空白孔 校 T = 100% )。(17)接种结肠癌Caco-2细胞于96孔细胞培养板，重复以上ELISA实验步骤，进 一步鉴定阳性克隆与结肠癌Caco-2细胞的结合活性，排除假阳性克隆，比较阳性克隆与 Caco-2细胞亲和力，每个克隆设8个复孔，同时设PBS对照和无关克隆对照。2. 2. 5阳性噬菌体克隆单链DNA快速纯化(1)按上述噬菌体扩增方法，扩增阳性克隆，在第一步离心后，将500 μ 1含噬菌体 上清转入新无菌1. 5ml离心管中。(2)加入200 μ 1 PEG/NaCl，反复颠倒混勻，室温放置IOmin。(3)4°C，12000rpm，离心15min，去上清，再次短暂离心，小心吸去残余上清。(4)沉淀物彻底重悬于100 μ 1碘化物缓冲液中，加入250 μ 1无水乙醇。室温温育 IOmin0短时间的室温温育使ssDNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。(5)41，10000印111，离心101^11，弃上清。用70%乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。(6)沉淀重悬于 30 μ 1 TEdOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 0), ImM EDTA)中。2. 2. 6噬菌体单链DNA测序取5μ 1噬菌体阳性克隆、噬菌体原库无关克隆对照和阴性克隆单链DNA作为模 板，稀释_96gIII测序引物5'-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，，送南京金丝瑞生物工 程公司全自动测序。根据噬菌体展示试剂盒说明书读序图，利用DNAStar软件找到Egal I 酶切位点CGGCCG和Kpn I酶切位点GGTACC，十二肽序列即插入这两个酶切位点之间，找出 编码Gly-Gly-Gly的碱基序列(GGT GGA GGT或CCA CCT CCA)其上游36个碱基为编码十二 肽的密码子，按照十二肽库的设计原则，每个密码子的第三位均为G或T，验证找到的碱基 序列是否正确，利用软件得出模板链的碱基序列，按照试剂盒说明书提供的三联密码子图 翻译成多肽序列(参见图2)。
融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随 机肽直接位于成熟蛋白的N末端，下箭头指示前导序列的切割位点。-28和-96引物的互补 位置也在图中标出。参见图3，文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密 码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的 菌株中，琥珀终止子TAG*可被Gln抑制。2. 2. 7阳性克隆氨基酸序列的同源性和特征分析将翻译的氨基酸序列通过NCBI/BLAST软件同数据库中蛋白质的氨基酸序列进行 同源性分析，将出现频率较高的序列用ExPASY提供的软件ProtParam tools来分析12肽 片段的组成及特点，利用FASTA工具来分析多肽序列的疏水性。2. 2. 8细胞免疫荧光法鉴定阳性噬菌体克隆的靶向性(1)细胞爬片的准备①将24mmX 24mm盖玻片浸泡，洗洁精清洗，自来水冲洗，稀盐酸浸泡8h，流水冲 洗，铬酸浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水、三蒸水冲洗三次，置于玻璃培养皿中高压灭菌，烘干②在6孔细胞培养板中滴加少量细胞培养基，用无菌操作，夹取盖玻片，放入培养 板孔中，使其贴附到孔底；③取生长状态良好的结肠癌Caco-2细胞和人胚肾HEK293细胞，PBS冲洗一遍， 胰蛋白酶消化收集细胞，细胞计数，接种至6孔细胞培养板孔中的盖玻片上，4X105cells/ ml，lml/well，置于37°C,5% C02细胞培养箱，培养24h。(2)免疫荧光检测阳性噬菌体克隆的靶向性①待Caco-2细胞和HEK293细胞培养至长满单层，吸弃培养基，PBS冲洗3次，吸 尽残留液体，4%多聚甲醛室温固定细胞，30min ；②用PBS 洗涤 5min X 3 次；③滴加3 % BSA室温封闭2h ；④弃封闭液，分别将展示CCSPl 4多肽的噬菌体阳性克隆滴加至细胞表面 (1X1010PFU)，37°C孵育 2h ；⑤PBS 洗涤 5minX5 次；⑥滴加抗Ml3多克隆抗体(工作浓度1 500)，37°C孵育2h ；⑦PBS 洗涤 5minX5 次；⑧滴加FITC标记兔抗山羊IgG (工作浓度1 100)，37°C孵育Ih ；⑨PBS洗涤5minX3次，90%缓冲甘油封片，尼康Ti-S倒置显微镜镜检并拍照记录。2. 2. 9统计学方法采用SPSS 16. O-GLM中的Univariate分析数据，数据均以士 SD表示，组间多重比 较采用Duncan检验处理。P < 0. 01为差异极显著，P < 0. 05为差异显著，P > 0. 05为无 统计学意义。三、实验结果3. 1噬菌体十二肽库4轮消减筛选
本发明是从噬菌体随机十二肽库中筛选出与人结直肠癌细胞亲和力较高的噬菌 体多肽，以人源结肠癌Caco-2细胞为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞为阴性吸附细胞， 完成对噬菌体十二肽库4轮消减筛选，回收与结肠癌Caco-2细胞结合的噬菌体，重复对阴 性细胞的消减筛选以排除非特异克隆。在筛选过程中，严格控制每轮筛选中加入噬菌体的 数量，以保证筛选结果的稳定性。噬菌体原库的效价为1.5X1013pfu/ml，第一轮筛选投入 噬菌体为1. 5 X IO11Pfu,回收噬菌体滴定后每轮尽量保证投入噬菌体量在1. 5 X IO10Pfu以 上(如表3-1和图4所示)，通过4轮消减筛选，特异性克隆得到大量富集和扩增，为进一步 挑取阳性克隆奠定良好的实验基础，提高了获得具有高亲和力噬菌体十二肽的可能性。表3-1四轮消减筛选中投入噬菌体量和回收噬菌体滴度
权利要求
1.Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛 选得到4条多肽片段，其氨基酸序列分别为SPSIDTRYSRLG ；CVSVGMKPSPRP ；SVSVGMKPSPRP ；MVSMDSSPRDRL。
2.如权利要求1所述的Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条 多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性，含有共有序列XXSXXXXXXXRXX。
3.如权利要求1所述的Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条 多肽片段均为亲水性多肽。
4.如权利要求1所述的Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条 多肽片段富含丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸和天冬氨酸。
5.如权利要求1所述的Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条 多肽片段能够特异性结合Caco-2细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。
6.权利要求1所述的Caco-2细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，其特征在于，该 方法利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的结直肠癌Caco-2细胞系为靶细胞，以人胚肾 细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增 并滴定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与Caco-2细胞的亲和力，排 除假阳性克隆，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多 肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序，BLAST检索蛋白质数据库，检测多肽基序同源 性较高的蛋白质，及可能结合的细胞表面受体和配体；细胞免疫荧光法检测噬菌体多肽克 隆的靶向性，进一步鉴定阳性克隆的特异性。
全文摘要
本发明公开了Caco-2细胞表面特异性结合的多肽，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到4条多肽片段，其氨基酸序列分别为SPSIDTRYSRLG，CVSVGMKPSPRP，SVSVGMKPSPRP和MVSMDSSPRDRL。本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选结直肠癌Caco-2细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与结直肠癌细胞的亲和力，获得10个噬菌体克隆，测序获得4条多肽序列，其共有氨基酸序列为XXSXXXXXXXRXX，同源性分析表明多肽基序可能为肿瘤细胞表面受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合Caco-2细胞，筛选获得的结肠癌Caco-2细胞特异性多肽为结直肠癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供初步的实验依据。
文档编号G01N33/50GK102127153SQ20101059185
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者侯颖春, 强荣兵, 王瀚 申请人:陕西师范大学