专利名称：黄花蒿叶表面腺毛的观察及密度测定方法
技术领域：
本发明涉及生命科学技术领域，具体地涉及到一种黄花蒿叶表面腺毛光学显微镜 观察与密度测定的方法。
背景技术：
黄花蒿(Artemisia annua L )又名臭蒿，为菊禾斗(Asteraceae)蒿属(Artemisia) 植物。黄花蒿的叶表面存在两种毛状体，为非分泌型毛状体和腺毛，其中腺毛对青蒿素的生 物合成十分重要，被认为是青蒿素生物合成与储存的场所。青蒿素是我国学者首次从黄花 蒿中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，是治疗疟疾的特效药，国际市场需求量非常大。 进一步的药理研究证明，青蒿素及其衍生物具有杀死多种癌细胞的作用，包括乳腺癌细胞、 血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等， 而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药不存在交叉耐药。有望将青蒿素及其类似物开 发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景。已有研究证明，腺毛的密度直接与青蒿素的产量呈正相关。对腺毛的研究将有利 于揭示青蒿素生物合成的机理，为提高黄花蒿中青蒿素的含量提供新的途径。此外，由于腺 毛的密度与青蒿素含量相关，因而腺毛密度也将成为黄花蒿遗传育种的一个非常直观的考 察指标。由于腺毛非常细小，肉眼无法看到，目前基本是借助电子显微镜或荧光解剖显 微来观察黄花蒿叶表的腺毛。蔡刘体等人(“烟草叶片表面腺毛形态的扫描电镜观察”， Chinese Agricultural Science Bulletin Vol.24 No. 8 2008 年 8 月)公开了一种采用 扫描电镜的方法对叶片表面的腺毛形态和细微结构进行观察的方法，其中涉及各种化学试 剂来制备电镜扫描样品，如2. 5%戊二醛固定4h ；锇酸4h ；0. IM磷酸缓冲液洗涤6次， 每次15min ；然后依次用梯度浓度为30%、50%、70%、90%的酒精逐级脱水，每次151^11 ；无 水丙酮(提前2d加无水氯化钙)脱水3次，每次15min ；醋酸异戊酯(提前2d加无水氯化 钙)置换2次，每次15min。将干燥后的样品进行真空喷镀。由于电子显微镜和荧光解剖显 微都非常昂贵，非一般实验室所具备，并且需要各种化学试剂，导致实验成本较高，仪器操 作复杂繁琐，实验材料处理工序很多，造成实验结果往往不理想。朱卫平等人(“黄花蒿腺毛状分泌腺的起源和发育”，《湖南农业大学学报(自然科 学版)》第33卷第4期第416-418页，2007年8月)报道了利用光学显微镜观察黄花蒿腺 毛的方法，但该方法一般需要复杂的切片和染色过程，而且无法观察到黄花蒿叶表面整体 腺毛生长情况，比如说无法知道腺毛密度情况等。另外，涉及切片和染色的繁琐，该方法只 能适用于单个或少数样品的检测，难以实现高通量样品的黄花蒿腺毛的观测。中国公开专利CN101556215(申请号200910022472，名称为“一种田间试验无损 伤定位观察植物气孔的取样方法”)公开了一种简单的田间试验无损伤定位观察植物气孔 的取样方法。该方法包括在拟观察部位均勻薄薄的涂布一层指甲油；用透明胶带贴于指 甲油膜上，中心部位对准；将透明胶和指甲油膜一起揭下，用解剖针辅助使指甲油膜与叶片分离；将揭取的胶带与指甲油膜复合膜平面贴实于干净载玻片上；用解剖针或洁净刀片缓 慢引导以防止气泡，指甲油膜四周必须至少有1 2mm透明胶带并贴实于载玻片上，把指甲 油膜封闭在载玻片上；显微镜观察与测量。然而，这种观测叶片表面的方法只能用于不易变 形的气孔组织，如果应用于观察腺毛显微结构，不但会破坏了叶片腺毛结构，同时导致整体 腺毛数量和密度发生失真，难以用于黄花蒿叶表面的腺毛观测中。因此，建立简单、快速、低成本以及高通量的黄花蒿叶表面腺毛观察方法是非常必 要的，也将为青蒿素生物合成研究提供一个新的有力工具，对黄花蒿的生产以及质量评价 有重要的应用价值和指导意义。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前尚无观察黄花蒿叶表面腺毛的相关技 术，提供一种黄花蒿叶表面腺毛的观察及密度测定方法，利用试剂A (石油醚或正己烷)、试 剂B (无水乙醇或甲醇)、试剂C(冰醋酸)快速处理，然后用光学显微镜观测黄花蒿叶腺毛 形态、分布及测定其密度。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种黄花蒿叶表面腺毛的 密度测定方法，该方法包括如下步骤a、叶片处理取生长旺盛的黄花蒿叶片装入容器；依次加入试剂A、试剂B、和试剂 C，混勻后于室温孵育5-20分钟；叶片面积试剂总用量为1平方厘米0. 2-2mL，试剂总用 量小于容器体积的2/3 ；试剂A、B、和C皆为分析纯，其中试剂A为石油醚或正己烷，占试 剂总用量的95% -99% ；试剂B为无水乙醇或甲醇，占试剂总用量的为0. 5% -1% ；试剂C 为冰醋酸，占试剂总用量的0-0. 5% ；该容器为离心管或微孔板；b、取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，压片夹压紧后于 光学显微镜下计算腺毛个数；C、计算腺毛密度叶表面腺毛密度等于一定面积内的腺毛个数除以该面积。上述b步骤中的轻轻盖上盖玻片是指先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘 接触，然后自一侧轻轻盖下。上述b步骤中的于光学显微镜下计算腺毛个数是指在光学显 微镜下直接计数一定面积内腺毛的个数，或是用成像工具拍照，然后在照片中计数一定面 积内腺毛的个数。上述光学显微镜，可在IOX的目镜下，选用4X、IOX、40X或100X的物镜计算 腺毛个数，优选IOX的物镜。本发明的黄花蒿叶表面腺毛的观察方法，该方法包括如下步骤a、叶片处理取生长旺盛的黄花蒿叶片装入容器；依次加入试剂A、试剂B、和试剂 C，混勻后于室温孵育5-20分钟；叶片面积试剂总用量为1平方厘米0. 2-2mL，试剂总用 量小于容器体积的2/3 ；试剂A、B、和C皆为分析纯，其中试剂A为石油醚或正己烷，占试 剂总用量的95% -99% ；试剂B为无水乙醇或甲醇，占试剂总用量的为0. 5% -1% ；试剂C 为冰醋酸，占试剂总用量的0-0. 5% ；该容器为离心管或微孔板；b、取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，压片夹压紧后于 光学显微镜下观察。上述a步骤中的叶片指含水率在65%-75%的鲜叶，尤以刚刚展开的新叶为最佳。叶片可用蒸馏水清洗后，再用滤纸干燥，然后装入容器。并且观察样品为少量时，可使用离 心管，优选0. 2-2ml离心管；用于高通量样品的容器为微孔板，优选96孔微孔板。上述b步骤中的轻轻盖上盖玻片是指先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘 接触，然后自一侧轻轻盖下，以免产生气泡影响观察。上述光学显微镜，可在IOX的目镜下，选用4X、IOX、40X或100X的物镜从低 倍到高倍顺序观察腺毛形态，优选40X或100X的物镜。上述的观察方法还可用于观察其他植物叶片材料。与现有技术相比，本发明的优点是1、方法简便，设备要求低，便于科学研究与实际生产，效率高，重复性好，准确度高。2、改变了传统的前处理方法，大大地简化了实验材料前处理工序，实验材料不必 经任何干燥与固定过程处理，整个操作可在半小时内完成，且不需要昂贵的实验设备，试剂 用量少，大幅度降低了测定成本与时间，可用于高通量分析。3、实验过程中所使用的试剂少且无毒，环保安全，运行成本低。4、该法除了能清晰地看到黄花蒿叶表面的腺毛之外(Glandular Trichomes)，还 能同时清楚观察到非分泌型毛状体(Non-glandular Trichomes)，为考察非分泌型毛状体 的功能提供了有力工具。5、本发明方法使用高通量技术快速检测叶片样品。


图1是显示在4X物镜下的青蒿腺毛显微照片。图2是显示在IOX物镜下的青蒿腺毛显微照片。图3是显示在40 X物镜下腺毛(B)和非分泌型毛状体(A)的显微照片。图4是显示在100X物镜下单个非分泌型毛状体的显微照片，A和B分别显示两 个不同的毛状体，说明形态有差异。图5是显示在100X物镜下单个腺毛的显微照片，A和B分别显示两个不同的腺 毛，说明形态有差异。
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一 个或类似实例。实施例1 随机挑选96株生长健康，生长年龄3个月的黄花蒿，从主茎的茎顶上取刚完全展 开的第一片叶片完整、生长旺盛(主要指叶片刚完全展开不久，并无病虫害等)的黄花蒿 叶，如有需要加蒸馏水洗一次，各取1平方厘米依次置于96平板的小孔中，依次加入198 μ L 的石油醚、1. 7μ L的无水乙醇和0. 3μ L的冰醋酸试剂于各孔中，室温孵育7min。取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，放在Motic Bl光学 显微镜的镜台上，要观察的部位应准确地移到物镜的下面，然后用压片夹压紧。盖玻片一定 要擦拭清洁，否则将影响观察。加盖玻片时要小心，先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘接触，然后自一侧轻轻盖下。如果突然放下盖玻片，将会产生气泡影响观察。叶片可以是 近轴面朝上也可以是远轴面朝上，但为了使结果有可比性，叶片放置方向需一致。在IOX目镜下，依次使用4X，IOX，40X或100X的物镜观察，成像，计数腺毛个 数，最后计算腺毛密度。其中，观察时要睁开双眼，用左眼观察显微镜目镜视野中的象。进 行观察时，应先用IOX物镜。为了避免物镜压坏制片(在使用高倍物镜时最易发生)，必须 用下面方法聚焦即一方面从侧面注视物镜与制片间的距离；一方面转动粗聚焦器，使镜 筒逐渐下降，直到接近盖玻片为止。然后用左眼观察目镜视野，慢慢转动粗聚焦器使镜筒逐 渐上升，直到看清制片中的影象为止。观察制片时，首先在低倍物镜下了解制片的概况，如 果所要观察部分位于视野的一侧，则要移动制片，将要观察的部位移到中央。移动制片时应 注意显微镜中所形成的象是倒象，因此要改变图象在视野中的位置时，需向相反的方向移 动制片。在4X，10X，40X或100X的物镜下均可清晰看到腺毛，以在IOX的物镜下计数 腺毛个数最佳，如需进一步观察腺毛形态则可跟换40X或100X的物镜。可用在显微镜下直接计数一定面积内腺毛的个数，也可以先用数码相机或其它成 像工具拍照，然后在照片中人工或利用软件计数一定面积内腺毛的个数。整个过程约10分钟。观测结果如图1至图5所示。本实施例测得的腺毛密度为 29. 2个/平方毫米。实施例2 随机挑选10株生长健康，生长年龄6个月的黄花蒿，从主茎的茎顶上取完全展开 的第3片叶片完整、生长旺盛的黄花蒿叶，如有需要加蒸馏水洗一次，各取1平方厘米依次 置于1. 5ml的离心管中，依次加入980 μ L的石油醚、15 μ L的无水乙醇和5 μ L的冰醋酸试 剂于各离心管中，室温孵育15min。根据实施例1的方法，取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，盖上盖玻片， 置于Motic Bl光学显微镜的镜台上，在IOX目镜下，使用4X或IOX的物镜下观察，成像， 计数腺毛个数，最后计算腺毛密度。本实施例测得的腺毛密度为37. 6个/平方毫米。整个过程约20分钟。实施例3 随机挑选10株生长健康，生长年龄9个月的黄花蒿，从主茎的茎顶上取完全展开 的第5片叶片完整、生长旺盛的黄花蒿叶，如有需要加蒸馏水洗一次，各取1平方厘米依次 置于2ml的离心管中，依次加入1900 μ L的石油醚、90 μ L的无水乙醇和10 μ L的冰醋酸试 剂于各离心管中，室温孵育20min。根据实施例1的方法，取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，盖上盖玻片， 置于Motic Bl光学显微镜的镜台上，在IOX目镜下，使用4X或IOX的物镜观察，成像， 计数腺毛个数，最后计算腺毛密度。本实施例测得的腺毛密度为45. 9个/平方毫米。整个过程约25分钟。
权利要求
一种黄花蒿叶表面腺毛的密度测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤a、叶片处理取生长旺盛的黄花蒿叶片装入容器；依次加入试剂A、试剂B、和试剂C，混匀后于室温孵育5 20分钟；叶片面积试剂总用量为1平方厘米0.2 2mL，且试剂总用量小于容器体积的2/3；试剂A、B、和C皆为分析纯，其中试剂A为石油醚或正己烷，占试剂总用量的95％ 99％；试剂B为无水乙醇或甲醇，占试剂总用量的为0.5％ 1％；试剂C为冰醋酸，占试剂总用量的0 0.5％；该容器为离心管或微孔板；b、取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，压片夹压紧后于光学显微镜下计算腺毛个数；c、计算腺毛密度叶表面腺毛密度等于一定面积内的腺毛个数除以该面积。
2.如权利要求1所述的黄花蒿叶表面腺毛的密度测定方法，其特征在于所述b步骤 中的轻轻盖上盖玻片是指先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘接触，然后自一侧轻轻盖下。
3.如权利要求1所述的黄花蒿叶表面腺毛的密度测定方法，其特征在于所述b步骤 中的于光学显微镜下计算腺毛个数是指在光学显微镜下直接计数一定成像面积内腺毛的 个数，或是先用成像工具拍照，然后在照片中计数一定面积内腺毛的个数。
4.如权利要求3所述的黄花蒿叶表面腺毛的密度测定方法，其特征在于所述光学显 微镜在IOX的目镜下，选用IOX的物镜。
5.一种黄花蒿叶表面腺毛的观察方法，其特征在于该方法包括如下步骤a、叶片处理取生长旺盛的黄花蒿叶片装入容器；依次加入试剂A、试剂B、和试剂C，混 勻后于室温孵育5-20分钟；叶片面积试剂总用量为1平方厘米0. 2-2mL，试剂总用量小 于容器体积的2/3 ；试剂A、B、和C皆为分析纯，其中试剂A为石油醚或正己烷，占试剂总 用量的95% -99% ；试剂B为无水乙醇或甲醇，占试剂总用量的为0. 5% -1% ；试剂C为冰 醋酸，占试剂总用量的0-0. 5% ；该容器为离心管或微孔板；b、取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，压片夹压紧后于光学 显微镜下观察。
6.如权利要求5所述的黄花蒿叶表面腺毛的观察方法，其特征在于所述a步骤中的 叶片指含水率在65% -75%的鲜叶。
7.如权利要求5所述的黄花蒿叶表面腺毛的观察方法，其特征在于所述b步骤中的 轻轻盖上盖玻片是指先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘接触，然后自一侧轻轻盖 下。
8.如权利要求5所述的黄花蒿叶表面腺毛的观察方法，其特征在于所述光学显微镜 在IOX的目镜下，选用40X或100X的物镜。
9.如权利要求5至8中任一项所述的观察方法，其特征在于该方法用于观察其他植 物叶片材料。
全文摘要
一种黄花蒿叶表面腺毛的观察及密度测定的方法，是取生长旺盛的黄花蒿叶片装入离心管或微孔板；依次加入石油醚或正己烷、无水乙醇或甲醇、和冰醋酸，混匀后于室温孵育5-20分钟；取出叶片于载玻片上，滴加一滴双重蒸馏水，轻轻盖上盖玻片，压片夹压紧后于光学显微镜下观察、或计算腺毛个数以计算腺毛密度。该方法简便，设备要求低，大大地简化了实验材料前处理工序，整个操作可在半小时内完成，且使用试剂少且无毒，环保安全，大幅度降低了测定成本与时间，可用于高通量分析。
文档编号G01N21/84GK101975780SQ20101015825
公开日2011年2月16日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者刘仲华, 刘硕谦, 田娜, 黄建安 申请人:湖南农业大学