专利名称：一种利用lc-ms/ms高效鉴别植物次生代谢产物的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代 谢产物的方法，可用于研究任何一种植物的任何组织器官中所含有的次生代谢产物。
背景技术：
代谢组学是对生物或细胞内所有低相对分子质量代谢产物同时进行定性和定量 分析的一门新学科，它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息 建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后 系统生物学的另一重要研究领域，已成为后基因组学时代的一个非常重要的分支学科。在 生物学研究领域，作为基因型与表型之间的桥梁，代谢组学将基因产物和基因关联起来，实 现基因功能的鉴定，成为功能基因组学研究的有力工具(Oliver Fiehn0Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes。 Plant Molecular Biology，2002)。据佛罗里达大学的有关专家估计，所有植物代谢产物加起来有90000-200000种， 如拟南芥代谢组中化合物的数量有近5000个。然而，代谢组学作为一种重要的功能基因 组的工具，对植物组织和细胞中复杂的次生代谢产物进行高通量的鉴别与分析仍然是其发 展的瓶颈所在。(Raoul J. Bino et al. , Potential of metabolomics as afunctional genomics tool。TRENDS in Plant Science，2004)，所以，对植物次生代谢产物建立一 种快速可靠、高通量、高灵敏度的检测与分析方法是必须的(Oliver Fiehn0 Metabolite profiling for plant functional genomics。Nature，2000)，对细胞、组织或整个有机体 内所有的次生代谢产物进行综合定性及定量分析是代谢组学发展的一个长远而又伟大的 目标(Lloyd W. Sumner et al.，Plant metabolomics :large_scale phytochemistry in the functional genomics era。Phytochemistry，2003)。现有的技术中，OliverFiehn 等 利用GC/MS在拟南芥的叶子提取物中同时检测到3 种不同的次生代谢产物，并测定了近 一半代谢产物的化学结构(Oliver Fiehn。Metabolite profiling for plant functional genomics。Nature，2000)，这是代谢组发展的一个飞跃，它进一步证明了代谢组是功能基 因组研究的重要工具。Sofia Moco等利用LC/MS在番茄的果肉和果皮中鉴别出一系列代 谢产物，同时，他们还结合在番茄中已报道的次生代谢产物，建立了番茄代谢数据库(Sofia Moco et al. ,A Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolome Database for Tomato ο Plant Physiology，2006)。Kazuki Saito 等利用 LC/MS/MS 在拟南芥的不 同组织中检测到多个峰图，其中大约一半有谱图(Kazuki Saito et a 1.，MS/MS spectral tag-based armotation of non-targeted profile of plant secondary metabolites。 The Plant Journal，2009)，这些物质大多都是黄酮和糖类物质。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方 法，其最大特点是对任何植物的任何组织或器官，都可以同时检测到近千种次生代谢产物。本方法操作简便，应用性强，对植物次生代谢产物的研究有着重大的意义。同时，可以利用 该方法建立不同植物的次生代谢产物数据库，从而促进植物代谢组学的发展。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方法，其步骤是1、样品制备(1)取适量(大于IOg)新鲜样品，液氮保存。(2)配制提取液。水溶性代谢产物提取液为Vfe Vilg= 100 0.04，V代表体 积；脂溶性代谢产物的提取液为V氣仿Vw: Viig= 70 30 0.04，V代表体积。其中 甲醇和乙酸为色谱纯试剂(TEDIA公司，America)，氯仿为分析纯试剂(国药集团化学试剂 有限公司)。(3)称取适量(大于IOg)样品，在研钵中加液氮磨成粉状后加入预冻好的离心管 中，立即按Ig 2ml加入提取液，强烈涡旋IOs后将样品放入4°C冰箱，每隔IOmin再涡旋 一次，重复3次后放入4°C冰箱过夜。(4)次日用4°C离心机IOOOOrpm离心IOmin后吸取上清，将上清氮吹吹干后再按 IOg Iml比例加入纯甲醇进行充分溶解。( 用0.22 μ m尼龙膜将溶解液过滤后装入进样样品管，放-70°C冰箱保存，待测。2、仪器条件(1)、色谱条件岛津UFLC shimADZU色谱仪；进样量5 μ 1 ；色谱柱shimpack VP-ODS, 150mm*5 μ m ；流动相A体积比为0. 04%乙酸水溶液，B为体积比为0. 04%乙酸乙 腈溶液，柱温40°C，流速0. 25mL/min ；洗脱梯度为Omin = 5% B ；20min = 95% B ;20 25min = 95% B ;25· 1 !35min = 5% B。其中乙腈为色谱纯(Merck 公司，Germany)。(2)、质谱条件AB API 4000QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪。(3)、仪器参数离子源=Turbo V，电离模式ESI (+)、MRM 参数:DP = 40 ；EP = 10 ；Ql = Q3 时，CE = 5 ；Ql Φ Q3 时，CE = 30 ；CXP =10 ；CAD = High ；每对离子对扫描时间为5ms ；(5)、IDA参数离子流预值1000cpS，排除IOs内的目标离子；(6) ,EPI 参数:DP = 40 ；CEs = 15 ；CCE = 40 ；CAD = Hihg.3、100-1000每间隔0. 1-0. 3组成母离子0)1)等于子离子^!3)的离子对，
即 Ql = Q3(如 100/100,100. 1/100. 1......或 100/100，100. 2/100. 2.......或
100/100,100. 3/100. 3......)，按每个文件80对离子对组成不同的文件，以采集方式为
mrm-ida-epi进行跑样。4、对每个文件找出一级质谱母离子Ql在相应时间被裂解所对应的二级质谱子离 子Q3 (及其他二级质谱子离子Q4、Q5......)，峰保留时间(RT)。5、以多反应监测模式(MRM)对第四步所筛选出的离子对进行分四段跑样，每个文 件800对离子对。四段所跑样的离子对分别为140/220/220/220对，然后利用Analyst数 据处理软件的定量积分方法选出峰强度在lOOOcps以上的离子对。6、对第五步筛选出来的离子对再次以采集方式为MRM-IDA-EPI进行跑样，每个文
件80对离子对，进一步对一级质谱母离子Oil)，二级质谱子离子0)3、Q4......)，峰保留
时间进行核对校准，去卷积，从而建立二级质谱子离子(MS2T)及保留时间为标签代谢数据库。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果(1)高通量。通过质荷比步进扫描，结合MRM技术，可以同时检测出千种以上代谢 产物。如我们在在水稻发芽7 种子中共检测到1400多种代谢产物，在带壳穗子中共检测 到1200多种代谢产物，在剑叶中共检测到1600多种代谢产物，其中水溶性代谢产物有750 多种，如图1A-D，展示出所检测的部分代谢产物。(2)高灵敏度。利用MRM技术通过两级离子选择，排除了大量干扰离子，使质谱的 化学背景大大降低，目标检测物的信噪比显著提高，能够完成其他质谱扫描方式所达不到 的高灵敏度检测。如我们检测到大量含量在PPm级的物质，如图2，展示出所检测的部分代 谢产物。(3)准确度高，重现性好。利用MRM技术特异性，对符合设定的代谢产物进行检测， 并且进一步进行增强产物扫描分析(EPI)，得到高分辨的串联质谱(MS/MQ碎片数据，使分 析过程中的定性结果假阳性率大大降低，重现性提高。(4)对所研究的植物或组织建立二级质谱子离子(MS2T)及保留时间为标签代谢 数据库，方便检索，推动代谢组学的发展。(5)操作简单，具有广泛的适用性，可用于研究任何植物甚至是其他生物的任何组 织中的代谢产物，我们在番茄果实中检测也到2000多种代谢产物，其中水溶性代谢产物有 920多种，如图3A-E，展示出所检测的部分代谢产物。


图IA为一种利用本发明高通量鉴别水稻抽穗期剑叶水溶性次生代谢产物的结果 图。其峰强度在8. OX 103-9. 8X IO4Cps之间，展示出代谢产物1 种。图IB为一种利用本发明高通量鉴别水稻抽穗期剑叶水溶性次生代谢产物的结果 图。其峰强度在1. 9X 104-2. 3XlO5Cps之间，展示出代谢产物135种。图IC为一种利用本发明高通量鉴别水稻抽穗期剑叶水溶性次生代谢产物的结果 图。其峰强度在7. 6X 104-8. 5 XlO5Cps之间，展示出代谢产物巧4种。图ID为一种利用本发明高通量鉴别水稻抽穗期剑叶水溶性次生代谢产物的结果 图。其峰强度在1. 7X IO5-L 8 X IO6Cps之间，展示出代谢产物144种。图2为利用本发明高灵敏度鉴别水稻发芽7 种子水溶性次生代谢产物的结果 图。以Y -亚麻酸(红色箭头所指)为标样，浓度为4. 5ppm。图3A为证明利用本发明高效鉴别植物次生代谢产物广泛适用性结果图。其峰强度在6. OX 103-9. 8X IO4Cps之间，展示出代谢产物123种。图;3B为证明利用本发明高效鉴别植物次生代谢产物广泛适用性结果图。其强度在1. 9X 104-2. 5XlO5Cps之间，展示出代谢产物130种。
图3C为证明利用本发明高效鉴别植物次生代谢产物广泛适用性结果图。其强度在3. 2X104-3. 7XlO5Cps之间，展示出代谢产物136种。图3D为证明利用本发明高效鉴别植物次生代谢产物广泛适用性结果图。其强度在8X 104-8. 5 X IO5Cps之间，展示出代谢产物1 种。图3E为证明利用本发明高效鉴别植物次生代谢产物广泛适用性结果图。其强度在1. 4X IO5-L 4X IO6Cps之间，展示出代谢产物191种。
具体实施例方式实施例1 一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方法，其步骤是1、样品制备(1)取样。取明恢63及珍汕97抽穗期的剑叶各10片，装入预先扎过孔50ml的离
心管中，液氮保存。( 配制提取液。配制水溶性代谢产物提取液，Vmi Vilg= 100 0.04，V代表 体积。其中甲醇和乙酸为色谱纯试剂(TEDIA公司，America)。(3)称取14. 30g样品，在研钵中加液氮磨成粉状后加入预冻好的50ml离心管中， 立即按Ig 2ml加入提取液，强烈涡旋IOs后将样品放入4°C冰箱，每隔IOmin再涡旋一 次，重复3次后放入4°C冰箱过夜。(4)次日用4°C离心机IOOOOrpm离心IOmin后吸取上清，将上清氮吹吹干后再按 IOg Iml比例加入纯甲醇进行充分溶解。(5)用0. 22 μ m尼龙膜将溶解液过滤后得到约1. 4ml提取液，将提取液装入进样样 品管中，放-70 V冰箱保存，待测。2、仪器条件(1)、色谱条件岛津UFLC shimADZU色谱仪；进样量5 μ 1 ；色谱柱shimpack VP-ODSaSOmm^ym;流动相A为体积比为0. 04%乙酸水溶液，B为体积比为0. 04%乙酸 乙腈溶液，柱温40°C，流速0. 25mL/min ；洗脱梯度为Omin = 5% B ；20min = 95% B ;20 25min = 95% B ;25· 1 !35min = 5% B。其中乙腈为色谱纯(Merck 公司，Germany)。(2)、质谱条件AB API 4000QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪。(3)、仪器参数离子源=Turbo V，电离模式ESI (+)(4)、MRM 参数DP = 40 ；EP = 10 ;Q1 = Q3 时，CE = 5 ；Ql 乒 Q3 时，CE = 30 ；CXP =10 ；CAD = High ；每对离子对扫描时间为5ms ；(5)、IDA参数离子流预值1000cpS，排除IOs内的目标离子；(6)、EPI 参数:DP = 40 ；CEs = 15 ；CCE = 40 ；CAD = High.3、100-1000每间隔0. 3组成母离子0)1)等于子离子^!3)的离子对，即Ql =
Q3 (如 100. 1/100. 1，100. 4/100. 4，100. 7/100. 7......)，按每个文件 80 对离子对组成不同
的文件，以采集方式为MRM-IDA-EPI进行跑样。(请见表一)表一 100-1000每间隔0. 3组成母离子^!1)等于子离子^!3)的离子对对水稻剑 叶进行跑样
权利要求
1. 一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方法，其步骤是A、样品制备(1)取新鲜样品，液氮保存；(2)配制提取液水溶性代谢产物提取液为Vfs =V^ig =100:0. 04，V代表体积；脂溶性 代谢产物的提取液为Vlw =Vw =Viig =70:30:0. 04，V代表体积，其中甲醇和乙酸为色谱纯 试剂，氯仿为分析纯试剂；(3)称取样品，在研钵中加液氮磨成粉状后加入预冻好的离心管中，立即按lg:2ml加 入提取液，强烈涡旋IOs后将样品放入4°C冰箱，每隔IOmin再涡旋一次，重复3次后放入 4°C冰箱过夜；(4)次日用4°C离心机IOOOOrpm离心IOmin后吸取上清，将上清氮吹吹干后再按IOg Iml比例加入纯甲醇进行充分溶解；(5)用0.22 μ m尼龙膜将溶解液过滤后装入进样样品管，放-70°C冰箱保存，待测；B、仪器条件(1)、色谱条件岛津UFLCshimADZU色谱仪；进样量5μ 1 ；色谱柱shimpack VP-ODS, 150 mm *5 μ m ；流动相A为体积比为0. 04%乙酸水溶液，B为体积比0. 04%乙酸乙 腈溶液，柱温 40°C，流速 0. 25mL/min ；洗脱梯度为 Omin = 5%B ；20min = 95%B ；20 25min =95%B ；25. 1 35min=5%B，其中乙腈为色谱纯；(2)、质谱条件ABAPI 4000QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪；(3)、仪器参数离子源TurboV，电离模式ESI( + )；(4)、MRM参数:DP=40; EP=IO ;Q1=Q3 时，CE=5; Ql 乒 Q3 时，CE=30 ； CXP=IO ； CAD=High；每对离子对扫描时间为5ms ；(5)、IDA参数离子流预值lOOOcps，排除IOs内的目标离子；(6)、EPI参数:DP=40;CEs=15;CCE=40; CAD=Hihg ；C、100-1000每间隔0.1-0. 3组成母离子(Ql)等于子离子(Q3)的离子对，即Q1=Q3,按 每个文件80对离子对组成不同的文件，以采集方式为MRM-IDA-EPI进行跑样；D、对每个文件找出一级质谱母离子Ql在相应时间被裂解所对应的二级质谱子离子Q3 及二级质谱子离子Q4、Q5，峰保留时间(RT)；E、以多反应监测模式对(D)步骤所筛选出的离子对进行分四段跑样，每个文件800对 离子对，四段所跑样的离子对分别为140/220/220/220对，然后利用Analyst数据处理软件 的定量积分方法选出峰强度在lOOOcps以上的离子对；F、对(E)步骤筛选出来的离子对再次以采集方式为MRM-IDA-EPI进行跑样，每个文件 80对离子对，进一步对一级质谱母离子(Q1)，二级质谱子离子(Q3、Q4)，峰保留时间进行核 对校准，去卷积，建立二级质谱子离子及保留时间为标签代谢数据库。
全文摘要
本发明公开了一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方法，其步骤是首先是对样品进行Q1=Q3的质荷比步进扫描；其次是利用MRM(多反应监测模式)对第一步所产生的离子对进行分段跑样，找出有峰离子对，同时根据峰强度的大小进行去重；第三是利用MRM结合IDA再结合EPI对第二步找到的有峰离子对进行打碎跑样，进一步去重并最终确定离子对，同时对确定离子对进行存库。使用本方法，可以对植物不同组织的次生代谢产物进行高通量、高灵敏度鉴别。本方法操作简便，应用性强，对植物次生代谢产物的研究有着重大的意义。同时，可以利用该方法建立不同植物的次生代谢产物数据库，从而促进植物代谢组学的发展。
文档编号G01N30/02GK102128882SQ20101056242
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者李 东, 罗杰, 陈伟, 龚亮 申请人:华中农业大学