专利名称：一种拉曼编码微球的用途及利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法
技术领域：
本发明涉及一种拉曼编码微球的用途及利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法。
背景技术：
恶性肿瘤是当前危害人类健康的重要疾病之一，全世界每年有1000多万新病例和600多万人死亡。近年来，在医学家、生物学家的努力下，人类对于自身的认识已进入微观层次的剖析，从而对于肿瘤发生、发展的机制也有了更多的认识。在DNA、RNA、蛋白质、染色体以及细胞水平上观察到一系列和细胞癌变相关的变化，这些异常的变化，实质上就是细胞癌变不同阶段的标志。以肿瘤相关抗原作为肿瘤标志物，通过免疫分析技术进行检测， 有望实现对肿瘤的早期诊断。目前，肿瘤标志物的检测主要是通过酶免疫测定、放射免疫分析、荧光免疫分析、 化学发光免疫分析以及电化学发光免疫分析来实现。这些方法大部分都具有很高的精度和灵敏度，可以根据所测对象的性质选择某一种方法进行测量。但是它们都不同程度存在着操作复杂、费时费力、成本高等缺点。例如，酶免疫检测技术需要特制的进口试剂盒，并且生物酶的获取困难、成本较高，实验条件也较为苛刻等；荧光检测会受到样品自身荧光的干扰以及光漂白效应等。此外，不同类型的肿瘤往往存在相同的肿瘤标志物，而同种类型的肿瘤也存在多种肿瘤标志物，单一指标检测特异性不强、灵敏度低。

发明内容
本发明旨在提供一种拉曼编码微球的用途及利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法，本方法具有灵敏度高、选择性高且快速的特点。本发明解决技术问题采用如下技术方案本发明拉曼编码微球的用途的特点在于所述拉曼编码微球在肿瘤标志物检测中的应用。本发明拉曼编码微球的用途的特点也在于所述肿瘤标志物为癌胚抗原(CEA)、 甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、铁蛋白、细胞角蛋白、鳞状细胞癌抗原(SCC)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、糖类抗原125(CA125)、 糖类抗原199 (CA199)、糖类抗原50 (CA50)、糖类抗原153 (CA153)、糖类抗原7 (CA724)、糖类抗原M2(CAM》或人绒毛膜促性腺激素(HCG)。本发明利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法的特点在于按以下步骤操作a、将25mg拉曼编码微球分散到IOmL pH值为7. 4的0. OlM的磷酸缓冲液(PBS) 中，加入125yg检测抗体，在4°C下反应12小时得到纳米探针，向所述纳米探针中加入质量浓度为的牛血清白蛋白(BSA)封闭纳米探针表面空位，离心、洗涤后得到拉曼编码标记的纳米探针，分散到PBS中保存备用；
b、将15mg 二氧化硅包覆的磁性纳米粒子分散到50mL 2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，室温下搅拌30分钟得到聚乙烯亚胺修饰的纳米粒子，将所述聚乙烯亚胺修饰的纳米粒子分散到质量浓度为2. 5%的戊二醛溶液中反应1小时，离心、用PBS洗涤，然后加入75 μ g 检测抗体对应的包被抗体，在4°C环境下反应12小时，最后加入质量浓度为1 %的牛血清白蛋白(BSA)封闭未反应的醛基空位，离心、洗涤后得到固相抗体，分散到PBS中保存备用；所述聚乙烯亚胺溶液中添加有NaCl，NaCl的浓度为0. 5M ；c、将50 μ L含有肿瘤标志物的血清加入到步骤b得到的固相抗体中，在37°C条件下反应1小时，磁性分离、洗涤后加入步骤a得到的拉曼编码标记的纳米探针，在37°C下反应1小时，磁性分离、洗涤后得到免疫复合物，分散到PBS中备用；d、将步骤c得到的免疫复合物吸入毛细管中，利用外加磁场富集后进行SERS光谱的检测。本发明利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法的特点也在于所述的磁性纳米粒子为Fe^3O4或γ -Fe2O3等具有超顺磁性的纳米粒子。本发明使用的拉曼编码微球是按照以下方法制备得到的a、将0. 2g内核纳米粒子加入到50mL 2mg/mL的聚电解质溶液中，室温下搅拌30 分钟，离心、洗涤后得到聚电解质修饰的纳米粒子，将所述聚电解质修饰的纳米粒子分散到 50mL金属纳米粒子溶胶中，室温下搅拌30分钟得到单层金属纳米粒子包覆的核壳纳米粒子，将所述单层金属纳米粒子包覆的核壳纳米粒子重复依次加入聚电解质溶液和金属纳米粒子溶胶中，得到多层金属纳米粒子包覆的核壳纳米微球；所述聚电解质溶液中添加NaCl，NaCl的浓度为0. 5M。b、将ImL 5mM的拉曼活性物质加入到步骤a得到的多层金属纳米粒子包覆的核壳纳米微球中，室温下搅拌6-12小时，离心、洗涤后得到拉曼活性物质标记的核壳纳米微球；C、将步骤b得到的拉曼活性物质标记的核壳纳米微球加入到质量分数为2. 5%的戊二醛溶液中，反应1小时后用超纯水洗涤，得到封装的拉曼活性物质标记的核壳纳米微球，分散于超纯水中，备用。所述内核纳米粒子为二氧化硅纳米粒子、聚合物纳米粒子或磁性纳米粒子，粒径为 100-800nm。所述金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或铜纳米粒子等具有显著等离子体共振性质的金属纳米粒子，粒径为5-15nm。所述拉曼活性物质为含有芳环、杂环、氨基、羧酸基、磷原子或硫原子等具有拉曼活性的物质。所述聚电解质为聚乙烯亚胺、聚烯丙基氯化铵、聚二甲基二烯丙基氯化铵、明胶或壳聚糖等含有大量氨基官能团的水溶性聚合物。本发明检测肿瘤标志物方法中用拉曼活性分子进行标记，依据不同拉曼活性分子的特征谱峰进行拉曼编码，通过抗体偶联技术制备拉曼编码的免疫纳米探针；选用磁性纳米粒子作为固相抗体，设计基于磁性固相粒子选择性分离效应的多组分“固相抗体-待测抗原-标记免疫探针”三明治免疫检测结构；通过拉曼编码微球表面超强SERS效应和编码分子的拉曼信号输出实现对多肿瘤标志物的同步检测。与现有的技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果
1、本发明使用的拉曼编码微球具有超强SERS效应，可用于对多组分超痕量目标分析物进行定量化分析。2、本发明选用磁性纳米粒子作为固相抗体，可实现对目标分析物的快速分离和富集。3、本发明使得SERS技术应用范围拓宽，可选择大量不同表面增强拉曼特征振动的分子作为标记物同时检测多种待测物，为真正使SERS这种高灵敏度的检测技术普遍应用于医学诊断与研究中奠定基础。
四

图1为利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法示意图。图2为实施例1检测肿瘤标志物CEA的SERS光谱图。SERS光谱检测的激发光源波长是532nm。图2中1079,1142,1390,1434,1578011-1的振动峰是对巯基苯胺的典型特征振动，并且信号的强度随着CEA的浓度增加而增大，所以从检测到的对巯基苯胺的SERS信号，可判断待测样品中含有肿瘤标志物CEA。右上角的附图为拉曼强度比值(IeEA/IblaJ与肿瘤标志物CEA浓度的线性关系，可以看出在0. lpg/mL l.Ong/mL浓度范围呈线性关系， R = O. 994 (R表示线性相关系数)。图3为实施例2同时检测肿瘤标志物AFP、PSA和CA125的SERS光谱图。SERS光谱检测的激发光源波长是532nm。曲线a代表3-甲氧基苯硫酚标记的拉曼编码粒子对AFP 检测的拉曼光谱图，其中992cm—1峰是3-甲氧基苯硫酚的特征谱峰。曲线b代表2-甲氧基苯硫酚标记的拉曼编码粒子对PSA检测的拉曼光谱图，其中1039CHT1峰是2-甲氧基苯硫酚的特征谱峰。曲线c代表2-萘硫酚标记的拉曼编码粒子对CA125检测的拉曼光谱图，其中 1380cm"1峰是2-萘硫酚的特征谱峰。曲线d代表这3种拉曼编码粒子对AFP、PSA和CA125 同时检测的拉曼光谱图，992、1039和1380CHT1峰的信号均能被检测到。这一结果表明基于拉曼编码微球的免疫检测方法可以应用于多肿瘤标志物的免疫分析。
五具体实施例方式实施例1 本实施例以肿瘤标志物CEA为例，阐述利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物CEA的方法。(一 )拉曼编码微球的制备a、取95mL超纯水，依次加入ImL 30mM柠檬酸钠溶液和2mL 5mM硝酸银溶液，然后迅速注入ImL 50mM硼氢化钠溶液，室温下搅拌30秒后，加入ImL 5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮， 溶液逐渐变为深黄色，即得直径为5-15nm的银纳米粒子溶胶。b、将3. 6mL正硅酸四乙酯和88. ImL乙醇混合加入到250mL圆底烧瓶，搅拌条件下迅速加入11. 9mL氨水，在室温条件下使其完全反应，即得直径约为200nm的二氧化硅纳米粒子。c、取25mL步骤b制备的二氧化硅纳米粒子，离心并分散于50mL 2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，聚乙烯亚胺溶液中添加有NaCl，NaCl的浓度为0. 5M，室温下搅拌30分钟，然后离心洗涤，重新分散到步骤a制备的银溶胶中，室温下搅拌30分钟得到单层银纳米粒子包覆的二氧化硅纳米微球，将得到的单层银纳米粒子包覆的二氧化硅纳米微球重复依次加入聚乙烯亚胺溶液和银纳米粒子溶胶中，交替沉积聚乙烯亚胺和银溶胶，即得到不同组装层数的核壳二氧化硅纳米微球。d、将ImL 5mM的对巯基苯胺加入到5mg核壳二氧化硅纳米微球中，室温下搅拌6 小时，然后离心、洗涤，即制得对巯基苯胺标记的核壳纳米微球。e、将对巯基苯胺标记的核壳纳米微球浸泡在质量浓度2. 5%的戊二醛溶液中反应 1小时，用PH值为7. 4的0. OlM的磷酸缓冲液(PBS)充分淋洗，去除未反应的戊二醛，即得封装的对巯基苯胺标记的核壳纳米微球，即拉曼编码微球。( 二 )拉曼编码标记的纳米探针的制备向上述制备的25mg拉曼编码微球中加入125 μ g CEA抗体，在4°C环境下反应12 小时，最后用质量浓度为BSA封闭未反应的醛基空位，离心、洗涤后得到拉曼编码标记的纳米探针，将得到的拉曼编码标记的纳米探针分散在PBS中保存待用。(三)磁性固相抗体的制备a、称取1. 35g FeCl3 · 6H20，依次加入40mL乙二醇、0. 5g聚乙二醇和3. 6g无水醋酸钠，室温下搅拌12小时得到均勻的溶液，然后将其转移到50mL反应釜中，在200°C条件下反应M小时即得直径约为300nm的!^e3O4纳米粒子。b、取0. Ig Fe3O4纳米粒子，置于50mL 0. IM HCl中超声10分钟，然后分散于IOOmL 乙醇/水(乙醇和水的体积比=4 1)溶液中，再依次加入ImL氨水和30 μ L正硅酸四乙酯，室温下搅拌6小时，离心后得到二氧化硅包覆的!^e3O4纳米粒子，将15mg 二氧化硅包覆的I^e3O4纳米粒子分散于50mL 2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，聚乙烯亚胺溶液中含0. 5M的 NaCl，室温下搅拌30分钟，离心、洗涤后浸泡在质量浓度2. 5%的戊二醛溶液中反应1小时， 用PBS充分淋洗，去除未反应的戊二醛，然后加入75 μ g CEA包被抗体，在4°C环境下反应 12小时，最后用质量浓度为1 %的BSA封闭未反应的醛基空位，离心、洗涤后得到固相抗体， 将所得固相抗体分散在PBS中保存待用。(四)拉曼编码微球对肿瘤标志物CEA的SERS免疫检测a、将50 μ L含有肿瘤标志物CEA的血清加入到步骤(三)制备的固相抗体中，在 37°C下反应1小时，磁性分离、洗涤后加入步骤(二)得到的拉曼编码标记的纳米探针，在 37°C下反应1小时，磁性分离、洗涤后得到免疫复合物，将免疫复合物分散到PBS中备用。b、将步骤a得到的免疫复合物吸入毛细管中，磁性富集后进行SERS光谱的检测。 检测结果见图2。实施例2 —种拉曼编码微球对肿瘤标志物AFP、PSA和CA125的同时检测(一 )拉曼编码微球的制备本实施例中拉曼编码微球的制备方法同实施例1，不同的是分别用3-甲氧基苯硫酚、2-甲氧基苯硫酚和2-萘硫酚取代对巯基苯胺作为拉曼活性物质，分别得到封装的3-甲氧基苯硫酚标记的核壳纳米微球、封装的2-甲氧基苯硫酚标记的核壳纳米微球和封装的 2-萘硫酚标记的核壳纳米微球。( 二)拉曼编码标记的纳米探针的制备向上述制备的25mg封装的3_甲氧基苯硫酚标记的核壳纳米微球中加入125 μ g AFP抗体，在4°C环境下反应12小时，最后用质量浓度为1 % BSA封闭未反应的醛基空位，离心、洗涤后得到3-甲氧基苯硫酚标记的纳米探针，将得到的3-甲氧基苯硫酚标记的纳米探针分散在PBS中保存待用。向上述制备的25mg封装的2_甲氧基苯硫酚标记的核壳纳米微球中加入125 μ g PSA抗体，在4°C环境下反应12小时，最后用质量浓度为BSA封闭未反应的醛基空位，离心、洗涤后得到2-甲氧基苯硫酚标记的纳米探针，将得到的2-甲氧基苯硫酚标记的纳米探针分散在PBS中保存待用。向上述制备的25mg封装的2_萘硫酚标记的核壳纳米微球中加入125 μ g CA125 抗体，在4°C环境下反应12小时，最后用质量浓度为1 % BSA封闭未反应的醛基空位，离心、 洗涤后得到2-萘硫酚标记的纳米探针，将得到的2-萘硫酚标记的纳米探针分散在PBS中保存待用。将上述三种纳米探针混合后得到纳米探针的混合溶液，备用。(三)磁性固相抗体的制备本实施例中固相抗体的制备方法同实施例1，不同的是分别以AFP包被抗体、PSA 包被抗体和CA125包被抗体替换CEA包被抗体，分别得到AFP固相抗体、PSA固相抗体和 CA125固相抗体，将上述三种不同的固相抗体混合后得到混合固相抗体。(四)拉曼编码微球对肿瘤标志物CEA的SERS免疫检测a、将含有肿瘤标志物AFP、PSA和CA125的血清加入到混合固相抗体中，在37°C条件下反应1小时，磁性分离、洗涤后加入纳米探针的混合溶液，在37°C条件下反应1小时，磁性分离、洗涤后得到混合免疫复合物，将所得混合免疫复合物分散到PBS中备用。b、将步b得到的混合免疫复合物吸入毛细管中，磁性富集后进行SERS光谱的检测。检测结果见图3。本发明实施例中使用的0. OlM磷酸缓冲液(pH 7. 4)的配制方法如下将1. 22g K2HPO4,0. 136g KH2PO4 和 0. 85g NaCl 溶解在 IOOmL 超纯水中，然后再用超纯水稀释至IOOOmL即可。
权利要求
1.一种拉曼编码微球的用途，其特征在于所述拉曼编码微球在肿瘤标志物检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的拉曼编码微球的用途，其特征在于所述肿瘤标志物为癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特异性抗原、铁蛋白、细胞角蛋白、鳞状细胞癌抗原、酸性磷酸酶、 碱性磷酸酶、神经元特异性烯醇化酶、糖类抗原125、糖类抗原199、糖类抗原50、糖类抗原 153、糖类抗原724、糖类抗原242或人绒毛膜促性腺激素。
3.利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法，其特征在于按以下步骤操作a、将25mg拉曼编码微球分散到IOmLpH值为7. 4的0. OlM的磷酸缓冲液中，加入 125 μ g检测抗体，在4°C下反应12小时得到纳米探针，向所述纳米探针中加入质量浓度为的牛血清白蛋白封闭纳米探针表面空位，离心、洗涤后得到拉曼编码标记的纳米探针；b、将15mg二氧化硅包覆的磁性纳米粒子分散到50mL 2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，室温下搅拌30分钟得到聚乙烯亚胺修饰的纳米粒子，将所述聚乙烯亚胺修饰的纳米粒子分散到质量浓度为2. 5%的戊二醛溶液中反应1小时，离心、用PBS洗涤，然后加入75 μ g检测抗体对应的包被抗体，在4°C环境下反应12小时，最后加入质量浓度为1 %的牛血清白蛋白封闭未反应的醛基空位，离心、洗涤后得到固相抗体；所述聚乙烯亚胺溶液中添加有NaCl，NaCl的浓度为0. 5M ；C、将50μ L含有肿瘤标志物的血清加入到步骤b得到的固相抗体中，在37°C条件下反应1小时，磁性分离、洗涤后加入步骤a得到的拉曼编码标记的纳米探针，在37°C下反应1 小时，磁性分离、洗涤后得到免疫复合物；d、将步骤c得到的免疫复合物吸入毛细管中，利用外加磁场富集后进行SERS光谱的检测。
4.根据权利要求3所述的利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法，其特征在于所述的磁性纳米粒子为狗304或γ -Fe2O3纳米粒子。
全文摘要
本发明公开了一种拉曼编码微球的用途及利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法，其中拉曼编码微球的用途是在肿瘤标志物检测中的应用；利用拉曼编码微球检测肿瘤标志物的方法是将拉曼编码微球分散到磷酸缓冲液中并加入检测抗体反应得到纳米探针，再以牛血清白蛋白封闭纳米探针表面空位得到拉曼编码标记的纳米探针；将含有肿瘤标志物的血清加入固相抗体中，反应后加入拉曼编码标记的纳米探针，得到免疫复合物，免疫复合物经过外加磁场富集后进行SERS光谱的检测。本发明使用的拉曼编码微球具有超强SERS效应，可用于对多组分超痕量目标分析物进行定量化分析，并可选择大量不同表面增强拉曼特征振动的分子作为标记物同时检测多种待测物。
文档编号G01N33/574GK102323412SQ20111022679
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者关贵俭, 刘仁勇, 刘变化, 张忠平, 蒋长龙 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院