专利名称：一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法及其专用试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水产动物摄食后的胃容物荧光辅助测量方法及其专用试剂，特 别涉及一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法及其专用试剂。
背景技术：
曼氏无针乌贼曾是我国渔场的四大渔业之一，对温度的适应性较强，在我国沿 海分布很广，是一种经济价值很高的传统渔业种类。由于过度捕捞和生态恶化，自 20世纪70年代以来，先后出现了衰退现象。上世纪八十年代有报道李星颉等对曼 氏无针乌贼资源及增殖的初步研究，而国外有对商乌贼的生物学及养殖方面的报 道。要进行乌贼人工繁殖与育苗，首先必须进行乌贼的基础生物学的研究。1963年 Blaze和Hempeh首先提出初次摄食期仔鱼饥饿"不可逆点"(the point of no return, PNR)即初次摄食期仔鱼耐受饥饿的时间临界点的概念，从生态学角度研究初次摄食 期仔鱼耐受饥饿的能力和描述最终导致仔鱼死亡的饥饿程度。对仔鱼初次摄食期耐 受饥饿的时间临界点的研究一些学者对多种淡水鱼、真鲷、牙鲆、杂交鲟和黄鲷。 尚无对头足类相关报道出现。
有关头足类早期发育阶段的基础研究，国内外报道都很少。对头足类幼体不可 逆点的观察，旨在为头足类基础生物学研究积累资料，为头足类的苗种生产及存活 率的提高提供理论依据。研究人员在观察了曼氏无针乌贼幼体的不可逆点，由于在 镜检时乌贼墨颜色为黑色，会严重影响肉眼的镜检的准确性，所以需要一种新的方 法来解决这一问题。

发明内容
本发明的目的是提供一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法及其专用试剂，以 此解决头足类墨影响镜检效果的技术问题，并且该操作方法简单，成本低廉。 本发明一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量专用试剂，其按重量份数含有 染色液O.OOl份至O.l份罗丹明B;
处理液l份至3份双草酸二酯、l份至3份叔丁醇、l份至2份水杨酸甲酯、l份至2 份乙醇、0.5份至2份甘油；显示液3份至10份双氧水。
双氧水的浓度为质量分数20%至70%。
本发明一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法，其包括如下步骤
① 选取饵料与罗丹明B溶液均匀混合，使罗丹明B与铒料结合；
② 清洗去除经过步骤①处理后的饵料表面残留的罗丹明B;
③ 用经过步骤②清洗后的饵料投喂头足类幼体
④ 将经过步骤③处理后的头足类幼体粉碎后与处理液均匀混合，再加入双氧水； 处理液按重量份数含有1份至3份叔丁醇、l份至2份水杨酸甲酯、l份至2份乙醇。
饵料为轮虫或卤虫或桡足类或人工饲料。
步骤①中的罗丹明B溶液所采用的溶剂为海水或淡水；步骤②中清洗所用的洗液 与步骤①中的罗丹明B溶液所采用的溶剂相同。
步骤②的清洗方式为筛绢筛洗，并且筛绢的孔径小于饵料的粒径。
头足类幼体的养殖水体中含有l克/米s至8克/米s的EDTA钠盐；步骤②中的溶剂含 有l克/米s至8克/米s的EDTA钠盐。
与现有技术相比，本发明的优点在于-
本发明使用了化学发光来辅助头足类幼体摄食检测的观察。由于在镜检时头足类 的墨颜色为一般为黑色，在解剖镜检的过程中，头足类幼体会应激喷墨，导致墨污染 胃的内容物，从而严重影响肉眼的镜检的准确性。化学发光来辅助镜检，通过暗室观 察，可以有效的排除墨对镜检的影响。另外，本发明可以在海水中发光，克服了原有 化学发光体系不能在有水的情况下发光的缺点，采用EDTA钠盐在去除重金属离子减 少其对头足类幼体的毒害的同时排除了这些离子对化学发光的湮灭，能有效提高发光 的亮度。
具体实施例方式
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例l: 一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量专用试剂，其特征是按重量份 数含有染色液O.OOl份罗丹明B;处理液l份双草酸二酯、l份叔丁醇、l份水杨 酸甲酯、l份乙醇、0.5份甘油；显示液3份双氧水。其中双氧水的浓度为质量分数 20%至70%，本实施例优选质量分数为30%的双氧水。本实施例采用的双草酸二酯为 双(2， 4， 5-三氯水杨酸正代酯)草酸二酯(CPP0)。一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法
本实施例采用曼氏无针乌贼幼体，选取秋季育苗阶段体质健康、活力强的同一批
刚出膜的个体。放入玻璃缸暂养，暂养盐度17%。，水温i6士rc，暂养期间不投饵；
① 选取轮虫与罗丹明B溶液均匀混合，使罗丹明B与轮虫充分结合，染色时间为
10min。步骤①中的罗丹明B溶液所采用的溶剂为海水或淡水；
② 用海水清洗轮虫3次，清洗去除经过步骤①处理后的轮虫表面残留的罗丹明 B。清洗方式为筛绢筛洗，并且筛绢的孔径小于轮虫的粒径。步骤②中的溶剂含有 1克沐3的EDTA钠盐。此时罗丹明B会残留在轮虫体内；
③ 用经过步骤②清洗后的轮虫投喂头足类幼体；头足类幼体的养殖水体中含有l 克/米s的EDTA钠盐；
④ 将经过步骤③处理后的头足类幼体放入研钵捣碎后与按重量份数含有1份双草 酸二酯、l份叔丁醇、l份水杨酸甲酯、l份乙醇、0.5份甘油的处理液均匀混合，最后 加入双氧水。如乌贼幼体摄食了经染色的轮虫，染色液、处理液、显示液三种液体中 的有效成分将产生化学发光，在暗室中可见红色荧光。最后进行计数。
实施例2: —种头足类幼体摄食率荧光辅助测量专用试剂，其特征是按重量份 数含有染色液O.OOl份罗丹明B;处理液2份双草酸二酯、l份叔丁醇、l份水杨 酸甲酯、l份乙醇、l份甘油；显示液3份双氧水。本实施例优选经蒸发浓縮的质量 分数为60%的双氧水。本实施例采用的双草酸二酯为双(2， 4， 5-三氯水杨酸正代酯) 草酸二酯(CPPO)。
一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法
本实施例采用曼氏无针乌贼幼体，选取秋季育苗阶段体质健康、活力强的同一批
刚出膜的个体。放入玻璃缸暂养，暂养盐度1796。，水温16土rC，暂养期间不投饵；
① 选取轮虫与罗丹明B溶液均匀混合，使罗丹明B与轮虫充分结合，染色时间为
10min。步骤①中的罗丹明B溶液所采用的溶剂为海水或淡水；
② 用海水清洗轮虫至少2次，以清洗的滤出液无色透明为准，入尚带有罗丹明 B的颜色则适当增加清洗次数。清洗的目的在于去除经过步骤①处理后的轮虫表面 残留的罗丹明B。清洗方式为筛绢筛洗，并且筛绢的孔径小于轮虫的粒径，可以采 用200目筛绢，制成网兜状，以作为清洗工具。步骤②中的溶剂含有8克/米3的 EDTA钠盐。此时罗丹明B会残留在轮虫体内；
③ 用经过步骤②清洗后的轮虫投喂头足类幼体；头足类幼体的养殖水体中含有l 克/米s的EDTA钠盐；
④ 将经过步骤③处理后的头足类幼体放入研钵捣碎后与按重量份数含有2份双草酸二酯、l份叔丁醇、l份水杨酸甲酯、l份乙醇、l份甘油的处理液水浴加热混合均匀 的处理液混合，最后加入双氧水。如乌贼幼体摄食了经染色的轮虫，染色液、处理液、 显示液三种液体中的有效成分将产生化学发光，在暗室中可见红色荧光。最后进行计 数。
荧光方法的使用縮短了检验的时间，操作方便，同时避免了胃容物检验的人为因 素影响。荧光方法尤其适用于头足类的胃容检验，由于头足类大多具有墨囊，在解剖 时若对墨囊摘除失败，墨就会与内脏混在一起，从而影响对内容物的观察。并且，实 验中为发现乌贼幼体对染色物的反常行为。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领 域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实 施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求 限定的范围为准。
权利要求
1、一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量专用试剂，其特征是按重量份数含有染色液0. 001份至0.1份罗丹明B；处理液1份至3份双草酸二酯、1份至3份叔丁醇、1份至2份水杨酸甲酯、1份至2份乙醇、0.5份至2份甘油；显示液3份至10份双氧水。
2、 根据权利要求2所述的一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量专用试剂，其特征是:所述的双氧水的浓度为质量分数20%至70%。
3、 一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法，其特征是包括如下步骤① 选取饵料与罗丹明B溶液均匀混合，使罗丹明B与所述的饵料结合；② 清洗去除经过步骤①处理后的饵料表面残留的罗丹明B;③ 用经过步骤②清洗后的饵料投喂头足类幼体；④ 将经过步骤③处理后的头足类幼体粉碎后与处理液均匀混合，再加入双氧水；所 述的处理液按重量份数含有1份至3份叔丁醇、l份至2份水杨酸甲酯、l份至2份乙醇。
4、 根据权利要求3所述的一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法，其特征是所述的惧料为轮虫或卤虫或桡足类或人工饲料。
5、 根据权利要求3所述的一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法，其特征是所 述的步骤①中的罗丹明B溶液所采用的溶剂为海水或淡水；所述的步骤②中清洗所用的 洗液与所述的步骤①中的罗丹明B溶液所采用的溶剂相同。
6、 根据权利要求3至5任一权利要求所述的一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法，其特征是所述的步骤②的清洗方式为筛绢筛洗，并且筛绢的孔径小于所述的饵料的粒径。
7、 根据权利要求6所述的一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法，其特征是所 述的头足类幼体的养殖水体中含有l克沐s至8克沐s的EDTA钠盐；所述的步骤②中的溶 剂含有l克/米s至8克/米s的EDTA钠盐。
全文摘要
本发明公开了一种头足类幼体摄食率荧光辅助测量方法及其专用试剂，该专用试剂的染色液为罗丹明B；处理液含有双草酸二酯、叔丁醇、水杨酸甲酯、乙醇和甘油；显示液为双氧水。该测量方法为①选取饵料与罗丹明B溶液均匀混合，使罗丹明B与饵料结合；②清洗去除经过步骤①处理后的饵料表面残留的罗丹明B；③用经过步骤②清洗后的饵料投喂头足类幼体；④将经过步骤③处理后的头足类幼体粉碎后与处理液均匀混合，再加入双氧水。该测量方法及其专用试剂使用是能通过暗室观察，可以有效的排除头足类的墨对镜检的影响，另外，本发明可以在海水中发光，克服了原有化学发光体系不能在有水的情况下发光的缺点。
文档编号G01N21/76GK101435776SQ200810121898
公开日2009年5月20日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者吕振明, 吴常文, 徐佳晶, 迟长凤 申请人:浙江海洋学院