专利名称：稳定 gpcr 的功能构象状态的蛋白结合结构域及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及GPCR结构生物学和信号传导领域。具体而言，本发明涉及针对或能特异性结合G蛋白偶联受体(GPCR)的功能构象状态的蛋白结合结构域。更具体地，本发明提供能增强GPCR的功能构象状态的稳定性、特别是能增强活性构象状态的GPCR的稳定性的蛋白结合结构域。本发明的蛋白结合结构域可以用作对结合各种天然和合成配体的G蛋白偶联受体进行结构和功能表征的工具，以及用于以GPCR为目标的筛选和药物发现工作的工具。此外，本发明还包括这些蛋白结合结构域用于GPCR相关疾病的诊断、预后以及治疗的用途。
背景技术：
G蛋白偶联受体(GPCR)是人类基因组中最大的膜蛋白家族。它们在对一组多样性的配体的生理应答中发挥至关重要的作用，所述配体如生物胺、氨基酸、肽、蛋白、前列腺素、磷脂、脂肪酸、核苷、核苷酸、Ca2+离子、着嗅齐IJ、较苦和甜的促味齐IJ、信息素以及质子(Heilker et al.2009) XPCR是范围广泛疾病的治疗靶标。GPCR的特征在于，具有细胞外氨基末端和细胞内羧基末端的7个跨膜结构域，并且也称为七跨膜或七螺旋受体(Rosenbaumet al.2009)。视紫红质是高度专业化地有效检测光的GPCR，由于其在牛视网膜中的生化稳定性和天然丰度，其已经成为GPCR信号传导和结构生物学的范例(Hofmann et al.2009)。相比之下，许多GPCR通过调节多种G蛋白同种型的活性以及G蛋白非依赖性信号传导通路(如抑制蛋白)而表现出复杂的功能行为。在一些情况下，GPCR可以表现出针对特异性信号传导通路的基础活性，即使在缺少配体的情况下。作用于GPCR的正位配体能够对下游信号传导通路具有一系列作用。完全激动剂对受体的激活最大。部分激动剂即使在饱和浓度下也引发极限下刺激。反向激动剂抑制基础活性，尽管中性拮抗剂对基础活性没有影响，但是竞争性地阻断其他配体的结合。GPCR针对激素和神经递质的复杂行为可归因于它们的结构可塑性(Kobilka andDeupi, 2007)。来自功能和生物物理研究的证据表明，GPCR可以以多种功能上不同的构象状态存在(Kobilka and Deupi2007)。尽管这种结构可塑性和动态行为对于正常功能是必需的，但是其有助于它们的生化不稳定性和难以获得高分辨率晶体结构。迄今为止，已经报道了人 β 2AR(Rasmussen et al.2007; Rosenbaum et al.2007; Cherezov et al.2007;Hansonet al.2008)、鸟 β (ffarne et al.2008)以及人 A2 腺苷受体(Jaakola et al.2008)的晶体结构。尽管视紫红质可以由分离自天然组织的未修饰蛋白而结晶，但是这些其他GPCR需要在重组系统中表达、通过反向激动剂稳定非活性状态以及生化修饰，以稳定受体蛋白。β 2AR的第一晶体结构通过选择性Fab而稳定(Rasmussen et al.2007)。β 2AR的后继结构和A2腺苷受体在蛋白工程的帮助下获得:将T4溶菌酶插入最初针对β 2AR而描述的第三细胞内环(Rosenbaum et al.2007)。最后，由蛋白生长鸟β AR的晶体,所述蛋白通过氨基和羧基末端截短和第三细胞内环的缺失以及增强纯化蛋白的热稳定性的6氨基酸取代而改造(Warne et al.2008)。
获得GPCR活性状态的结构较难，因为这种状态相对不稳定。荧光寿命研究表明，在存在饱和浓度的完全激动剂时，P2AR在结构上是异质的(Ghanouni et al.2001)。这种结构异质性与晶体的形成不相容。β 2AR活性状态的稳定需要存在其同源G蛋白Gs，即腺苷酸环化酶的刺激蛋白(Yao et al.2009)。迄今为止，仅GPCR的活性状态结构是视蛋白的活性状态结构，即视紫红质的配体游离形式(Park et al.2008)。这些晶体在酸性pH(5.5)下生长，其中通过FTIR光谱，已经证明视蛋白与光激活的视紫红质(变视紫红质II)在结构上相似。尽管P2AR在pH降低时也表现出较高的基础活性，但其是生化不稳定的(Ghanouniet al.2000)。阐明与各种天然和合成配体和蛋白复合的GPCR的不同功能构象状态的结构，对于理解GPCR信号转导机制以及基于结构的药物发现努力都是有价值的。因此需要研发用于对GPCR的个体构象异构体进行高分辨率结构分析的新的简单工具。

发明内容
本发明的第一方面涉及能特异性结合GPCR的功能构象状态的蛋白结合结构域。根据优选的实施方案，所述蛋白结合结构域在结合后，能稳定GPCR的功能构象状态。优选地，所述蛋白结合结构域能在结合后诱导GPCR的功能构象状态。根据另一优选的实施方案，所述GPCR的功能构象状态选自基础构象状态或活性构象状态或非活性构象状态。优选地，所述GPCR的功能构象状态是活性构象状态。根据另一优选的实施方案，所述蛋白结合结构域能特异性结合与激动剂结合的GPCR和/或增强GPCR对激动剂的亲和性。根据另一优选的实施方案，所述蛋白结合结构域在结合后能增强GPCR的功能构象状态的热稳定性。在具体实施方案中，所述蛋白结合结构域能特异性结合所述GPCR的功能构象状态的构象表位。优选地，所述构象表位是细胞内表位。更优选地，所述构象表位包含于用于下游信号传导蛋白的结合位点中。最优选地，所述构象表位包含于G蛋白结合位点中。优选地，本发明的蛋白结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补决定区或其任何合适的片段。更优选地，所述蛋白结合结构域来源于骆驼抗体(camelid antibody)。最优选地,所述蛋白结合结构域包含纳米抗体序列或其任何合适的片段。例如，所述纳米抗体包含选自SEQ ID NO: 1-29的序列或其任何合适的片段。根据另一优选的实施方案，所述GPCR是哺乳动物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆虫蛋白。所述哺乳动物蛋白可以是人蛋白。特别是，所述GPCR选自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR视紫红质家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCR Frizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。具体而言，所述GPCR是肾上腺素能受体，如α -肾上腺素能受体或β -肾上腺素能受体,或其中所述GPCR是毒蕈碱受体,如Ml毒蕈碱受体M2毒蕈碱受体或M3毒蕈碱受体或Μ4毒蕈碱受体或Μ5毒蕈碱受体,或其中所述GPCR是血管紧张素受体，如血管紧张素IIl型受体或血管紧张素112型受体。本发明的第二方面涉及复合体，所述复合体包含(i)本发明的蛋白结合结构域，
(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体。所述受体配体可以选自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体或其任何合适的片段。所述复合体也可以采用溶解形式或固定化于固相支持物。特别是，所述复合体是晶体。本发明还包括晶体形式的复合体，其包含(i)蛋白结合结构域，( )功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体，其中所述晶体形式通过使用本发明的蛋白结合结构域而获得。本发明的第三方面涉及包含本发明的蛋白结合结构域和/或本发明的复合体的细胞组合物。优选地，包含于细胞组合物中的蛋白结合结构域在GPCR结合所述蛋白结合结构域后能稳定和/或诱导其功能构象状态。本发明的第四方面涉及本发明的蛋白结合结构域或本发明的复合体或本发明的细胞组合物用于稳定和/或诱导GPCR的功能构象状态的用途。根据一优选的实施方案，所述蛋白结合结构域或所述复合体或所述细胞组合物可以用于使功能构象状态的GPCR的结构结晶和/或溶解。本发明还包括测定功能构象状态的GPCR的晶体结构的方法，所述方法包括以下步骤:⑴提供本发明的蛋白结合结构域、靶GPCR以及任选存在的受体配体，和(ii)形成蛋白结合结构域、GPCR以及任选存在的受体配体的复合体，以及(iii)使步骤(ii)的所述复合体结晶，从而形成晶体，其中测定功能构象状态的GPCR的晶体结构。上述测定GPCR晶体结构的方法还可以包括获得晶体的原子坐标的步骤。根据另一优选 的实施方案，所述蛋白结合结构域或所述细胞组合物，可以用于捕获功能构象状态的GPCR，任选地与受体配体或与一个或多个下游信号传导蛋白一起。本发明因此还包括捕获功能构象状态的GPCR的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供本发明的蛋白结合结构域和靶GPCR，以及(ii)形成蛋白结合结构域与GPCR的复合体，其中捕获功能构象状态的GPCR。此外，本发明还包括捕获功能构象状态的GPCR的方法，所述方法包括以下步骤:(i)将含有多种构象状态的GPCR的溶液应用于具有固定化的本发明的蛋白结合结构域的固相支持物，和(ii)形成蛋白结合结构域与GPCR的复合体，以及(iii)除去弱结合或未结合的分子，其中，捕获功能构象状态的GPCR。上述捕获功能构象状态的GPCR的方法可以包括纯化所述复合体的步骤。根据另一优选的实施方案，本发明还涉及本发明的蛋白结合结构域或复合体或细胞组合物在GPCR的构象特异性(药物)化合物或配体的筛选和/或鉴定程序中的用途。本发明因此还包括鉴定能结合GPCR的功能构象状态的化合物的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供本发明的GPCR和蛋白结合结构域，和(ii)提供测试化合物，和(iii)评估测试化合物是否结合GPCR的功能构象状态，以及(iv)选择结合GPCR的功能构象状态的化合物。优选地，上述用于鉴定化合物的方法还包括形成复合体的步骤，所述复合体包含本发明的蛋白结合结构域和功能构象状态的GPCR。所述复合体还包含受体配体，所述受体配体可以选自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体或其任何合适的片段。优选地，所述受体配体是完全激动剂或部分激动剂或反向激动剂或拮抗剂。优选地，所述蛋白结合结构域和/或所述复合体以基本上纯化的形式提供。可选地，所述蛋白结合结构域和/或所述复合体以溶解的形式提供。可选地，所述蛋白结合结构域和/或所述复合体固定化于固相支持物。可选地，所述蛋白结合结构域和/或复合体以细胞组合物形式提供。根据另一优选的实施方案，用于上述用来鉴定化合物的方法的测试化合物选自多肽、肽、小分子、天然产物、肽模拟物、核酸、脂质、脂肽、碳水化合物，抗体或其来源的任何片段,如Fab、Fab’和F (ab') 2, Fd、单链Fv (scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv (dsFv)和包含VL或VH结构域的片段,重链抗体(hcAb)、单结构域抗体(sdAb)、微型抗体(minibody)、来源于骆驼重链抗体的可变结构域(VHH或纳米抗体)、来源于鲨鱼抗体的新抗原受体的可变结构域(VNAR)、包括α体(alpha body)的蛋白支架、蛋白A、蛋白G、设计的锚蛋白重复结构域(DARPins)、纤连蛋白III型重复、抗运载蛋白、打结素(knottin)、工程化CH2结构域(纳米抗体)。优选地，标记所述测试化合物。此外可以使用测试化合物库。此外，上述鉴定化合物的方法可以是高通量筛选方法。根据另一具体实施方案，所有本发明的蛋白结合结构域或复合体或细胞组合物都可以用于诊断或预后GPCR相关疾病，如癌症、自身免疫病，传染病、神经病、心血管疾病。本发明的第五方面涉及包含治疗有效量的本发明的蛋白结合结构域和至少一种药学上可接受载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。本发明的第六方面涉及本发明的蛋白结合结构域或本发明的药物组合物调节GPCR信号传导活性、更具体而言阻断G蛋白介导的信号传导的用途。本发明的蛋白结合结构域或药物组合物还可以用于治疗GPCR相关疾病，如癌症、自身免疫病、传染病、神经病、心血管疾病。本发明的第七方面涉及包含本发明的蛋白结合结构域或本发明的复合体或本发明的细胞组合物的试剂盒。根据本文的进一步公开，本发明的氨基酸序列和多肽的其他应用和用途将会变得显而易见。附图简述

图1.P2AR特异性纳米抗体结合并稳定受体的活性状态。(a)NbSO的尺寸排阻层析(SEC)的代表性踪迹。在利用FPLC进行分析之前，将结合激动剂W2AR激动剂)的纯化的β2ΑΚ(20μΜ)在具有和不具有40μΜ Nb80(分别为黑色和蓝色)的情况下在室温下孵育2hr (小时)。在存在NbSO的情况下，β 2AR激动剂洗脱峰的UV吸光度(280nm)增加，且以比单独的β 2AR激动剂更早的体积洗脱，同时Nb80洗脱峰(绿色)降低，这表明β 2AR-激动剂-Nb80复合体形成。孵育结合反向激动剂的β 2AR(20 μ Μ)与Nb80 (红色)，与β 2AR-激动剂-Nb80复合体相比，导致较小的位移和UV吸光度较小的增加。(b)表达β 2AR的Sf9昆虫细胞膜的剂量应答竞争结合实验。将通过SEC结合β 2AR的7种纳米抗体与表达β 2AR的膜一起在室温下单独孵育90min(分钟)。所有7种纳米抗体都增强了 P2AR对(-)_异丙肾上腺素的亲和性(表3)。选择Nb80(蓝色)作为引导纳米抗体。数据表示一式三份进行的2个独立实验的平均值土s.e。(c)利用mono-bromo bimane (mBBr)标记的纯化受体进行的基于突光的功能测定表明，与缺少Nb80 (黑色)时的受体相比，I μ M Nb80 (蓝色)稳定β 2AR的更具活性的状态(结合完全激动剂(-)_异丙肾上腺素)。活性状态的特征是，猝灭mBBr荧光和mBBr荧光红移(Yao et al.，2009)。图2.代表性斑点印迹显示了纳米抗体对β #三级结构的特异性。(a)将等量的结合激动剂的天然或SDS变性的纯化β 2AR(分别为顶部和中部)或结合反向激动剂的天然P2AR(底部)一式三份点涂于硝酸纤维素带上。将所述带用在具有0.05%Tween-20的PBS (pH7.4)中的5%脱脂奶粉封闭，然后与lmg/ml在封闭缓冲液中稀释的所述纳米抗体一起孵育。用抗组氨酸(a-6His)小鼠一抗随后与山羊抗小鼠IR-800标记的二抗一起孵育，检测纳米抗体的结合。Ml抗体识别线性FLAG表位，将其用Alexa-688进行标记，并直接检测β 2AR。利用奥德赛红外线成像系统(Odyssey Infrared ImagingSystem, L1-cor Biosciences)扫描斑点印迹并使之成像。因为两种不同的通道(分别为800nm对700nm)用于成像，因此通过Ml从检测β 2AR的印迹分别处理检测纳米抗体的印迹；因此不能直接比较并定量印迹(即纳米抗体的结合与Ml结合的比较本质上是定性的)。(b)代表性斑点印迹显示了与天然折叠的β 2AR结合降低的纳米抗体。图3.纳米抗体与受体活性状态的选择性结合在通过尺寸排阻层析进行分析之前，将纯化的结合激动剂的β2ΑΙ (20μΜ)在具有或不具有40 μ M纳米 抗体(分别为黑色和蓝色)的情况下在室温下孵育2hr。还分析存在纳米抗体时(红色)结合反向激动剂的P2AR样品(20 μ M)。在存在7种纳米抗体(Nb72、Nb65、Nb71、Nb69、Nb67以及Nb84)时，β 2AR激动剂洗脱峰的UV吸光度(280nm)增加了，并且以比单独的P2AR激动剂(蓝色)更早的体积洗脱(黑线)，同时NbSO洗脱峰(绿色)降低，这表明β 2AR-激动剂-Nb80复合体形成。未观察到β 2AR-反向激动剂-Nb80复合体的形成(红线)。图4.纳米抗体与受体活性状态的选择性结合在通过尺寸排阻层析进行分析之前，将纯化的结合激动剂的β2ΑΙ (20μΜ)在具有和不具有40 μ M纳米抗体(分别为黑色和蓝色)的情况下在室温下孵育2hr。图5.荧光发射谱表明，纳米抗体诱导bimane标记的β2AR的构象变化。增强P2AR的激动剂结合亲和性的纳米抗体稳定受体的活性状态。利用mono-bromo bimane (mBBr)标记的纯化受体进行的基于突光的功能测定表明，I μ M纳米抗体65、67、69、71、72以及84(红色)，当与缺少纳米抗体的受体(黑色)相比时，稳定i32AR(结合完全激动剂异丙肾上腺素)的更具活性的状态。这种活性状态的特征是，猝灭mBBr 荧光和 mBBr 荧光红移(Yao et al., 2009)。图6.Nb80对β 2AR结构和功能的影响(a)该示意图说明，在导致在图6b_c中所观察的荧光降低的受体激活过程中，在TM6的细胞质端连接于Cys2 6 5 6 27的环境敏感性Bimane探针从更埋入的疏水环境向更极性的溶剂暴露的位置移动。
(b)-(c)荧光发射谱显示，在缺少(黑色实线)或存在完全激动剂异丙肾上腺素(ISO,绿色宽虚线)、反向激动剂IC1-118，551 (ICI，黑色虚线)、GS异三聚体(红色实线)、纳米抗体_80(Nb80，蓝色实线)以及，Gs与ISO的组合(红色宽虚线)、Nb80与ISO的组合(蓝色宽虚线)及Nb80与ICI的组合(蓝色虚线)时，重构成高密度的脂蛋白颗粒(mBB-132AR/HDL)的
mono-bromo bimane
标记的P2AR的配体诱导的构象变化。(d) - (f) d，在缺少或存在GTP Y S的情况下，与[3H] - 二氢阿普洛尔([3H] -DHA)竞争用Gs异三聚体重构的β 2AR/HDL的ISO的配体结合曲线；e，在缺少或存在Nb80的情况下，与[3H]-二氢阿普洛尔([3H]-DHA)竞争i32AR/HDL的ISO的配体结合曲线；以及f，在缺少或存在Nb80的情况下，与[3H]- 二氢阿普洛尔([3H]-DHA)竞争β 2AR-T4L/HDL的ISO的配体结合曲线。误差棒表示标准差。图7.激动剂-β 2AR-T4L_Nb80复合体在脂质立方相中所形成的晶体中的包装i32AR、Nb80以及激动剂结构的不同视图，分别以橙色、蓝色和绿色表示。由于拙劣的电子密度，T4溶菌酶(T4L)不能被建模。其可能的位置用浅蓝色圆表示，黑色虚线连接于TM5和TM6的细胞内端,在那儿其融合于β 2AR_T4L构建体中。PyMOL(http://www.pymol.0rg)用于制备所有附图。图8.反向激动剂和激动剂_Nb80稳定的P2AR.的晶体结构的比较反向激动剂卡拉洛尔结合的02AR_T4L(P2AR-Cz)的结构以蓝色显示，卡拉洛尔以黄色显示。激动剂结合的和Nb80稳定的i32AR-T4L(i32AR-Nb80)的结构以橙色显示，激动剂以绿色显示。利用Pymol比对功能，比对这两个结构。(a)叠加结构的侧视图，其显示受体的细胞内和G蛋白面对部分的明显结构变化。(b)侧视图遵循在纵轴上进行90度旋转。(c)细胞外配体结合结构域的比较表现出适度的结构变化。图9.与非活性^2AR和视蛋白结构相比，Nb80无奈的细胞内结构域。(a)具有Nb80的⑶R的β 2AR(橙色)与受体相互作用的侧视图，⑶Rl:淡蓝色，⑶R3:蓝色。(b)聚焦进入β 2AR的⑶Rl和3的近端视图(closer view)。显示了 4 A⑶R内TM3、5、6以及7的侧链。较大的⑶R3刺入受体13 A 〔C)从细胞内侧观察的⑶Rl与CDR3的相互作用。(d)激动剂结合的和Nb80稳定的02AR-T4L(02AR-Nb8O)与β 2AR_T4L的卡拉洛尔结合的非活性结构(P2AR-Cz)叠加。TM3中DRY基元的Asp3.49与Arg3.50之间的离子锁相互作用，在P2AR-Nb80结构中被打破。TM6的细胞内端向外移动并离开受体的核心。箭头表示在P2AR-Cz和P2AR-Nb80的结构中，Glu6.30的α-碳之间距离的
11.4 A变化。ΤΜ3和ΤΜ7的细胞内端向核心分别移动了 4 A和2.5 Α，而ΤΜ5向外移动了6Α。(e) P2AR-Nb80结构与与Gt (转导蛋白)的C末端肽一起结晶的视蛋白的结构叠加。图10.与视蛋白结构相比，Nb80稳定β 2AR的细胞内结构域。(a) ^2AR与Nb80之间的相互作用。(b)视蛋白与转导蛋白羧基末端肽之间的相互作用。图11.在激动剂结合后，跨膜节段包装相互作用的重排(a)在 TM5 中的 Pro211、TM3 中的 Ilel21、TM6 中的 Phe282 以及 TM5 中的 Asn316之间观察到稳定非活性状态的包装相互作用。(b)在激动剂结合后TM5的向内运动干扰Ilel21和Pro211的包装，导致Ilel21与Phe282之间相互作用的重排。这些变化有助于TM6的旋转和向外运动以及TM7的向内运动。图12.针对P2AR而产生的不同纳米抗体的氨基酸序列已经利用标准软件工具对序列进行了比对，已经根据MGT编号(Lefranc etal.，2003)定义了 CDR。图13.Nb80对β 2AR受体热稳定性的影响在存在和缺少NbSO的情下，去污剂增溶的(DDM)激动剂结合(异丙肾上腺素)β 2AR的熔解曲线的比较。无Nb80时β 2AR的表观熔解温度为12.0° C。在具有Nb80的情况下，β 2AR的表观熔解温度为24° C。图14.Nb80对温度的影响诱导β 2AR受体聚集A.在存在NbSO或异丙肾上腺素的情况下，将去污剂增溶的(DDM) β 2AR于50° C下加热10分钟，并利用SEC分析受体的聚集。B.在存在NbSO时，异丙肾上腺素结合受体的温度依赖性。图15.Nb80对β 2AR结合反向激动剂IC1-118，551具有很少的影响将β 2AR或β 2AR-T4L重构成HDL颗粒，并在缺少或存在Nb80的情况下，进行激动剂竞争结合实验。a:在存在和缺少Nb80的情况下，与[3H]-二氢阿普洛尔([3H]-DHA)竞争i32AR/HDL的反向激动剂IC1-118551的配体结合曲线，b，在存在和缺少Nb80的情况下，与与[3H]-二氢阿普洛尔([3H]-DHA)竞争i32AR-T4L/HDL的反向激动剂IC1-118551的配体结合曲线。图16.Nb80增强激动剂的β 2AR亲和性，但是不增强拮抗剂的β 2AR亲和性。

在存在和缺少NbSO的情况下，对含有全长β 2AR的商业昆虫细胞来源的膜进行竞争性配体结合实验。在存在NbSO和两个代表性激动剂(异丙肾上腺素，丙卡特罗)与两个代表性拮抗剂(IC1-118，551和卡维地洛)的不相关纳米抗体(Irr Nb)的情况下的剂量依赖性放射性配体位移曲线。图17:人β IAR和人β 2AR的序列比对突出显示了在β 2AR-Nb80界面中与Nb80相互作用的β 2肾上腺素能受体的氨基酸。图18:Nb80选择性结合人β iAR受体的活性构象与[3H]- 二氢阿普洛尔([3H]_DHA)竞争的激动剂和反向激动剂的配体结合曲线。A)在存在和缺少Nb80时，激动剂异丙肾上腺素(ISO)结合i32AR。B)在存在和缺少Nb80时，反向激动剂IC1-118，551(ICI)结合^2AR0 C)在存在和缺少NbSO时，激动剂异丙肾上腺素(ISO)结合β AR。D)在存在和缺少Nb80时，反向激动剂CGP20712A(CPG)结合β 0发明详述定义将针对具体实施方案并参考某些附图对本发明进行描述，但是本发明并非限于此，而是仅仅受到权利要求的限制。权利要求中的任何附图标记不应当解释为限制范围。所述附图仅仅是示意性的，并且非限制性的。在附图中，一些元素的大小可以放大，且并非按说明目的的比例绘制。当术语“包含”用于说明书和权利要求中时，其不排斥其他元素或步骤。当提及单数名词使用了不定冠词或的定冠词如"一个(a)"或"(an)"、"所述(the)"时，除非另有明确说明，否则这包括所述名词的复数。此外，在说明书和权利要求书中术语第一、第二、第三等用于区分相似的元素，且未必用于描述相继顺序或时间顺序。应当理解至IJ，如此使用的术语在适当的情形下可以互换，并且本文所述的本发明的实施方案能以除了本文所述或说明的顺序之外的其他顺序运行。除非本文另有定义，否则用于本发明的科技术语和短语，应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，本文所述分子和细胞生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交技术和用于所述技术中的术语，都是用于本领域公知和常用的技术和术语。除非另有说明，否则，通常根据本领域公知且在各种通用且更具体的参考文献中所述的常规方法进行，所述参考文献在本说明书中做了引用和讨论。参阅例如Sambrook et al.MolecularCloning:A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.(1989);Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to2002)。术语〃蛋白结合结构域〃通常指能利用特异性分子间相互作用结合蛋白或肽的任何非天然存在的分子或其部分。多种分子都可以发挥蛋白结合结构域的功能，包括但不限于蛋白质分子(蛋白、肽、肽样或含有蛋白的分子)、核酸分子(核酸、核酸样或含有核酸的分子)以及碳水化合物分子(碳水化合物、碳水化合物样、含有碳水化合物的分子)。在本说明书中可以进一步发现更详细的描述。本文所用术语〃多肽〃、〃蛋白〃、“肽”在本文中可互换使用，并指任何长度的氨基酸的多聚体形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生化修饰的或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽主链的多肽。本文所用术语“多蛋白复合体”或“蛋白复合体”或仅仅“复合体”指一组两个或更多个相关的多肽链。蛋白复合体中的蛋白，通过非共价蛋白-蛋白相互作用而连接。“四级结构”是蛋白复合体中相关折叠蛋白的结构排列。“多聚体复合体(multimeric complex)”指本文所定义的蛋白复合体，其还可以包含非蛋白分子。本文所用术语〃核酸分子〃、〃多核苷酸〃，“多核酸(polynucleic acid) ”、“核酸”可互换使用，指任何长度的多聚体形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能，已知的或未知的。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、调控区、分离的任何序列的RNA、核酸探针以及引物。核酸分子可以是线性的或环状的。本文所用术语〃配体〃或“受体配体”表示在细胞内或细胞外特异性结合GPCR的分子。配体可以是但不限于蛋白、(聚)肽、脂质、小分子、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物、抗体或抗体片段，如纳米抗体(都如本文所定义)。配体可以是合成的或天然存在的。配体还可以包括"天然配体〃，天然配体是天然GPCR的内源性、天然配体的配体。"调节剂〃是当与在细胞中表达的GPCR接触如结合时，增强或降低GPCR的信号传导活性(即通过细胞内应答)的配体。该术语包括激动剂、完全激动剂、部分激动剂、反向激动剂以及拮抗剂，其更详细的描述可进一步见于本说明书中。术语蛋白的〃构象〃或〃构象状态〃通常指蛋白在任何情况下可能适时采用的结构范围。本领域技术人员应当认识到，构象或者构象状态的决定因素包括蛋白的氨基酸序列(包括修饰的氨基酸)所反映的蛋白的一级结构和蛋白周围的环境。蛋白的构象或构象状态还涉及结构特征，如蛋白二级结构(如α-螺旋、β_折叠等)、三级结构(如多肽链的三维折叠)以及四级结构(如多肽链与其他蛋白亚基的相互作用)。多肽链的翻译后修饰和其他修饰，如配体结合、磷酸化、硫酸化、糖基化或连接疏水基团等，可以影响蛋白的构象。此外，环境因素，如周围溶液的pH、盐浓度、离子强度和摩尔渗透压浓度，以及与其他蛋白和辅因子的相互作用等，可以影响蛋白的构象。蛋白的构象状态可以由活性功能测定或结合另一分子或借助物理方法如X射线晶体学、NMR或自旋标记等其他方法测定。有关蛋白构象和构象状态的一般讨论，参考 Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry, Part1: The Conformation of Biological.Macromolecules,.W.H.Freeman and Company, 1980，和 Creighton，Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H.Freeman andCompany, 1993。“特异性构象状态”是蛋白可能采用的构象或构象状态范围的任何子集。本文所用的“功能构象”或“功能构象状态”指这样一个事实，即蛋白具有具有拥有动态活性范围的的不同构象状态，特别是从无活性到最大活性。应当明确的是，意欲“功能构象状态”涵盖GPCR的任何构象状态，具有任何活性，包括无活性；并且并非意图其涵盖蛋白的变性状态。在抗体语境中，本文所用术语〃互补决定区〃或〃⑶R 〃指H(重)或L(轻)链(也分别简称为VH和VL)的可变区，并且含有能特异性结合抗原性靶标的氨基酸序列。这些CDR区负责抗体对具体抗原性决定子结构的基本特异性。这类区域也称为〃高变区"。CDR代表可变区内非连续的氨基酸序列，但是不管种类如何，据发现，可变的重链和轻链区内这些关键氨基酸序列的位置定位在可变链的氨基酸序列中具有相似的定位。所有标准抗体的可变重链和轻链每个都具有3个CDR区，对于各自轻(L)和重(H)链，每个CDR区域与其他的(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)都是不连续的。特别是，纳米抗体通常包含单个氨基酸链，其可以被认为包含4个“构架序列或区域”或FR和3个“互补决定区”或⑶R。纳米抗体具有3个⑶R区域，每个与其他的(称为⑶R1XDR2、⑶R3)都是非连续的。FR和⑶R序列的描述，基于V结构域和V样结构域的IMGT独特的编号系统(Lefranc et al.2003)。本文所用“表位”指多肽的抗原决定簇。在空间构象中，表位可能包含3个氨基酸，这对于其他表位来说是独特的。通常，表位由至少4、5、6、7个此类氨基酸组成，更通常由至少8、9、10个此类氨基酸组成。测定氨基酸空间构象的方法，在本领域中时已知的，并且包括例如X射线晶体学和2维核磁共振。本文所用“构象表位”指在对于多肽的折叠的3维构象是独特的空间构象中包含氨基酸的表位。通常构象表位由线性序列中不连续的氨基酸组成，其在蛋白的折叠结构中集合在一起。然而，构象表位也可以由这样的线性氨基酸序列组成，即其采用对于多肽的折叠的3维构象是独特(且不存在于变性的状态中)的构象。在多蛋白复合体中，构象表位由一个或多个多肽的线性序列中不连续的氨基酸组成，这些氨基酸在不同的折叠的多肽发生折叠后，它们在独特的四级结构中相关联，集合在一起。同样，在本文中构象表位也可以由一个或多个多肽的线性氨基酸序列组成，所述多肽集合在一起并采用对于四级结构是独特的构象。本文所用术语"特异性"指蛋白结合结构域特别是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段如纳米抗体与不同的抗原相比优先结合一个抗原的能力，并且未必意味着高亲和性。本文所用术语"亲和性"指蛋白结合结构域特别是免疫球蛋白如抗体或免疫球蛋白片段如纳米抗体结合抗原的程度，以改变抗原和蛋白结合结构域与存在它们的结合所形成的复合体的平衡。因此，例如，如果抗原和抗体(片段)以相对相同的浓度混合，则高亲和性抗体(片段)会结合可用的抗原，以改变向所得的高浓度复合体的平衡。解离常数通常用于描述蛋白结合结构域与抗原靶标之间的亲和性。通常，解离常数低于10_5m。优选地，解离常数低于10_6M，更优选地，低于10_7M。最优选地，解离常数低于10_8M。本文所用术语〃特异性结合(specifically bind) 〃和〃特异性结合(specificbinding)"通常指蛋白结合结构域特别是免疫球蛋白如抗体或免疫球蛋白片段如纳米抗体优先结合存在于不同抗原的均质混合物中的具体抗原的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用，会区分样品中合适的和不合适的抗原，在一些实施方案中，多于约10-100倍或更多(如多于约1000或10，000倍)。在GPCR构象状态谱的语境中，所述术语特别指与另一构象状态相比，蛋白结合结构域(如本文所定义)优先识别和/或GPCR的结合具体构象状态的能力。例如，活性状态选择性蛋白结合结构域会优先结合活性构象状态的GPCR，并且不会或者会以较小程度结合非活性构象状态的GPCR，因此对于所述活性构象状态具有更高的亲和性。所述术语“特异性结合”、“选择性结合”、”优先结合”及其语法等同体在本文中可互换使用。所述术语“构象特异性”或“构象选择性”在本文中也可互换使用。本文所用“抗原”表示能在动物中诱发免疫应答的分子。在GPCR的构象状态谱的语境中，所述分子在具体构象状态中包含在另一构象状态中不形成或更难以形成的GPCR构象表位。"缺失"在本文中定义为氨基酸或核苷酸序列中的变化，在所述序列中，与亲本多肽或核酸的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分别缺少一个或多个氨基酸或核苷酸残基。在蛋白语境中，缺失可以涉及约2、约5、约10、高达约20、高达约30或高达约50个或更多个氨基酸的缺失。蛋白或其片段可以含有多于一个缺失。在GPCR的语境中，缺失也可以是环缺失或N-和/或C末端缺失。〃插入〃或〃添加〃是指氨基酸或核苷酸序列的变化，与亲本蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列相比，其分别导致一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加。"插入"通常指在多肽的氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基，而“添加”可以是插入或指在N-或C末端或者两端添加的氨基酸残基。在蛋白或去片段的语境中，插入或添加通常为约1、约3、约
5、约10、高达约20、高达约30或高达约50或更多个氨基酸。蛋白或其片段可以含有多于一个插入。本文所用"取代〃，与亲本蛋白或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分别由不同的氨基酸或核苷酸取代一个或多个氨基酸或核苷酸所致。应当理解到，蛋白或其片段可以具有实质上对蛋白活性不具有影响的保守氨基酸取代。保守取代是既定组合，如 gly，ala ；val, ile, leu, met ；asp, glu ；asn, gin ；ser, thr ；lys, arg ；cys, met ；以及phe，tyr, trpD本文所用“晶体”或“晶体结构”指固体材料，其组成性原子、分子或离子以在所有3个空间维度上延伸的有序重复模式排列。由流体或由溶解于流体中的材料形成晶体结构的过程经常称为“结晶”或“晶体发生”。蛋白晶体经常生长于溶液中。最常见的放法是逐步降低其组成分子的溶解性。溶液中晶体生长的特征以2个步骤为特征:纤维微晶的成核作用(可能仅具有100个分子)，随后理想的是微晶生长成衍射质量的晶体。
本文所用“X射线晶体学”是测定晶体内原子排列的方法，其中X射线束攻击晶体并衍射成许多具体方向。根据这些衍射光束的角度和强度，检晶器可以产生晶体内电子强度的三维图像。根据所述电子强度，可以测定原子在晶体中的位置以及它们的化学键、它们的无序以及各种其他信息。本文所用术语“原子坐标”指分子结构中原子的一组三维坐标。在一实施方案中，利用X射线晶体学根据生物物理学领域普通技术人员熟知的方法，获得原子坐标。简而言之，X射线衍射图可以通过使X射线脱离晶体产生衍射而获得。衍射数据用于计算包含晶体的晶胞的电子密度图；所述图用于建立在晶胞中原子的位置(即原子坐标)。本领域技术人员应当理解，利用X射线晶体所测定的一组结构坐标含有标准误差。在其他实施方案中，原子坐标可以利用其他实验物理结构测定方法获得，所述方法可以包括电子衍射(也称为电子晶体学)和核磁共振(NMR)方法。还在其他实施方案中，原子坐标可以利用分子建模工具获得，所述工具可以基于一个或多个从头开始的蛋白折叠算法、能量最小化以及基于同源性建模。这些技术对于生物物理学和生物信息学的普通技术人员而言是熟知的。本文所用“解析结构”指测定原子的排列或蛋白的原子坐标，其经常利用诸如X射线晶体学的生物物理学方法进行。本文所用术语“化合物”或“测试化合物”或“候选化合物”或“药物候选化合物”描述在测定如筛选测定或药物发现测定中测试的天然存在的或合成的任何分子。因此，这些化合物包含有机或无极化合物。所述化合物包括以低分子量为特征的多肽、脂质或激素类似物。其他生物多聚有机测试化合物包括包含约2至约40个氨基酸的小肽或肽样分子(肽模拟物)和包含约40至约500个氨基酸的较大的多肽如抗体、抗体片段或抗体缀合物。测试化合物也可以是蛋白支架。为了高通量目的，可以使用测试化合物库，如提供足够范围的多样性的组合或随机化文库。实例包括但不限于天然化合物文库、变构化合物文库、肽文库、抗体片段文库、合成化合物文库、基于片段的文库、噬菌体展示文库等。更详细的描述还可以进一步见于说明书中。本文所用术语“测定” (determining)、“测量”、“评估”、“监测”以及“测定(assaying) ”在本文中可互换使用，包括定量和定性测定。有关GPCR的术语〃生物学活性〃指示具有天然存在的GPCR的生化功能(如结合功能、信号转导功能或由于配体结合而改变构象的能力的GPCR。本文所用术语〃治疗有效量"、〃治疗有效剂量〃和〃有效量〃表示实现期望的一个或多个结果所需的量。本文所用术语〃药学上可接受的〃表示非生物学或其他方面不期望的材料，即可以将所述材料与所述化合物一起给予个体，而不引起任何不期望的生物影响或以有害方式与含有所述材料的药物组合物中的任何其他组分相互作用。详细描述GPCR的结构信息会提供与信号从受体转移到细胞内相互作用蛋白(G蛋白、β -抑制蛋白等)有关的结构、功能和生物信息变化的洞见，并且会描绘干扰这些药理上相关的相互作用的方式。因此，获得并晶体化GPCR的努力非常重要。然而，由于用GPCR工作的生化挑战和这些复合体在去污剂溶液中的固有不稳定性，这是非常困难的企图。同时，仅仅GPCR固有的构象韧性就使得GPCR的高分辨率结构分析复杂化，因为生长衍射质量晶体需要稳定的构象上均质的蛋白(Kobilka et al.2007)。本发明提供了捕获或“冷冻”目的GPCR的功能构象状态、特别是其活性构象状态的实验和分析工具，从而允许对GPCR进行结构和功能分析，包括高分辨率结构分析和由其衍生的许多其他应用。本发明的第一方面涉及能特异性结合GPCR的功能构象状态的蛋白结合结构域。本发明的蛋白结合结构域可以是能特异性结合靶GPCR的功能构象状态的任何非天然存在的分子或其一部分(如上文所定义)。在优选的实施方案中，本文所述的蛋白结合结构域是蛋白支架。术语"蛋白支架"通常指形成结构、特别是蛋白或肽结构的折叠单位，所述结构包含用于另一分子例如蛋白结合的构架(参阅例如Skerra，J.2000，供参考)。蛋白结合结构域可以来源于天然存在的分子，例如来源于固有或适应性免疫系统组分，或其可以完全是人工设计的。蛋白结合结构域可以是基于免疫球蛋白的，或其可以基于存在于蛋白中的结构域，包括但不限于微生物蛋白、蛋白酶抑制剂、毒素、纤连蛋白、脂钙蛋白、单链反平行卷曲螺旋蛋白或重复基元蛋白。本领域已知的蛋白结合结构域的实例包括但不限于:抗体、重链抗体(hcAb)、单结构域抗体(sdAb)、微型抗体、来源于骆驼重链抗体的可变结构域(VHH或纳米抗体)、来源于鲨鱼抗体的新抗原受体的可变结构域(VNAR)，α体、蛋白Α、蛋白G、设计的锚蛋白重复结构域(DARPins)、纤连蛋白III型重复、抗运载蛋白(anticalin),打结素、工程化CH2结构域(纳米抗体)、肽和蛋白、脂肽(如pepducin)、DNA以及 RNA (参见例如 Gebauer&Skerra, 2009; Skerra, 2000; Starovasnik et al., 1997; Binzet al., 2004;Koide et al., 1998;Dimitrov, 2009;Nygren et al.2008;W02010066740)。经常，当利用选择方法产生具体类型的蛋白结合结构域时，用包含共有序列或构架序列的组合文库筛选与目的分子如蛋白的结合，所述共有序列或构架序列含有随机的潜在相互作用残基。本文所用的"G蛋白偶联受体"或"GPCR"是共享共同的结构基元的多肽，具有7个22-24个疏水氨基酸的区域，所述7个区域形成7个α螺旋，每个螺旋都跨越膜。每次跨越以数字来确定，即跨膜-1 (TMl)、跨膜-2 (ΤΜ2)等。跨膜螺旋通过细胞膜的外部或细胞外侧上跨膜-2与跨膜_3、跨膜-4与跨膜-5以及跨膜-6与跨膜-7之间的氨基酸区域连接，也分别称为“细胞外”区域1、2以及3(EC1、EC2以及EC3)。跨膜螺旋还通过细胞膜内部或细胞内侧上的跨膜-1与跨膜_2、跨膜-3与跨膜-4以及跨膜-5与跨膜-6之间的氨基酸区域连接，也分别称为“细胞内”区域1、2以及3 (ICl、IC2以及IC3)。受体的〃羧基〃 (〃C〃)末端位于细胞内的细胞内空间，并且受体的“氨基”("N")末端位于细胞外的细胞外空间。这些区域中的任何区域都易于通过分析GPCR的一级氨基酸序列而鉴定。GPCR结构和分类在本领域中通常是公知的，并且GPCR的进一步讨论可见于 Probst et al.1992; Marchese et al.1994; Lagerstroni & Schioth,2008; Rosenbaum et al.2009 ；以及下列书籍:Jurgen Wess (Ed) Structure-FunctionAnalysis of G Protein-Coupled Receptors published by WiIey-Liss(1stedition;October 15，1999) ;Kevin R.Lynch (Ed)Identification and Expressionof Protein-Coupled Receptors published by John ffiley&Sons (Marchl998)and Tatsuya Haga(Ed) , G Protein-Coupled Receptors, published by CRCPress (September24, 1999)；以及 Steve Watson(Ed)G-Protein Linked ReceptorFactsbook, published by Academic Press (1st edition;1994)。
可以基于序列同源性将GPCR归为若干不同的家族。尽管所有GPCR都具有相似的7个跨膜α螺旋的结构，但是该受体类别中不同的家族依然没有表现出与另一家族的序列同源性，因此这表明，它们跨膜结构域结构的相似性可能限定了共同的结构要求。当人类基因组的初稿可用时，有关GPCR库的综述是可能的。弗雷德里克森(Fredriksson)及其同事基于系统发育标准将802个人GPCR分成家族。这表明，大多数人GPCR可见于5个主要的家族，称为谷氨酸家族、紫红质家族、粘附家族、Frizzled/Taste2家族以及分泌素家族(Fredriksson et al., 2003)。在本发明的优选实施方案中，蛋白结合结构域针对或能特异性结合GPCR的功能构象状态，其中所述GPCR选自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR视紫红质家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCRFrizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。优选地，GPCR是哺乳动物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆虫蛋白。甚至，更优选地，GPCR是人蛋白。视紫红质家族(在较老的分类系统中对应于A类(Kolakowski, 1994)或I类(Foord et al(2005))的成员，仅具有小细胞外环，并且配体与残基的相互作用发生于跨膜裂隙中。这是迄今为止最大的一组(>90%的GPCRs)并且含有着嗅剂、小分子如儿茶酚胺和胺、(神经)肽以及糖蛋白激素的受体。视紫红质是该家族的代表，其是结构已经被解析的第一个GPCR (Palczewski et al.，2000)。β 2AR是与结构已经被解析的扩散性配体相互作用的第一个受体(Rosenbaum et al, 2007),其也属于该家族。最近基于系统发育分析，已经将B类GPCR或2类(Foord et al, 2005)受体细分成2个家族:粘附和分泌素(Fredrikssonet al., 2003) 0粘附和分泌素受体的特征是，参与配体结合的相对长的氨基末端细胞外结构域。有关跨膜结构域的了解很少，但是其非常可能不同于视紫红质的跨膜结构域。这些GPCR的配体是激素，如胰高血糖素、分泌素、促性腺激素释放激素以及副甲状腺激素。谷氨酸家族受体(C类或3类受体)也具有大的细胞外结构域，所述结构域的功能如同"捕蝇草(Venus fly trap)"，因为其与内部结合的激动剂一起打开和关闭。家族成员是代谢型谷氨酸受体、Ca2+敏感受体以及Y-氨基丁酸(GABA)-B受体。GPCR包括但不限于血清素嗅觉受体、糖蛋白激素受体、趋化因子受体、腺苷受体、生物胺受体、黑皮质素受体、神经肽受体、趋化性受体、生长激素抑制素受体、阿片样受体、褪黑素受体、降钙素受体、PTH/PTHrP受体、胰高血糖素受体、分泌素受体、蛛毒素受体、代谢型谷氨酸受体、钙受体、GABA-B受体、信息素受体、蛋白酶激活受体、视紫红质和其他G蛋白偶联的7跨膜节段受体。GPCR还包括这些彼此相关的GPCR受体，如同聚二聚体或异聚二聚体或更高级别的寡聚体。GPCR的氨基酸序列(和编码它们的cDNA的核苷酸序列)容易获得，例如，参考 GenBank (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/entrez)。根据优选的实施方案，GPCR选自肾上腺素能受体，优选α肾上腺素能受体，如α I肾上腺素能受体和α 2肾上腺素能受体，以及β肾上腺素能受体，如β I肾上腺素能受体、β 2肾上腺素能受体以及β 3肾上腺素能受体；或选自毒蕈碱受体，优选Ml毒蕈碱受体、M2毒蕈碱受体、M3毒蕈碱受体、Μ4毒蕈碱受体以及Μ5毒蕈碱受体；或选自血管紧张素受体，优选血管紧张素I1-1型受体、管紧张素ΙΙ-2型受体以及其他非点心的血管紧张素II型受体，所有这些受体在本领域中都是熟知的。本文所用的GPCR可以是任何天然存在的或非天然存在的(即人为改变的)多肽。术语〃天然存在的〃在提及GPCR时表示，天然产生的GPCR(例如但不限于，由哺乳动物，更具体而言由人或由病毒或由植物或由昆虫等产生的)。这类GPCR是在自然界发现的。术语〃非天然存在的〃在提及GPCR时表示不是天然存在的GPCR。通过突变在组成上变成有活性的野生型GPCR和天然存在的GPCR的变体是非天然存在的GPCR的实例。非天然存在的GPCR可以具有与天然存在的GPCR至少80%相同、至少90%相同、至少95%相同或至少99%相同的氨基酸序列。在本发明的范围内以β 2-肾上腺素能受体作为GPCR的具体非限制性实例，根据上述应当明确，除了人@2肾上腺素能受体(Genbank登录号ΝΡ_000015所述序列)以外，也可以使用小鼠β 2肾上腺素能受体(如Genbank登录号ΝΜ007420所述的序列)或其他哺乳动物β2肾上腺素能受体。另外，意欲所述术语包括来自具体物种的32肾上腺素能受体的野生型多态性变体和某些其他活性变体。例如，〃人32肾上腺素能受体"具有与Genbank登录号为ΝΡ_000015的天然存在的〃人β 2肾上腺素能受体〃至少95%相同(如至少95%或至少98%相同)的氨基酸序列。此外，应当认识到，本发明还考虑到具有环缺失或N-和/或C末端缺失或有关其氨基酸或核苷酸序列的取代或插入或添加或上述的任何组合的GPCR(如上文所定义，并也可参见实施例部分)。进一步预期，本发明的蛋白结合结构域通常能结合所述GPCR的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因。可以用各种方法测定蛋白结合结构域与靶GPCR之间的特异性结合，包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子共振测定、噬菌体展示等，上述都是本领域的普通实践，例如讨论于 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual.ThirdEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 中。应当认识至Li,出于该目的，经常使用特殊的标记或标签，如肽标记、核酸标记、化学标记、突光标记或射频标签，如本文进一步所述。应当明确的是，GPCR是构象上复杂的膜蛋白，其表现出响应天然和合成配体的特征功能行为。根据结合蛋白激活的激动剂限定通路，会要求与各种天然或合成配体(包括活性激动剂结合状态和GPCR - G蛋白复合体的结构)复合的所研究的受体不同构象状态的晶体结构的组合，这会沿着激活通路提供快照。因此，在优选的实施方案中，蛋白结合结构域能稳定或增强GPCR的具体功能构象状态的稳定性。优选地，蛋白结合结构域能在结合GPCR后诱导所述GPCR的功能构象状态。所述GPCR的所述功能构象状态可以是基础构象状态或活性构象状态或非活性构象状态。优选地，蛋白结合结构域能稳定活性构象状态的GPCR和/或能迫使GPCR在结合后采用其活性构象状态。对于GPCR(如本文所定义的)的功能构象状态，本文所用的措辞“诱导”或“迫使”或“锁定”或“诱捕(trapp ing) ”或“固定”或“冷冻”指，根据本发明，由于GPCR与蛋白结合结构域相互作用的影响，保持或支持GPCR采用其另外呈现的可能的构象子集。因此，本文所用“构象诱捕”或“构象固定”或“构象锁定”或“构象冷冻”的蛋白是这样的一种蛋白，由于GPCR与本发明的蛋白结合结构域相互作用的影响，其被保持在其可能另外采用的可能的构象子集中。在这种语境下，特异性或选择性接结合蛋白的具体构象或构象状态的蛋白结合结构域，指以比蛋白可能呈现的其他构象或构象状态更高的亲和性结合采用构象或构象状态子集的所述蛋白的蛋白结合结构域。本领域技术人员应当认识到，特异性或选择性结合蛋白的具体构象或构象状态的蛋白结合结构域，会稳定这种具体构象或构象状态。
本文所用术语“功能构象状态”指蛋白特别是膜蛋白如GPCR具有不同构象状态的事实，所述构象状态具有动态活性范围，特别是从无活性到最大活性范围(Kobilka andDeupi，2007做了综述)。应当明确的是，并非意图“功能构象状态”涵盖蛋白的变性状态。GPCR的多功能性与导致这一构象谱的这些蛋白的柔韧性固有偶联。构象能量图景本质上与存在结合配体(效应分子、激动剂、拮抗剂、反向激动剂……)、脂质环境或相互作用蛋白的结合偶联。例如，“基础构象状态”可以定义为缺少配体(如上文所定义的，如效应分子、激动剂、拮抗剂、反向激动剂)情况下的受体的低能状态。蛋白会经历向另一构象状态转变的概率，是两种状态之间的能量差异与两种状态之间能障高度的函数。在受体蛋白如GPCR的情况下，配体结合的能量可以用于改变两种状态之间的能障或改变两种状态之间的相对能量水平，或改变两者。改变能障会对两种状态之间的转变速率具有影响，而改变能量水平会对两种状态的受体的平衡分布具有影响。激动剂或部分激动剂的结合会减少能障和/或相对于非活性构象状态降低更具活性的构象状态的能量。反向激动剂会增加能障和/或相对于“活性构象”降低“非活性状态构象”的能量。受体与其G蛋白的偶联，可能进一步改变能量图景。包括GPCR在内的膜本体蛋白的活性，也受到在膜中围绕它们的脂质分子结构的影响。膜蛋白不是刚性实体，并且变形，以确保与周围脂质双层良好的疏水匹配。一个重要的参数是脂质双层的疏水厚度，其由脂质脂肪酰链限定。同时，脂质首基区的结构可能对于限定位于脂质首基区的膜蛋白这些部分的结构是重要的。在其他脂质中，胆固醇的棕榈酰化和与GPCR的结合，可能也在单体受体内发挥结构作用，并有助于受体寡聚体的形成/稳定(Lee2004;Chini and Parenti2009)。上文所定义的“受体配体”或仅仅“配体”可以是“正位”配体(天然和合成的)，意即它们结合受体的活性位点，并且根据它们的功效或换而言之根据它们通过具体通路对受体信号传导的影响而对其进一步分类。本文所用的“激动剂”指通过结合受体增强所述受体的信号传导活性的配体。完全激动剂能进行最大受体刺激；部分激动剂不能诱发完全活性，即使在饱和浓度下。部分激动剂通过防止更强激动剂的结合而发挥“阻断剂”的功能。“拮抗剂”指结合受体但不刺激任何活性的配体。由于能防止其他配体的结合并因此阻断激动剂诱导的活性，“拮抗剂”也被称为“阻断剂”。此外，“反向激动剂”指除了阻断激动剂作用之外，还将受体的基础或固有活性降低至低于无配体受体的活性。GPCR如何调节细胞生理的正规观点是，配体(如激素、神经递质或感官刺激物)的结合稳定受体的活性构象状态，从而允许与异源三聚体G蛋白相互作用。除了与G蛋白相互作用之外，激动剂结合的GPCR与GPCR激酶(GRKs)结合，导致受体磷酸化。GRK磷酸化GPCR的常见结果是降低GPCR与G蛋白的相互作用，并增强GPCR与抑制蛋白的相互作用，这在空间上进一步阻断G蛋白信号传导，从而导致受体脱敏。因为β抑制蛋白关掉G蛋白信号，因此它们可以同时启动一组第二平行信号级联，如MAPK通路。GPCR还与一般的GPCR相互作用蛋白家族(G蛋白 、GRK、抑制蛋白和其他受体)外的各种蛋白结合。这些GPCR选择性伴侣可以介导GPCR信号传导，通过G蛋白组织GPCR信号传导，指导GPCR运输，将GPCR锚定在特定亚细胞区域和/或影响GPCR药理(Ritter and Hall2009)。因此，本文所用的配体也是能选择性刺激一子集受体的信号传导活性的“偏爱性配体”，例如选择性激活G蛋白或β抑制蛋白功能。这类配体也称为“偏爱性配体”、“偏爱性激动剂”或“功能选择性激动剂”。具体而言，配体偏爱可以是不完美的偏爱，其特征是对于不同信号，配体以不同的相对功效刺激多受体活性(非绝对选择性)；或可以是完美的偏爱，其特征是，配体刺激一种受体活性，而对另一已知的受体活性无任何刺激。GPCR的信号传导活性(以及因此它们的构象行为)也可以受到另一类称为变构调节剂的配体的影响。“变构调节剂(allosteric regulators) ”或“变构调节剂(allostericmodulator) ”、“变构配体”或“效应分子”在GPCR的变构位点(也就是说，在物理上不同于蛋白的活性位点 的调节位点)结合。与正位配体相比，变构调节剂是非竞争性的，因为它们在不同的位点结合受体，并且修饰受体功能，即使内源性配体正在结合。因为这一点，变构调节剂并不限于仅仅打开或关闭受体，这是大多数药物的方式。相反，它们更像二聚体开关一样发挥作用，从而对激活或失活强度提供控制，同时允许肌体保留其对启动受体激活的天然控制。增强蛋白活性的变构调节剂在本文中也称为“变构激活剂”或“正向变构调节齐U”，而降低蛋白活性的那些在本文中称为“变构抑制剂”或“负向变构调节剂”。优选地，本发明的蛋白结合结构域能特异性结合与激动剂结合的GPCR和/或增强GPCR对激动剂的亲和性。优选蛋白结合结构域在结合受体后能增强激动剂的亲和性至少2倍、至少5倍，更优选至少10倍，这可以通过EC5Q、IC5Q、Kd的降低或本领域技术人员已知的亲和性或潜能的任何其他测量而测量。应当认识到，GPCR的结构稳定性和/或具体生物学活性的增强，也可以是其他变性剂或变性条件的指导，包括热、去污剂、离液剂和极端pH。因此，在另一实施方案中，本发明的蛋白结合结构域能在稀释、浓缩、缓冲组合物、热、冷却、冷冻、去污剂、离液齐U、pH诱导的非生理条件下增强GPCR的功能构象状态。与水溶性蛋白相比，已经证明膜蛋白折叠和稳定性的热力学研究是非常具有挑战性的，并且由于难以发现可逆折叠的条件而复杂化。使通过诸如热和化学方法等大多数方法诱导的螺旋跨膜蛋白解折叠，如Stanley and Fleming(2008)所综述的，都是不可逆的。因此,本文所用的术语“热稳定
(thermostabilize) ”、“热稳定(thermostabilizing) ”、“增强......的热稳定性”，指 GPCR 的
功能特性而不是指其热力学特性，并且指蛋白对热和/或化学方法所诱导的不可逆变性的抗性，所述方法包括但不限于加热、冷却、冷冻、化学变性剂、pH、去污齐IJ、盐、添加齐IJ、蛋白酶或温度。不可逆变性导致蛋白功能构象的不可逆解折叠、生物学活性丧失以及变性蛋白的聚集。本文所用的术语“(热)稳定”、“(热)稳定”、“增强……的(热)稳定性”适用于包埋于脂质颗粒或脂质层(例如脂质单层、脂质双层等)的GPCR，并且适用于已经溶解于去污剂中的GPCR。优选地，本发明的蛋白结合结构域能增强GPCR的功能构象状态、优选GPCR的活性构象状态的热稳定性。对于对热的稳定性增强，这可以容易地通过以下方式测定:测量配体结合，或利用温度增加时对解折叠敏感的光谱法，如荧光、CD或光散射(也请参阅实施例部分)。优选地，蛋白结合结构域能增强稳定性，如通过功能构象状态的GPCR的热稳定性增强至少2° C、至少5° C、至少8° C、更优选至少10° C或15° C或20° C所测量的。根据另一优选的实施方案，蛋白结合结构域能增强与配体复合的GPCR的功能构象的热稳定性，所述配体诸如但不限于GPCR的激动剂、反向激动剂、拮抗剂和/或调节剂或抑制剂或GPCR依赖性信号传导通路。根据另一优选的实施方案，本发明的蛋白结合结构域在存在去污剂或离液剂的情况下能增强GPCR的功能构象状态的稳定性。优选地，蛋白结合结构域能增强GPCR活性构象状态对热或化学方法所诱导的变性的稳定性。对于对热、去污剂或离液剂稳定性的增强，通常在存在测试去污剂或测试离液剂的情况下，将GPCR孵育确定的时间，并且利用例如配体结合或光谱方法，任选地在上文所讨论的温度增加的下，测定稳定性。仍然根据另一优选的实施方案，本发明的蛋白结合结构域能增强GPCR的功能构象状态对极端PH的稳定性。优选地，蛋白结合结构域能增强GPCR活性构象状态对极端pH的稳定性。对于PH的限度，所选择的典型测试pH范围为例如6-8、5.5-8.5、5_9、4.5-9.5，更具体而言范围为4.5-5.5 (低pH)，或范围为8.5-9.5 (高pH)。本发明的蛋白结合结构域通常可以针对任何期望的GPCR，并且特别是可以针对任何GPCR的任何构象表位，优选任何GPCR的功能构象状态，更优选GPCR的活性构象状态(都如上文所定义)。具体而言，所述构象表位可以是细胞内或细胞外区域或膜内区域或任何期望的GPCR的结构域或环结构的一部分。根据具体实施方案，蛋白结合结构域可以针对GPCR的任何合适的细胞外区域、结构域、环或其他细胞外构象表位，但是优选针对跨膜结构域的细胞外部分之一，或更优选针对连接跨膜结构域的细胞外环之一。可选地，蛋白结合结构域可以针对GPCR的任何合适的细胞内区域、结构域、环或其他细胞内构象表位，但是优选针对跨膜结构域的细胞内部分之一，或更优选针对连接跨膜结构域的细胞内环之一。特异性结合“三维”表位或“构象”表位的蛋白结合结构域，特异性结合折叠蛋白的三级(即三维)结构，并且以大量降低(即至少2、5、10、50或100倍)的亲和性结合线性(即解折叠的，变性的)形式的蛋白。进一步期望，本发明的蛋白结合结构域通常会结合所述GPCR的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因。在具体实施方案中，本发明的蛋白结合结构域能特异性结合GPCR的细胞内构象表位。优选地，所述蛋白结合结构域能特异性结合这样的构象表位，其包含于、位于GPCR的G蛋白结合位点，或与之重叠。更优选地，所述蛋白结合结构域可以占据GPCR的功能构象状态、更优选GPCR活性构象状态的G蛋白结合位点。最优选地，所述蛋白结合结构域表现出G蛋白样行为。本文所用术语“G蛋白样行为”指与例如反向激动剂结合的受体相比，蛋白结合结构域优先结合与激动剂结合的受体的特性。表现出G蛋白样行为的蛋白结合结构域也增强受体对激动剂的亲和性，这归因于激动剂占据的受体与G蛋白之间的协同相互作用(也请参见实施例部分)。在优先的实施方案中，蛋白结合结构域来源于固有或适应性免疫系统。优选地，所述蛋白结合结构域来源于免疫球蛋白。优选地，本发明的蛋白结合结构域是抗体或是抗体衍生物。术语"抗体"(Ab)通常指免疫球蛋白级基因所编码的多肽或其功能片段，所述多肽特异性结合并识别抗原，并且是本领域技术人员已知的。常见的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每个四聚体都由2对相同的多肽链构成，每对链都具有一条"轻"链(约25kDa)和一条〃重链〃链(约50-70kDa)。每条链的N末端都限定主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。术语“抗体”意图包括全抗体，包括单链全抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段可以是抗原结合抗体片段，其包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(dsFv)和包含或组成为VL或VH结构域的片段以及上述的任何组合，或能结合靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其他功能部分。如本文进一步所限定的，术语“抗体”还意图包括重链抗体或其功能片段，如单链结构域抗体，更具体而言纳米抗体。
优选地，所述蛋白结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4个构架区和3个互补决定区(顺序优选为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)或其任何合适的片段(则其通常会含有至少一些形成至少一个互补决定区的氨基酸残基)。包含4个FR和3个CDR的蛋白结合结构域对本领域技术人员而言是已知的，并且作为非限制性实例描述于Wesolowski et al.(2009)中。优选地，本发明的蛋白结合结构域来源于骆驼抗体。更优选地，本发明的蛋白结合结构域包含纳米抗体的氨基酸序列或其任何合适的片段。具体而言，蛋白结合结构域是纳米抗体或其任何合适的片段。本文所用的“纳米抗体”(Nb)指来源于天然存在的重链抗体的最小抗原结合片段或单个可变结构域(“VHH”)，并且对本领域技术人员而言是已知的。它们来源于见于胳5它中的仅具有重链的抗体(heavy chain only antibody) (Hamers-Castermanet al.1993;Desmyter et al.1996)。在骆5它科(Camelids)中，发现了不含轻多肽链的免疫球蛋白。“胳马它科”包括旧世界胳马它(双峰胳马它(Camelus bactrianus)和单峰胳马它(Camelusdromedarius))和新世界胳马它(例如(Lama paccos)、(Lama glama)、(Lama guanicoe)以及(Lama vicugna))。所述单个可变结构域重链抗体在本文中称为纳米抗体或VHH抗体。NanobodyTM、Nanobodies 以及 Nanoclone 是 Ablynx NV(Belgium)的商标。Nb 的小尺寸以及独特的生物物理特性，对于识别不常见的或隐藏的表位而言以及对于结合到蛋白靶标的腔或活性位点而言，胜过常规抗体片段。此外，Nb可以称为双特异性或二价抗体，或连接于报道分子(Conrath et al.2001)。Nb是稳定且刚性的单结构域蛋白，其易于制造并且幸免于胃肠系统。因此，Nb可以用于许多应用中，包括药物发现和治疗(Saerens et al.2008),但也用作蛋白纯化、功能研究和结晶的通用和有价值的工具(Conrath et al.2009)。本发明的纳米抗体通常包含单个氨基酸链，可以认为所述单个氨基酸链包含4个“构架序列”或FR和3个“互补决定区”或CDR(如上文所定义)。本发明纳米抗体的非限制性实例在本文中有更详细的描述。应当明确的是，纳米抗体的构架区也有助于它们抗原的结合(Desmyter et al2002; Korotkov et al.2009)。本发明纳米抗体的非限制性实例包括但不限于SEQ ID NO: 1-29所限定的纳米抗体(参见图12，表I)。CDR序列的描述基于V结构域和V样结构域的IMGT独特编号系统(Lefranc et al.2003)。在具体实施方案中，上述纳米抗体可以包含至少一个氨基酸序列选自SEQ ID N0:30-70(参见图12 ;表2)的互补决定区(⑶R)。具体而言，上述纳米抗体可以选自包含SEQ ID NO: 1-29的组或其功能片段。本文所用的“功能片段”或“合适的片段”例如可以包含一个CDR环。优选地，所述功能片段包含CDR3。具体而言，所述纳米抗体由SEQ IDNO: 1-29中的任何一条组成，且所述纳米抗体的所述功能片段由SEQ ID NO:30-70中的任何一条组成。仍然在另一实施方案中，编码任何上述纳米抗体或功能片段的核酸序列，也是本发明的一部分。此外，本发明还考虑了包含编码人恶化上述纳米抗体或其功能片段的核酸序列的表达载体，以及表达这类表达载体的宿主细胞。合适的表达系统包括细菌或酵母的组成型和诱导型表达系统，病毒表达系统如杆状病毒、塞姆利基森林病毒(semliki forestvirus)以及慢病毒，或在昆虫或哺乳动物细胞中瞬时转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯得毕赤酵母菌(Pichia pastoris)等。合适的动物宿主细胞包括HEK293、COS、S2、CH0、NS0, DT40等。纳米抗体的克隆、表达和/或纯化可以根据本领域技术人员已知的技术进行。应当指出，本文以最广泛涵义使用的术语纳米抗体并非限于具体的生物来源或限于具体的制备方法。例如，本发明的纳米抗体通常可以通过以下方式获得:(I)分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)"人源化"天然存在的VHH结构域或表达编码人源化VHH结构域的核酸；(4)"骆驼源化(camelization)"来自任何动物种类、特别是来自哺乳动物种类如来自人类的天然存在的VH结构域，或表达编码骆驼源化VH结构域的核酸；(5)"骆驼源化"本领域所述的"结构域抗体〃或〃Dab〃，或表达编码这类骆驼源化VH结构域的核酸；(6)利用本身已知的制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技术；(7)利用本身已知的核酸合成技术，制备编码纳米抗体的核酸，随后表达由此获得的核酸；和/或(8) —种或多种上述方式的任何组
口 ο一类优选的纳米抗体对应于针对GPCR的功能构象状态的天然存在的重链抗体的VHH结构域。尽管纳米抗体的天然或合成文库(对于文库的实例，参阅W09937681、W00043507, W00190190, W003025020以及W003035694)可以含有针对功能构象状态的GPCR的构象粘合剂，但是本发明的优选实施方案包括用任选地结合受体配体的功能构象状态的GPCR免疫骆驼，以暴露具有对GPCR而言独特的构象表位的动物的免疫系统(例如，激动剂结合的GPCR，从而产生抗活性构象状态的GPCR的抗体)。因此，如本文进一步所述，优选这类VHH序列可以通过以下方式产生或获得:用GPCR，优选功能构象状态、更优选活性构象状态的GPCR合适地免疫骆驼科物种(即以便产生针对所述GPCR的免疫应答和/或重链抗体)，由所述骆驼(如B细胞的血样或任何样品)获得合适的生物样品，以及从所述样品开始，产生针对所述GPCR的VhH序列。这类技术是技术人员清楚的。获得期望的VHH序列的另一项技术包括，合适地免疫能表达重链抗体的转基因哺乳动物(即以便产生针对功能构象状态的GPCR的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(如B细胞的血样或任何样品)，以及接着从所述样品开始，利用本身已知的任何合适技术，产生针对所述GPCR的VHH序列。例如，出于这个目的，可以利用描述于W002085945和W004049794中的表达重链抗体的小鼠和其他方法及技术。因此，本发明包括产生本发明的蛋白结合结构域的方法。作为非限制性实例，提供了产生特异性结合GPCR的功能构象状态的构象表位的纳米抗体的方法，包括:⑴用GPCR免疫动物，和(ii)筛选特异性结合所述GPCR的功能构象状态的构象表位的纳米抗体。优选地，在存在受体配体的情况下，会用GPCR免疫动物，其中所述配体诱导所述GPCR的具体功能构象状态。例如，在存在诱导GPCR活性构象状态形成的激动剂的情况下，通过用所述GPCR免疫动物，可以产生特异性结合所述GPCR活性构象状态的构象表位的纳米抗体(还参阅实施例部分)。为了用GPCR免疫动物，可以利用常规方法产生并纯化GPCR，所述方法可以使用在宿主细胞中表达重组形式的GPCR，并利用亲和层析和/或基于抗体的方法纯化GPCR。在具体实施方案中，杆状病毒/Sf-9系统可以用于表达，尽管其他表达系统(例如细菌、酵母或哺乳动物细胞系统)也可以使用。表达和纯化GCPR的实例性方法描述于例如Kobilka (1995), Eroglu et al (2002), Chelikani et al (2006)和书籍"Identificationand Expression of G Protein-Coupled Receptors^ (Kevin R.Lynch (Ed.), 1998)等许多其他文献中。也可以在磷脂泡中重建GPCR。同样，在磷脂泡中重构活性GPCR的方法是已知的，并且描述于:Luca et al (2003), Mansoor et al (2006), Niu et al.(2005)，Shimada etal.(2002)以及Eroglu et al.(2003)等中。在某些情况下，GPCR和磷脂可以以高密度重构(例如Img受体/mg磷脂)。在具体实施方案中，可以测试磷脂泡以证实GPCR是活性的。在许多情况下，GPCR可以以两种方向存在于磷脂泡中(以正常方向，和以〃倒置〃方向，其中细胞内环位于小泡的外面)。用GPCR免疫的其他的方法包括但不限于使用表达GPCR的完整细胞、用编码GPCR的核酸序列接种(如DNA接种)、用表达GPCR的病毒或病毒样颗粒免疫等其他方法。可以利用本领域熟知的适合产生免疫应答的任何技术，免疫任何合适的动物，如温血动物，特别是哺乳动物如兔、小鼠、大鼠、骆驼、绵羊、牛、鲨鱼或猪或鸟如鸡或火鸡。作为非限制性实例，筛选特异性结合所述GPCR的功能构象状态的构象表位的纳米抗体可以例如通过以下方式进行，筛选在表面表达重链抗体的细胞组、集合或文库(如从合适地免疫的骆驼科动物获得的B细胞)或筛选在表面展示了 genIII和纳米抗体融合的噬菌体，筛选VHH序列或纳米抗体序列的(天然或免疫)文库，或筛选编码VHH序列或纳米抗体序列的核酸序列的(天然或免疫)文库，上述都可以以本身已知的方式进行，并且所述方法还可以任选地包括一个或多个其他合适的步骤，例如但不限于亲和性成熟步骤、表达期望的氨基酸序列的步骤、筛选针对期望的抗原的结合和/或活性的步骤(在此情况下，为GPCR)、测定期望的氨基酸序列或核苷酸序列的步骤、引入一个或多个人性化取代的步骤、以合适的多价和/或多特异性格式进行格式化的步骤、筛选期望的生物和/或生理特性的步骤(即利用本领域已知的合适的测定)和/或一个或多个这类步骤以任何合适的顺序的组合。 本发明的一类特别优选的蛋白结合结构域包含具有氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列对应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列，但是其已经被“人源化”，即用一个或多个存在于来自 人常见4链抗体的VH结构域中相应位置处的氨基酸残基，取代所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列(特别是构架序列)中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式进行，基于有关人源化的本文进一步描述和现有技术，这对技术人员是清楚的。还应当指出，本发明的这类人源化纳米抗体可以以本身已知的任何合适的方式获得(即如根据上文(1)-(8)点所述)，因此并非严格限于利用包含天然存在的VHH结构域作为起始材料的多肽获得的多肽。人源化纳米抗体具有数个优势，例如与相应的天然存在的VHH结构域相比，免疫原性降低。这类免疫通常涉及用存在于人VH结构域如人VH3结构域中相同位置的氨基酸残基，取代天然存在的VHH序列中的一个或多个氨基酸残基。人源化取代的选择应当使得所得的人源化纳米抗体仍然保留本文所限定的纳米抗体的有利特性。技术人员应当能选择人源化取代或人源化取代的合适组合，从而在一方面所述人源化取代所提供的有利特性与另一方面天然存在的VHH结构域的有利特性之间优化或实现期望的或合适的平衡。本发明的另一类特别优选的蛋白结合结构域包含具有氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，但是其已经被“骆驼源化”，即用一个或多个存在于重链抗体VHH结构域中相应位置处的氨基酸残基，取代来自常见4链抗体的天然存在的VH结构域氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。优选将这类"骆驼源化"取代插入形成和/或位于VH-VL界面处和/或位于本文所限定的所谓骆驼标志残基处的氨基酸位置处(参阅例如W09404678)。优选地，用作产生或设计骆驼源化纳米抗体的起始材料或起始点的VH序列优选是来自哺乳动物的VH序列，更优选人的VH序列，如VH3序列。然而，应当指出，本发明的这类骆驼源化纳米抗体可以以本身已知的任何合适的方式获得(即如根据上(1)-(8)点所述)，并且因此并非严格限于利用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。例如，〃人源化〃和〃骆驼源化〃两者都可以通过以下方式进行:提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，接着以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子，从而使得新的核苷酸序列分别编码本发明的“人源化”或“骆驼源化”纳米抗体。随后可以以本身已知的方式表达这种核酸，从而提供本发明的期望的抗体。可选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计本发明的期望的人源化或骆驼源化纳米抗体的氨基酸序列，并随后利用本身已知的肽合成技术从头合成。还分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以设计分别编码本发明的期望的人源化或骆驼源化纳米抗体的核苷酸序列，并随后利用本身已知的核酸合成技术从头合成,之后，由此获得的核酸可以以本身已知的方式表达,从而提供本发明的期望的纳米抗体。从天然存在的VH序列或优选VHH序列开始，获得本发明的纳米抗体和/或其编码核酸的其他合适的方法和技术，对技术人员而言是清楚的，并且可以例如包括以合适的方式组合一个或多个天然存在的VH序列(如一个或多个FR序列和/或CDR序列)的一个或多个部分、一个或多个天然存在的VHH序列(如一个或多个FR序列或CDR序列)的一个或多个部分和/或一个或多个合成或半合成序列，以便提供本发明的纳米抗体或其编码核苷酸序列或核酸。还位于本发明范围内的是，利用本发明的蛋白结合结构域优选纳米抗体的天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同源物和直系同源物(在本文中统称为“类似物”)，特别是SEQ ID NO: 1-29(参见表1，图12)的纳米抗体的类似物。因此，根据本发明的一个实施方案，最广泛含义的术语〃本发明的纳米抗体〃还涵盖这类类似物。通常在这类类似物中，与本文所定义的本发明的纳米抗体相比，可能已经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基。可以在一个或多个构架区和/或一个或多个⑶R，特别是SEQ ID NO: 1-29的纳米抗体的CDR的类似物中进行这类取代、插入、缺失或添加，所述CDR对应于SEQ IDNO:30-70(参见表2，图12)。本文所用的类似物是序列，其中每一或任何构架区每一或任何互补决定区都与参照序列中的相应区域表现出至少80%的同一性，优选至少85%的同一性，更优选90%的同一性，甚至更优选95%的同一性(即？1 1_类似物对FR1_参照，⑶町_类似物对CDR1_参照，FR2_类似物对FR2_参照，CDR2_类似物对CDR2_参照，FR3_类似物对FR3_参照，CDR3_类似物对CDR3_参照，FR4_类似物对FR4_参照)，这可通过BLASTp比对(Altschul et al;1987;FR and CDR definitions according to IMGT unique numberingsystem for V-domains and V-1ike domains (Lefranc et al.2003))测量。作为非限制性实例，取代可以是例如保守取代(如本文所述)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一 VHH结构域中相同位置的另一氨基酸残基取代。因此，任何一个或多个取代、缺失或插入或其任意组合， 其改善了本发明纳米抗体的特性或至少不过多有损于本发明纳米抗体的期望特性或本发明纳米抗体期望特性的平衡或组合(即到所述纳米抗体不在适合其既定用途的程度)，都包括于本发明的范围内。基于本文公开的内容以及任选地在有限程度的常规实验后，技术人员通常能确定并选择合适的取代、缺失、插入或其合适的组合，所述常规实验可以涉及例如引入数量有限的可能取代，并测定它们对因此获得的纳米抗体特性的影响。例如，并取决于用于表达本发明蛋白结合结构域、优选纳米抗体的宿主有机体，可以设计这类缺失和/或取代，从而使得除去一个或多个用于翻译后修饰的位点(如一个或多个糖基化位点)，这也在本领域技术人员能力范围内。可选地，可以设计取代或插入，以便引入一个或多个用于连接功能基团的位点(如本文所述)，例如以允许位点特异性聚乙二醇化。修饰的实例，以及蛋白结合结构域序列、优选纳米抗体序列中可以修饰的氨基酸残基的实例(即位于蛋白主链上，但是优选位于侧链上)，可以用于引入这类修饰的方法和技术，以及这类修饰的潜在用途和优势，对本领域技术人员而言是清楚的。例如，这类修饰可以涉及，将一个或多个官能团、残基或部分引入(例如通过共价连接或以另一合适的方式)本发明的纳米抗体中或之上，特别是引入一个或多个赋予本发明的纳米抗体一种或多种期望的特性或功能的官能团、残基或实体。这类官能团的实例和将其引入的技术的实例，对技术人员而言是清楚的，并且通常可以包括上文引用的一般背景技术所提到的所有官能团和技术，以及用于修饰药用蛋白特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv和单结构域抗体)的本身已知的官能团和技术，为此，可以参考例如Remington’sPharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing C0.，Easton, PA(1980)。这类官能团可以例如直接(例如共价)连接于本发明的纳米抗体，或任选地通过合适的连接体或间隔子，同样，这对于技术人员而言也是清楚的。用于增加药用蛋白的半衰期和/或降低免疫原性的最常用的技术之一，包括连接合适的药学上可接受的多聚体，如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可以使用任何形式的合适的聚乙二醇化，如用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’ s)领域的；参考例如 Chapman, Nat.Biotechnol.，54，531-545 (2002) ; Veronese and Harris, Adv.Drug Deliv.Rev.54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat.Rev.Drug.Discov., 2, (2003)和TO04060965。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂，也可以以商业方式获得，例如从NektarTherapeutics, USA获得。优选地,使用定点聚乙二醇化,特别是通过半胱氨酸残基(参见例如 Yang et al., Protein Engineering, 16，10，761-770 (2003)。例如，为此目的，可以将PEG连接于天然存在于本发明的纳米抗体中的半胱氨酸残基，可以修饰本发明的纳米抗体，从而合适地引入一个或多个半胱氨酸残基用于连接PEG，或可以将包含用于连接PEG的一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列与本发明纳米抗体的N-和/或C末端稠合，所有这些都利用实质上技术人员已知的蛋白工程技术。优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白而言，所用的PEG的分子量为大于5000，如大于10，000并小于200，000，如小于100，000 ;例如在20，000-80, 000的范围内。另一通常较少优选的修饰包含，N-连接或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于表达本发明的纳米抗体或多肽所用的宿主细胞。用于增加纳米抗体半衰期的另一项技术可以包括，改造到双功能纳米抗体(例如，一针对靶GPCR的纳米抗体和一针对血清蛋白如白蛋白的纳米抗体)中或改造到纳米抗体与肽(例如针对针对血清蛋白如白蛋白的肽)的融合物中。另一种修饰可以包括，引入一个或多个可检测的标记或其他信号产生基团或部分，这取决于标记的蛋白结合结构域、特别是纳米抗体的既定用途。合适的标记以及连接、使用以及检测它们的技术，对技术人员而言是清楚的，并且例如包括但不限于荧光标记(如荧光素、异硫氰酸盐、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、O-苯二醛、荧光胺以及突光金属，如Eu或镧系兀素的其他金属)、磷光标记、化学发光标记或生物发光标记(如鲁米那、异鲁米那、theromatic B丫唳酯、咪唑、B丫唳盐(acridinium salt)、草酸酯、二恶二酮(dioxetane)或GFP及其类似物)、放射性同位素、金属、金属螯合物或金属阳离子或特别适合体内、体外使用或原位诊断以及成像的其他金属或金属阳离子，以及生色团和酶(如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、生物素亲和素过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-V1-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶以及乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标记对于技术人员而言是清楚的，例如包括可以利用NMR或ESR谱检测的部分。本发明的这类标记的纳米抗体或多肽可以用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，如ELISA、RIA、EIA和其他〃夹心测定〃等)以及体内诊断和成像目的，这取决于对具体标记的选择。对技术人员显而易见的是，另一种修饰可以涉及，引入螯合基团，例如以便螯合上文提到的金属或金属阳离子之一。合适的螯合基团例如包括但不限于二乙基-三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。另一种修饰可以包括，引入为具体结合对的一部分的官能团，如生物素_(链霉)亲和素结合对。这类官能团可以用于将本发明的纳米抗体连接于结合于结合对的另一半的另一蛋白、多肽或化学化合物，即通过形成亲和对。例如，本发明的纳米抗体可以缀合于生物素，并连接于缀合于亲和素或链霉亲和素的另一蛋白、多肽、化合物或载体。例如，这类缀合的纳米抗体可以用作报道子，例如在诊断系统中，其中产生可检测信号的试剂缀合于亲和素或链霉亲和素。这类亲和对也可以例如用于将本发明的纳米抗体结合于载体，包括适合药物用途的载体。一非限制性实例是描述于 Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8，4，257 (2000)的脂质体制剂。这类结合对也可以用于将治疗活性剂连接于本发明的纳米抗体。在具体实施方案中，本发明的纳米抗体是二价的并通过化学结合或通过重组DNA技术和重链的两个单价单结构域形成。在另一具体实施方案中，本发明的纳米抗体是双特异性的，并通过同时结合重链的两个可变结构域而形成，每个结构域都具有不同的特异性。同样，作为非限制性实例，包含多价或多特异性纳米抗体的多肽，也包括在本文中。优选地，本发明的单价纳米抗体是这样的单价纳米抗体，即其会结合GPCR的功能构象状态、更优选GPCR活性构象状态的细胞外部分、区域、结构域、环或其他细胞外表位，且结合时的亲和性小于500nM、优选小于200nM、更优选小于ΙΟηΜ，如小于500pM。可选地，本发明的单价纳米抗体是这样的单价纳米抗体，即其会结合GPCR的功能构象状态、更优选GPCR活性构象状态的细胞内部分、区域、结构域、环或其他细胞内表位，且结合时的亲和性小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，如小于500pM。同样，根据这一方面，本发明的任何多价或多特异性(如本文所限定)纳米抗体还可以合适地针对相同抗原上的两个或多个不同的细胞外或细胞内部分、区域、结构域、环或其他细胞外或细胞内表位，例如针对两个不同的细胞外环或细胞内环，或针对跨膜结构域的两个不同的细胞外部分或细胞内部分。针对期望的GPCR和/或针对可以通过使用本发明的这类多价或多特异性纳米抗体而获得的任何其他期望的特性或期望的特性的组合，这类多价或多特异性纳米抗体还可以具有(或经改造和/或选择)增强的亲和力和/或改善的选择性。在具体实施方案中，本发明的这类多价或多特异性纳米抗体还可以具有(或经改造和/或选择)改善的调节GPCR的信号传导活性的功效(同样进一步参阅本文)。应当认识到，本发明的多价或多特异性纳米抗体还可以合适地针对不同的抗原，例如但不限于与GPCR或一个或多个下游信号传导蛋白相互作用的配体。本发明的第二方面涉及复合体，其包含(i)本发明的蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及任选地(iii)受体配体。本文所限定的“受体配体”或“配体”可以是小化合物、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体或来源于其的任何合适的片段等。配体优先来自激动剂类，并且受体处于活性构象状态。配体也可以是反向激动齐U、拮抗剂或偏爱性配体。配体可以是正位的或变构的。配体还包括变构调节剂、增效剂(potentiator)、增强剂(enhancer)、负向变构调节剂以及抑制剂。它们自身可以具有生物学活性，或它们可以仅在存在另一配体的情况下调节活性。Neubig et al (2003)描述了许多这类配体。优选地，本发明提供了复合体，其中蛋白结合结构域结合于GPCR ;更优选地，蛋白结合结构域结合于GPCR，其中所述GPCR结合于受体配体。为了进一步说明这一点，并且并无限制目的，含有纳米抗体、GPCR以及激动剂的稳定的三元复合体，可以通过亲和层析或凝胶过滤从混合物纯化，所述混合物含有(I)对所述GPCR的活性构象具有特异性的纳米抗体，⑵去污剂增溶的受体以及⑶激动剂。在另一优选的实施方案中，复合体是晶体。因此，还提供了复合体的晶体，以及制备所述晶体的方法，其更详细的描述于下文。优选地，考虑了晶体形式的复合体，其包含(i)本发明的蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态、更优选活性构象状态的GPCR，以及任选地(iii)受体配体，其中所述晶体形式通过使用本发明的蛋白结合结构域获得。在另一优选的实施方案中，本发明的复合体采用溶解的形式，例如在用去污剂水性溶解后。在可选的优选实施方案中，将本发明的复合体固定化于固相支持物上。固相支持物的非限制性实例以及固定方法和技术在详细的描述中有进一步描述。仍然在另一实施方案中，本发明的复合体采用“细胞组合物”形式，包括有机体、组织、细胞、细胞系以及来源于所述有机体、组织、细胞或细胞系的膜组合物。意图所述膜组合物还包括可以包含天然或合成脂质或其组合的任何脂质体组合物。膜或脂质体组合物的实例包括但不限于细胞器、膜制剂、病毒样脂质颗粒、脂质层(双层和单层)、脂质泡、高密度脂质颗粒(如纳米盘)等。应当认识到，细胞组合物或膜样或脂质体组合物可以包含天然或合成脂质。因此，本发明的第三方面涉及包含本发明的蛋白结合结构域和/或复合体的细胞组合物，包括其来源的膜或脂质体组合物(都如上文所限定)。优选地，提供和/或表达蛋白结合结构域的细胞组合物能在结合所述蛋白结合结构域后稳定和/或诱导GPCR的功能构象状态。应当理解到，保持各自蛋白的充分的功能非常必要，用于此的方法和技术是可以利用的，并且对本领域技术人员而言是已知的。还应当认识到，所述细胞组合物可以内源性或外源性提供和/或靶GPCR。由膜片段或膜-去污剂提取物形成的GPCR制剂的详细综述见于COOper(2004)，其在此通过援引并入。实施例部分进一步提供了溶解的受体制剂的非限制性实例。
可以遵循下述文献所概括的原则实施靶细胞(如哺乳动物细胞)的转染uSambrook and Russel(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Volume3,Chapterl6, Sectionl6.1-16.54)。另外，也可以利用诸如腺病毒载体的试剂进行病毒转导。选择合适的病毒载体系统、调节区域以及宿主细胞，是本领域普通技术人员的公知常识。根据标准实践，维持培养所得的转染细胞，或冷冻供以后使用。优选地，细胞是表达目的GPCR的真核细胞，例如酵母细胞，或培养的细胞系，例如哺乳动物细胞系，优选人细胞系。在功能上表达蛋白结合结构域和/或GPCR的优选细胞系包括昆虫细胞(如SF-9)、人细胞系(如HEK293)、啮齿动物细胞系(如CH0-K1)、骆驼细胞系(Dubca)。上文所述的蛋白结合结构域或复合体或细胞组合物可以用于多种环境和应用，这会在下文有进一步的详细描述。GPCR的结晶及其结构解析包括GPCR在内的膜蛋白的结晶仍然是令人敬畏的挑战。尽管出现了允许产生毫克数量的表达和纯化方法，但是用这些分子实现稳定性可能是最难克服的障碍。纯化必须通过去污剂增溶从脂质双层释放GPCR，这是用表面活性剂单体涂覆蛋白的疏水表面以形成蛋白-去污剂复合体(PDC)的过程。然而，在蛋白周围所形成的去污剂带是脂质双层拙劣的取代物，因为丧失了周围脂质施加于蛋白的许多侧压。因此，膜蛋白的溶解经常导致不稳定、解折叠以及随后的聚集。除了视紫红质外GPCR通常在去污剂中具有拙劣的稳定性，并且易于聚集和蛋白水解。完整膜蛋白的其他固有特性已经使晶体GPCR的努力受挫。GPCR的7个疏水跨膜螺旋为晶体接触产生了拙劣的表面，并且细胞外和细胞内结构域经常是相对短的和/或拙劣结构化的。除了视紫红质(在天然丰度和稳定性方面非典型GPCR)夕卜，从结合Fab片段的β 2AR获得GPCR的第一晶体，所述Fab片段识别由连接TMs5和6的第三细胞内环的氨基和羧基末端构成的表位(Rasmussen, 2007)。在第二种方法中,第三细胞内环被T4溶菌酶取代(i32AR-T4L; Rosenbaum，2007)。最后，GPCR作为信号传导分子的非凡多功能性可归因于其韧性且动态的三维结构。遗憾的是，这类动态行为对于高分辨率结构分析而言特别富有挑战性。生长衍射质量的晶体需要稳定的构象上均质的蛋白。因此，天然的未结合的GPCR的衍射质量的晶体难以获得，并且即使实现这一目标时，晶体结构也仅仅代表了许多天然构象中的一种。通过使用蛋白结合结构域特别是是纳米抗体作为稳定、纯化以及结晶GPCR的具体构象状态的工具，用于高分辨率结构分析，本发明解决了这些问题中的许多问题。因此，本发明的目标是，利用蛋白结合结构域作为稳定GPCR蛋白的工具，并进一步利用这些蛋白结合结构域作为GPCR共同结晶的辅助物，或换而言之，促进优选处于功能构象状态的GPCR的晶体发生。因此，本发明的第四方面涉及本发明的蛋白结合结构域或在具体实施方案中包含蛋白结合结构域的复合体或提供蛋白结合结构域的细胞组合物的以下用途:稳定功能构象状态、特别是活性构象状态的GPCR ;和/或在GPCR中诱导具体构象(优选活性)构象状态的形成。应当认识到，此类蛋白结合结构域是纯化、结晶和/或解析功能构象状态、特别是活性构象状态的GPCR的非常有用的工具。如在上文所清楚概述的，应当明确的是，本发明的蛋白结合结构域用于纯化、稳定、结晶和/或解析GPCR的结构，其可以针对任何期望的GPCR，并且可以特异性结合或识别任何期望的GPCR的功能构象状态、优选活性构象状态的构象表位。特别是，所述构象表位可以是任何期望的GPCR的部分细胞内或细胞外区域或膜内区域或结构域或环结构。首先，本发明的蛋白结合结构域可以增强去污剂增溶的受体的热稳定性，稳定具体构象状态，保护它们免于蛋白水解降解和/或聚集，并促进正确折叠的受体的均质样品纯化和浓缩。本领域普通技术人员应当认识到，这类样品是用于产生衍射晶体的优选起始点。纯化的受体的结晶是利用X-射线晶体学处理大分子结构的另一瓶颈。成功结晶需要形成核心以及它们随后生长成合适大小的晶体。由于均质成核作用，晶体生长通常在超饱和溶液中同时发生。在典型的稀疏矩阵筛选实验中可以结晶蛋白，其中对沉淀、添加剂以及蛋白浓度广泛取样，并且可以为具体蛋白确定适合成核和晶体生长的超饱和条件。在蛋白自身中产生结构变化，与稀疏矩阵筛选方法有关，例如通过添加结合蛋白的配体，或通过优先在靶蛋白的表面残基中产生不同突变，或通过尽力结晶靶蛋白的不同种类直系同源物(Changl998)。本发明的一个意料不到的发现是蛋白结合结构域如纳米抗体的用处，即其特异性结合GPCR，从而在结合后引入一定程度的结构变化，同时防止GPCR完全折叠。不同的纳米抗体会产生不同的四级结构，从而为晶格形成提供新的不同界面，导致多晶体形成同时防止GPCR完全折叠。因为结晶涉及待组装于晶格中的分子内构象熵的不利丧失，因此，降低靶标的构象熵同时仍然在溶液中的方法，应当通过降低晶格形成的净熵罚来增强结晶的可能性。已经证明‘表面熵降低’方法是高效的(DereWenda2004)。同样，结合伴侣，如离子、小分子配体以及肽，可以通过结合并稳定蛋白的子集构象状态而降低构象异质性。尽管这类结合伴侣是有效的，但是并非所有蛋白都具有已知的结合伴侣，并且即使结合伴侣是已知的，其亲和性、溶解性以及化学稳定性可能与结晶试验不相容。因此，令人惊讶地发现，本发明的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，可以用作通过结合受体的具体构象最小化靶GPCR中的构象异质性而增大获得井然有序的晶体概率的工具。用于高分辨率结构研究的GPCR结晶之所以特别困难，是因为这些膜蛋白的两亲表面。由于包埋于膜双层中，蛋白与磷脂的酰基链的接触位点是双亲的，而极性表明暴露于脂质的极性头基，并暴露于水相。为了获得井然有序的三维晶体一高分辨率X射线结构分析的先决条件一使GPCR在去污剂的帮助下增溶，并作为蛋白-去污剂复合体纯化。去污剂去污剂胶束以带样方式覆盖膜蛋白的疏水表明(Hunte and Michel2002;Ostermeier etal.1995)。GPCR-去污剂复合体形成三维晶体，其中，相邻蛋白分子之间的接触由从去污剂胶束突出的蛋白的极性表面产生(Day et al.2007)。显然，去污剂胶束在晶格中需要空间。尽管胶束之间有吸引力的相互作用可能稳固晶体包装(Rasmussen et al.2007;Dunnet al.1997)，但是这些相互作用不导致刚性晶体接触。因为许多膜蛋白，包括GPCR，都含有相对小或高韧性亲水结构域，因此增大获得井然有序的晶体概率的策略是扩大蛋白的极性表面和/或降低它们的韧性。因此，本发明的纳米抗体可以用于扩大蛋白的极性表面，从而补充可以在晶格分子之间促进直接接触(primary contact)的蛋白表面的数量。本发明的纳米抗体还可以降低其细胞外区域的韧性，从而生长井然有序的晶体。纳米抗体特别适合这种目的，因为它们由单个刚性球状结构域组成，并且缺少韧性连接区，这与常规抗体或其来源的片段如Fab不同。
在本发明的另一实施方案中，包含本发明的蛋白结合结构域和功能构象状态、优选活性构象状态的靶GPCR的复合体，可以利用用于膜蛋白的多种专门结晶方法中的任意方法结晶，所述方法中有许多方法在Caffrey(2003)中做了综述。一般而言，所述方法是基于脂质的方法，其包括在结晶之前将脂质添加于GPCR纳米抗体复合体。以前用这类方法结晶其他膜蛋白。这些方法，包括脂质立方相结晶方法和Bicelle结晶方法，其中有许多方法利用作为泡(泡-融合方法)、盘状束胶(Bicelle方法)和脂质晶体或中间相(内消旋或立方相方法中)的脂质和去污剂的自发的自我组装特性。脂质立方相结晶方法描述于例如:Landau et al.1996;Gouaux 1998; Rummel et al.1998 ;Nollert et al.2004,上述出版物通过援引并入，用于公开这些方法。Bicelle结晶方法描述于例如:Faham et al.2005;Fahamet al.2002，该出版物通过援引并入，用于公开这些方法。根据另一实施方案，本发明还包括上文所述的蛋白结合结构域解析GPCR的结构的用途。蛋白、特别是GPCR的结构，包括所述蛋白的一级结构、二级机构、三级结构以及若适用四级结构。本文所用的“解析结构”指测定蛋白的原子或原子坐标的排列，并经常通过诸如X-射线晶体学的生物物理学方法进行。在X-射线晶体学中，当适当组合时衍射数据给出了晶胞中分子电子密度的3D傅里叶变换。如果相是已知的，可以通过傅里叶综合简单获得电子密度。对于蛋白复合体，当结构已知的蛋白的级分(研究模型)低(小于氨基酸含量的50%)和/或当晶体表现出有限的衍射质量时，仅由分子置换(MR)成功导出相信息是有问题的。尽管多重同晶置换(MIR)和MR定相的组合已经证明对于蛋白复合体是成功的(如Ostermeier et al.1995; Li etal.1997; Hunte et al.2000)，但是产生优良的重原子衍生物的要求几乎总是个问题。在过去的十年中，通常利用硒代蛋氨酸(SeMet)并入(MAD或SAD)，用反常色散数据取代经典MIR方法(Hendricksonl991)。实际上，与MIR或基于模型的MR定相数据相比，利用Se-边缘能量的反常实验数据通常提供优越且偏爱性更少的相信息。本发明的一实施方案涉及纳米抗体通过MR或MAD定相GPCR-纳米抗体复合体的用途。纳米抗体通常强烈表达并适合SeMet并入。通过仅在纳米抗体中引入所有SeMet位点定相GPCR纳米抗体避免了在GPCR中并入SeMet位点的需要。在许多情况下，获得衍射质量晶体是解析其原子分辨率结构的主要障碍。因此，根据具体实施方案，上文所述的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，可以用于改善晶体的纳米质量，以便可以解析GPCR蛋白晶体结构。对有助于指导GPCR药物发现的结构信息有浓厚兴趣。对于结构已经解析的GPCR，已经证明这些建模努力在电子药物设计者所需的水平上是不精确的。用i32AR、P1AR以及A2A受体的非活性状态结构，药物化学家现在具有指导研发用于数个活性治疗靶标的配体的实验数据。然而，用于电子筛选的这些高分辨率结构的价值是有限的。利用P2AR晶体结构作为模板，最近的分子对接研究鉴定了 6个以9nM至4 μ M的亲和性结合的新β 2AR配体；然而，每个化合物都表现出反向激动剂活性。除了结晶更多的GPCR外，必须研发获得受体结构的方法，所述受体结合于不同类别的配体，包括激动剂、拮抗剂、变构调节剂和/或G蛋白。例如，激动剂结合的受体晶体可以提供GPCR活性状态的三维表述。这些结构会有助于阐明连接配体结合和G蛋白相互作用位点的构象变化，并导致更准确的机械假说以及最终新疗法。鉴于配体激活的GPCR固有的构象韧性和激动剂结合的受体表现出的更大的异质性，稳定这一状态并不容易。这类努力可以从通过添加对受体的活性构象状态具有特异性的蛋白结合结构域稳定激动剂结合的受体构象而获益。特别适合的是，如本发明所提供的，表现出G蛋白样行为并且表现出有关激动剂结合的合作特性的纳米抗体(参见实施例部分)。因此，本发明还提供了测定功能构象状态的GPCR的晶体结构的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供本发明的蛋白结合结构域、靶GPCR，以及任选存在的受体配体，和(ii)形成蛋白结合结构域、GPCR以及任选存在的受体配体的复合体，以及(iii)结晶步骤(ii)的所述复合体，从而形成晶体，其中测定功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR的晶体结构。所述测定晶体结构，可以通过诸如X-射线晶体学的生物物理学方法进行。所述方法还可以包括获得晶体的原子坐标(如上文所限定)的步骤。
_7] 捕获和/或纯化功能构象状态的GPCR还在另一实施方案中，本发明提供了通过利用任何上述蛋白结合结构域或包含此类蛋白结合结构域的复合体或细胞组合物捕获和/或纯化功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR的方法。根据本发明，捕获和/或纯化功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR，会允许随后结晶、配体表征和化合物筛选、免疫等。在实践上，这类方法和技术包括但不限于基于亲和性的方法如亲和层析、亲和纯化、免疫测定、蛋白检测、免疫化学、表面展示等，并且是本领域技术人员熟知的。因此，在具体实施方案中，本发明涉及，本发明的蛋白结合结构域或如上文所述包含所述蛋白结构域的复合体或细胞组合物捕获功能构象状态的GPCR、优选捕获活性构象状态的GPCR的用途。任选地，但并非必需，如上文所述，捕获功能构象状态的GPCR可以包括捕获与受体配体或一个或多个下游相互作用蛋白复合的功能构象状态的GPCR。因此，本发明还提供了捕获功能构象状态的GPCR的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供本发明的蛋白结合结构域和靶GPCRJP(ii)形成蛋白结合结构域与GPCR的复合体，其中以功能构象状态、优选活性构象状态捕获GPCR。更具体而言，本发明还考虑了捕获功能构象状态的GPCR的方法，所述方法包括以下步骤:(i)将含有多种构象状态的GPCR的溶液应用于具有固定化的本发明的蛋白结合结构域的固相支持物，和(ii)形成蛋白结合结构域与GPCR的复合体，以及(iii)除去弱结合或未结合的分子，其中以功能构象状态、优选活性构象状态捕获GPCR。应当认识到，任何上述方法都还可以包括纯化蛋白结合结构域与功能构象状态的GPCR的复合体的步骤。治疗和i会断应用传统上，小分子用于研发针对GPCR的药物，不但是因为制药公司具有用这些小分子工作的历史原因，而且更重要的是，由于家族IGPCR的结构限制，家族IGPCR在跨膜裂缝中具有配体结合位点(Nat Rev Drug Discov.(2004) The stateof GPCR research in2004.Nature Reviews Drug Discovery GPCR QuestionnaireParticipants3(7):575, 577-626)。由于这一原因，难以或不可能产生抗这种靶标类别的单克隆抗体。本发明的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，借助它们通过CDR环延伸到腔中结合的固有特性，可以解决这一特殊难题。因此，本发明的第五方面涉及包含治疗有效量的本发明的蛋白结合结构域和至少一种药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。‘载体’或‘佐剂’、特别是‘药学上可接受的载体’或‘药学上可接受的佐剂’是本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生也不诱发保护的任何合适的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂。因此，药学上可接受的载体是先天无毒性的且是非治疗性的，并且它们是本领域技术人员已知的。合适的载体或佐剂通常包含包括于下述非详尽清单中的一种或多种化合物:大的缓慢代谢的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物以及非活性病毒颗粒。作为非限制性实例，载体或佐剂可以是林格氏溶液、葡萄糖溶液或汉克溶液(Hank’s solution)。也可以使用非水性溶液,如不挥发油和油酸乙酯。优选的赋形剂是5%葡萄糖盐水。赋形剂可以含有少量添加剂，如可以增强等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲剂和防腐剂。施用本发明的蛋白结合结构域或其药物组合物，可以通过口服、吸入或胃肠外给药的方式。在具体实施方案中，通过鞘内或脑室内给药送递蛋白结合结构域。可以单独施用活性化合物，或优选将其配置成药物组合物。有效治疗表达所述蛋白结合结构域所识别的抗原的某些疾病或病症的量，取决于常见因素，如正治疗的病症的属性和严重性以及哺乳动物的重量。然而，单位剂量的范围通常是0.1mg至lg、例如0.l-500mg、例如0.l_50mg或0.l_2mg蛋白结合结构域或其药物组合物。单位剂量的给药通常是一月一次，一周、两周一次，一天一次或多次，例如一天2、3或4，更通常是一天1-3次。非常优选的是，蛋白结合结构域或其药物组合物以单位剂量组合物的形式施用，例如单位剂量口服、胃肠外或吸入组合物的形式。这类组合物通过混合制备，合适地适合口服、吸入或胃肠外给药，并且因此可以采用片剂、胶囊、口服液体制剂、粉剂、颗粒、锭剂、可复水粉剂、可注射或输注溶液或悬浮液或栓剂或气雾剂形式。用于口服给药的片剂和胶囊通常以单位剂量的形式存在，并且含有常规赋形剂，如结合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂以及湿润剂。可以根据本领域公知的方法涂覆片剂。供使用的合适填充剂包括纤维素、甘露醇、乳糖以及其他相似试剂。合适的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮以及淀粉衍生物，如淀粉乙醇酸盐。合适的润滑剂包括例如硬脂酸镁。合适的药学上可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸盐。这些固体口服组合物可以通过混合、填充、压片等常规方法制备。重复的混合操作可以用于利用大量填充剂在这些组合物中分布活性剂。当然，这类操作在本领域中是常见的。口服液体制剂可以采用以下形式:例如水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏齐U，或可以作为在使用前用水或其他合适的媒介重构的干产品呈现。这类液体制剂可以含有常见的添加剂，如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化的食用脂肪，乳化剂，如卵磷脂、山梨醇单硬脂酸酯或阿拉伯胶；非水性媒介(其可以包括食用油)，例如杏仁油，分馏椰子油，油酯，如丙三醇、丙二醇或乙醇的酯；防腐剂，例如甲基或丙基P-羟苯酸酯或山梨酸，并且如果需要，常见的调味剂或着色剂。口服制剂还可以包括常见的缓释制剂，如具有肠溶衣的片剂或颗粒。优选地，为了给药，将用于吸入的组合物作为喷雾器的鼻烟、去污剂或溶液或作为用于吸入的超细粉剂，单独或与诸如乳糖的惰性载体组合呈递到呼吸道。在这一情况下，活性化合物的颗粒所具有的合适直径小于50微米、优选小于10微米，例如1-5微米，如2-5微米。有利的吸入剂量的范围为0.05-2mg，例如0.05-0.5mg、0.1-1mg或0.5_2mg。对于胃肠外给药，制备含有本发明的化合物和无菌媒介的流体单位剂量形式。可以将活性化合物悬浮或溶解，这取决于媒介和浓度。胃肠外溶液通常以下方式制备:将化合物溶解于媒介中、过滤灭菌、填充到合适的小瓶或安瓿中并密封。有利的是，也可以将诸如局部麻醉剂、防腐剂以及缓冲剂溶解于媒介中。为了增强稳定性，在填充到小瓶中后可以将组合物冷冻，并真空除去水。以基本上相同的方式制备胃肠外悬浮液，不同之处在于，将所述化合物悬浮于媒介中，而不是在悬浮于无菌媒介前通过暴露于环氧乙烷溶解并灭菌。有利的是，将表面活性剂或湿润剂包括于组合物内，以促进活性化合物的均匀分布。如果合适，可以包括小量支气管扩张剂，例如拟交感胺，如异丙肾上腺素、新异丙肾上腺素、柳丁氨醇、苯肾上腺素以及麻黄碱；黄嘌呤衍生物，如茶碱和氨茶碱，和皮质类固醇，如强的松龙，以及肾上腺刺激剂如ACTH。正如常规实践，所述组合物通常会伴随有书面或打印的有关医疗的使用说明。将蛋白结合结构域、特别是纳米抗体送递到细胞内，可以按针对肽、多肽和蛋白所述进行。如果抗原是细胞外的或是细胞结构域，则蛋白结合结构域可以通过结合该结构域而发挥其功能，不必需要细胞内送递。如本文所述，本发明的蛋白结合结构域可以靶向目的GPCR的细胞内构象表位。为了在细胞内作为有效且安全的治疗剂使用这些蛋白结合结构域，细胞内送递可以通过本领域已知的蛋白转导或送递系统来增强。蛋白转导结构域(PTDs)在药物送递领域已经引起了相当大兴趣，因为其能跨生物膜转移。PTD是相对短(1-35个氨基酸)的序列，其赋予与它们缀合、复合或融合的蛋白和其他大分子货物这种表面转移活性(Sawant and Torchilin2010)。例如，HIV来源的 TAT 肽(YGRKKRRQRRR)已经广泛用于各种试剂的细胞内送递，范围从小分子到蛋白、肽、药用纳米载体系列以及显像剂。可选地，受体介导的内吞机制也可以用于细胞内药物送递。例如，运铁蛋白受体介导的内在化通路是有效的细胞吸收通路，其已经被开发用于药物和蛋白的位点特异性送递(Qian etal.2002)。这通过以化学方式将运铁蛋白与治疗药物或蛋白缀合或以基因方式将治疗肽或蛋白融合于运铁蛋白的结构中而实现。天然存在的蛋白(离子结合蛋白运铁蛋白)在药物靶向这一领域非常有用，因为这些蛋白是生物可降解的、无毒并且是非免疫原性的。而且，它们可以实现位点特异性靶向，由于它们的大量受体存在于细胞表面。尽管如此，其他送递系统包括但不限于基于多聚体和脂质体的送递系统。本发明的蛋白结合结构域和包含其的组合物的功效，可以利用任何合适的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型或上述的任何组合来测试，这取决于所涉及的具体疾病或病症。本发明的第六方面涉及上文所述的蛋白结合结构域或药物组合物调节GPCR信号传导活性的用途。本文所述的本发明的蛋白结合结构域可以结合GPCR，以便激活或增强受体信号传导；或可选地以便降低或抑制受体信号传导。本发明的蛋白结合结构域还可以以阻挡GPCR的组成性活性的方式结合GPCR。本发明的蛋白结合结构域还可以以介导变构调节的方式(如在变构位点结合GPCR)结合GPCR。以这种方式，本发明的蛋白结合结构域可以通过结合受体的不同区域(如在变构位点)而调节受体功能。例如参考George et al.(2002)、Kenakin (2002)和Rios et al.(2001)。本发明的蛋白结合结构域还可以以延长GPCR介导的信号传导的持续时间或通过增强受体-配体亲和性增强受体信号传导的方式结合GPCR。此外，本发明的蛋白结合结构域还可以以抑制或增强GPCR功能同聚体或异聚体组装的方式结合GPCR。在一具体实施方案中，上文所述的蛋白结合结构域或药物组合物阻断G蛋白介导的信号传导。在另一实施方案中，本发明还考虑了上文所述的蛋白结合结构域或药物组合物，其用于治疗GPCR相关疾病如癌症、自身免疫病、传染病、神经病、心血管疾病。某些上文所述的蛋白结合结构域可以具有治疗用途并且可以给予患有疾病状况的个体，以便治疗所述个体的疾病状况。蛋白结合结构域的治疗用途可以利用所述蛋白结合结构域结合的GPCR确定，因为通过所述GPCR的信号传导与所述疾病状况有关。在某些情况下，通过结合配体，GPCR可以在疾病状况中激活。在其他实施方案中，例如可以突变GPCR，从而使得其具有组成性活性。可以使用主题蛋白结合结构域治疗GPCR介导的疾病状况，如精神分裂症、偏头痛、反流、哮喘、支气管痉挛、前列腺肥大、溃疡、癫痫、心绞痛、变态反应、鼻炎、癌症如前列腺癌、青光眼以及中风。在线人类孟德尔遗传学数据库的其他实例性GPCR相关疾病状况见于NCBI的万维网。因此，本发明的具体实施方案还考虑了蛋白结合结构域或药物组合物用于治疗GPCR相关疾病或病症的用途。在更具体的实施方案中，蛋白结合结构域可以结合β 2-肾上腺素能受体，在这种情况下，其可以用于治疗需要释放子宫或血管系统的平滑肌的疾病状况。因此这种蛋白结合结构域可以用于预防或缓解妊娠早产疼或治疗慢性或急性哮喘、荨麻疹、牛皮癣、鼻炎、变应性结膜炎、痤疮疹、枯草热或肥大细胞增多症，上述疾病状况都与β 2-肾上腺素能受体有关。在这些实施方案中，蛋白结合结构域可以用作共治疗剂，供与其他药物联合使用，所述其他药物如抗炎药、支气管扩张药或抗组胺药物，特别是用于治疗气道阻塞性或炎性疾病，如上文提到的那些，例如作为这类药物治疗活性的增效剂，或作为降低这类药物所需的剂量给药或潜在副作用的手段。主题蛋白结合结构域可以与其他药物一起混合于固定型药物组合物中，或其可以在其他药物之前、与其同时或在其之后单独施用。一般而言，这些规程涉及施用患有GPCR相关疾病或病症的个体有效量的调节GPCR的蛋白结合结构域，以调节宿主的GPCR并治疗所述个体的病症。在一些实施方案中，如果期望降低某一 GPCR活性，则可以施用降低GPCR活性的一种或多种化合物，而当期望增强某一 GPCR的活性时，可以施用增强GPCR活性的一种或多种化合物。根据主题方法，许多个体是可以治疗的。通常这类个体是哺乳类或哺乳动物，其中这些术语广泛用于描述哺乳类中的有机体，包括食肉动物目(如狗和猫)、啮齿目(如小鼠、豚鼠以及大鼠)以及灵长目(如人、黑猩猩以及猴子)。在许多实施方案中，所述个体是人。通常对患有这类病症的个体或对期望避免这类症状的个体实施主题治疗方法。还根据另一实施方案，本发明的蛋白结合结构域或复合体还可以用于GPCR相关疾病的诊断或预后，如癌症、自身免疫病、传染病、神经病、心血管疾病。选择性靶向功能构象状态的GPCR的化合物的鉴定在化合物筛选、先导物优化以及药物发现过程中，要求更快速、更有效、比较便宜且信息特别丰富的筛选测定，其同时提供各种化合物特征及其它们对各种细胞通路影响的信息(即功效、特异性、毒性以及药物代谢)。因此，需要快速且廉价地筛选大量化合物，以便鉴定目的GPCR的新的特异性配体，优选构象特异性配体，所述配体可能是潜在的新的药物候选者。本发明通过提供蛋白结合结构域解决了这一问题，所述蛋白结合结构域稳定和/或锁定功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR，并随后可以用作免疫原或选择试剂，供在多种环境中筛选之用。本发明蛋白结合结构域的主要优势在于，可以将GPCR保持于稳定的功能构象、优选活性状态构象中。例如，选择性结合受体的这种活性构象的文库化合物具有较高的举止像激动剂的倾向，因为GPCR活性状态的正位或变构稳定诱发生物应答。另一优势在于，蛋白结合结构域增强GPCR活性构象的热稳定性，因此保护GPCR防止化合物筛选和药物发现所用的非天然条件所诱发的不可逆变性或热变性，而不需要依赖稳定性增强的突变GPCR。本发明的构象选择性蛋白结合结构域的另一优势在于，它们允许快速且可靠地筛选并区分GPCR和GPCR依赖性通路的受体激动剂、反向激动剂、拮抗剂和/或调节剂以及抑制剂，从而增大鉴定具有期望的药理特性的配体的可能性。为了进一步说明这一点，一个完全确定的概念是，当与G蛋白复合时，大多数GPCR都表现出较高的激动剂结合亲和性。这归因于激动剂占据的受体与G蛋白之间的协同相互作用(Delean et al.1980)。本发明的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，能稳定GPCR的活性构象状态(并因此表现出G蛋白样行为)，并使非活性构象状态不稳定，从而增强GPCR对激动剂的亲和性而降低对反向激动剂或拮抗剂的亲和性。结果是，识别GPCR活性功能构象的本发明的蛋白结合结构域，如纳米抗体，可有效地用于高通量筛选测定中，用来筛选激动齐U，因为相对于反向激动剂或拮抗剂它们增强受体对激动剂的亲和性。稳定GPCR非活性状态构象的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，会相互增强对反向激动剂或拮抗剂的亲和性，并降低对激动剂的亲和性。这类蛋白结合结构域可以例如用于筛选反向激动剂。因此蛋白结合结构域、特别是纳米抗体，其识别具体具体功能构象状态从而以互惠方式调节对激动剂和反向激动剂的亲和性，形成了本发明的一部分。因此，根据优选的实施方案，本发明包括上文所述的蛋白结合结构域或复合体或细胞组合物在筛选和/或鉴定GPCR的构象特异性结合伴侣程序中的用途，这最终可能导致潜在的新药物候选者。根据一实施方案，本发明考虑了鉴定能选择性结合GPCR的功能构象状态的化合物的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供本发明的GPCR和能特异性结合所述GPCR的功能构象状态的蛋白结合结构域,和(ii)提供测试化合物，和(iii)评估测试化合物是否结合功能构象状态的GPCR，以及(iv)选择特异性结合功能构象状态的GPCR的化合物。优选地，上述方法还包括形成复合体的步骤，所述复合体包含所述蛋白结合结构域和功能构象状态、更优选活性构象状态的GPCR。
因此，本发明还考虑了鉴定能特异性结合功能构象状态的GPCR的化合物的方法，所述方法包括以下步骤:⑴提供包含本发明的蛋白结合结构域和功能构象状态的GPCR的复合体，和(ii)提供测试化合物，和(iii)评估测试化合物是否结合功能构象状态的GPCR，以及(iv)选择结合功能构象状态的GPCR的化合物。优选地，任一上述方法所用的蛋白结合结构域能在结合后稳定和/或诱导GPCR的功能构象状态。优选地，所述GPCR的功能构象状态选自基础构象状态或活性构象状态或非活性构象状态(如上文所限定)。最优选地，所述GPCR的功能构象状态是活性构象状态。在一其他优选的实施方案中，任一上述筛选方法所用的蛋白结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4个构架区和3个互补决定区或其任何合适的片段。优选地，所述蛋白结合结构域来源于骆驼抗体。更优选地，所述蛋白结合结构域包含纳米抗体序列或其任何合适的片段。特别是，所述纳米抗体包含选自SEQ ID NO: 1-29的序列或其任何合适的片段。对于蛋白结合结构域和/或复合体的他优选选择，如上文针对本发明的第一方面和第二方面所限定。在优选的实施方案中，提供了任一上述筛选方法所用的蛋白结合结构域、GPCR或包含蛋白结合结构域和GPCR的复合体，作为全细胞或细胞(细胞器)提取物如膜提取物或其组分，或可将它们并入脂质层或泡(包含天然和/或合成脂质)、高密度脂质粒或任何纳米颗粒如纳米盘，或作为VLP提供，以便保留各自蛋白充分的功能性。由膜片段或膜去污剂提取物形成的GPCR的制剂在Cooper (2004)中详细做了综述，其在此通过援引并入。可选地，GPCR和/或复合体还可以溶解于去污剂中。溶解的受体制剂的非限制性实例还进一步提供于实施例部分这中。高通量筛选构象特异性结合伴侣的靶GPCR是优选的。将本发明的蛋白结合结构域、功能构象状态的GPCR或包含它们的复合体固定化于可以排列或多路复用的合适的固体表面或固相支持物，会促进这一点。合适的固相支持物的非限制性实例包括珠、柱、芯片或平板。更具体而言，固相支持物可以是颗粒(如通常用于提取柱中的珠或颗粒)或采用薄片形式(如膜或滤器，玻璃或塑料载玻片，微量滴定测定板、试纸、毛细管填充装置等)，所述薄片可以是平的、打褶的或中空纤维或管。给出下述基材作为实例，并非限制这类实例可以包括娃石(多孔无定形娃石)，即即Biotage (Dyax Corp.的分支)供应的FLASH系列的含有60A不规则硅石的盒(32-63um或35_70um)，琼脂糖或聚丙烯酰胺支持物，例如Amersham Pharmacia Biotech 供应的 S印harose 系列产品或Bio-Rad供应的 Aff i_GeI 支持物。另外，存在大孔多聚体，如Bio-Rad供应的压力稳定的Aff1-Prep支持物。可以使用的其他支持物包括葡萄糖、胶原蛋白、聚苯乙烯、甲基丙烯酸酯、藻酸钙、可控孔径玻璃、铝、钛和多孔陶瓷。可选地，固体表面可以包含部分质量依赖性传感器，例如表面等离子共振检测器。商业上可获得的支持物的其他实例讨论于例如Protein Immobilisation, R.F.Taylored.., Marcel Dekker, Inc., New York, (1991)中。固定可以是非共价的或共价的。特别是，根据技术人员已知的标准技术，将本发明的蛋白结合结构域、GPCR或包含所述蛋白结合结构域和所述GPCR的复合体非共价固定或吸附于固体表面，可以通过用任何抗体或链霉亲和素或亲和素或金属离子涂覆的表面发生，从而识别连接于所述蛋白结合结构域或GPCR的分子标签(如生物素标签、组氨酸标签
坐')
寸/ ο特别是，本发明的蛋白结合结构域、GPCR或包含所述蛋白结合结构域和所述GPCR的复合体，可以通过共价交联，利用常规偶联化学，连接于固体表面。固体表面可以天然包含适合共价连接的可交联残基，或其可以根据本领域熟知的方法经涂覆或衍生而引入合适的可交联基团。在一具体实施方案中，在通过不含有化学间隔臂的反应部分直接共价偶联于期望的基材后，可以保持固定的蛋白的充分功能。有关将抗体(片段)固定化于固相支持物上的方法的其他实例和更详细信息，讨论于Jung et al.(2008);同样，膜受体固定方法的综述见于Cooper (2004);在此将两者通过援引并入。分子生物学的进展，特别是通过定点诱变，能突变蛋白序列中的特定氨基酸残基。将特定氨基酸(在具有已知的或推断的结构的蛋白中)突变成赖氨酸或半胱氨酸(或其他期望的氨基酸)，例如，可以为共价偶联提供特定位点。还有可能的是，再改造特定蛋白以改变参与化学偶联的表面可用氨基酸的分布(Kallwass et al，1993)，从而有效控制或定位偶联的蛋白。可以将相似方法应用于本发明的蛋白结合结构域以及构象稳定的GPCR，无论其是否包含在复合体中，从而提供定向固定的手段，而无需添加含有天然或非天然氨基酸的其他肽尾或结构域。在抗体或抗体片段如纳米抗体的情况下，优选在构架区中引入突变，从而使对抗体(片段)抗原结合活性的破坏最小。便利的是，根据本领域常见的标准方法，通过将本发明的固定的蛋白与测试样品接触，可以将所述固定的蛋白用于诸如免疫测定的免疫吸附过程，例如ELISA，或免疫亲和纯化过程中。可选地，并且特别是对于高通量目的而言，固定的蛋白可以是排列的或多路复用的。优选地，本发明的固定的蛋白可以用于筛选和选择特异性结合功能构象状态的GPCR、特别是活性构象状态的GPCR的化合物。应当认识到，可以固定蛋白结合结构域或功能构象状态的GPCR或包含所述蛋白结合结构域和所述GPCR的复合体，这取决于应用的类型或需要进行的筛选类型。同样，选择GPCR稳定蛋白结合结构域(靶向GPCR的具体构象表位)，会决定GPCR的定向，并因此决定期望的化合物鉴定结果，如特异性结合所述构象稳定的GPCR的细胞外部分、膜内部分或细胞内部分的化合物。在可选的实施方案中，可以将测试化合物(或测试化合物文库)固定化于固体表面，如芯片表面，而将蛋白结合结构域、GPCR或复合体提供于例如去污剂溶液中或膜样制剂中。最优选地，蛋白结合结构域、GPCR、测试化合物都是不固定的，例如在溶液噬菌体展示选择方案中或在放射性配体结合测定中。可以用各种方法测定固定的GPCR与测试化合物之间的结合，包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子共振测定、基于芯片的测定、免疫荧光细胞、酵母双杂交技术以及卩遼菌体展示，和是本领域的常规实践，例如在Sambrook et al.(2001), MolecularCloning,A Laboratory Manual.Third Edition.Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY中。检测测试化合物与GPCR之间结合的其他方法包括用离子喷雾质谱/HPLC方法或其他(生物)物理和分析方法进行超滤。例如，也可以使用本领域技术人员熟知的荧光能量共振转移(FRET)方法。应当认识到，结合的测试化合物可以利用与所述化合物结合的独特标记或标签来检测，所述标记或标签如肽标记、核酸标记、化学标记、突光标记或射频标签，如本文进一步所述。除了建立与功能构象状态的GPCR的结合，还期望测定化合物对GPCR的功能影响。特别是，本文所述的蛋白结合结构域或复合体或细胞组合物可以用于筛选调节(增强或降低)GPCR的生物学活性的化合物。期望的生物学活性调节会取决于所选的GPCR。待测试的化合物可以是任何小化学化合物或大分子，如蛋白、糖、核酸或脂质。通常，测试化合物会是小化学化合物、肽、抗体或其片段。应当认识到，在有些情况下，优选高通量筛选测试化合物，并且可以利用上文所述的方法作为“库筛选”方法，其是本领域技术人员熟知的术语。因此测试化合物可以是测试化合物文库。特别是，治疗化合物，如激动剂、拮抗剂或反向激动剂和/或调节剂的高通量筛选测定，形成了本发明的一部分。出于高通量目的，可以使用化合物文库，如变构化合物文库、肽文库、抗体文库、基于片段的文库、合成化合物文库、天然化合物文库、噬菌体展示文库等。制备和筛选这类文库的方法，在本领域中是已知的。在一优选的实施方案中，高通量筛选方法涉及提供含有大量潜在治疗配体的组合化学品或肽文库。随后如本文所述，在一个或多个测定中筛选这类“组合文库”或“化合物文库”，以鉴定展示了期望的特征活性的文库成员(具体化学种类或亚类)。“化合物文库”是通常最后用于高通量筛选的储存的化学品集合。“组合文库”通过组合物许多化学“构件”如试剂、利用化学合成或生物合成所产生的多种化学化合物的集合。制备和筛选组合文库，是本领域技术人员熟知的。由此鉴定的化合物可以作为常规的“先导化合物”或自身可以用作潜在的或实际治疗剂。因此，在一深一层的实施方案中，如上文所述的筛选方法还包括，修饰已经证明结合功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR的测试化合物，并确定所述修饰的测试化合物当存在于具体构象中时是否结合GPCR。在具体实施方案中，提供测试化合物作为生物样品。特别是，样品可以是采集自个体的任何合适样品。例如，样品可以是体液样品如血样、血清、血浆、脊髓液。可选地，样品是组织或细胞提取物。所述化合物可以结合靶GPCR，导致GPCR的生物功能、特别是下游受体信号传导受到调节(激活或抑制)。GPCR信号传导的这种调节，可以正位或变构发生。所述化合物可以结合靶GPCR，以便激活或增强受体信号传导；或可选地以便降低或抑制受体信号传导。所述化合物还可以以阻挡GPCR的组成性活性的方式结合靶GPCR。所述化合物还可以以介导变构调节(如在变构位点结合GPCR)的方式结合靶复合体。以这种方式，所述化合物可以通过结合GPCR的不同区域(如在变构位点)调节受体功能。例如参考George etal.(2002), Kenakin (2002)和Rios et al.(2001)。本发明的化合物还可以以延长GPCR介导的信号传导的持续时间或以通过增强受体-配体亲和性增强受体信号传导的方式结合靶GPCR。此外，所述化合物还可以以抑制或增强GPCR功能同聚体或异聚体组装的方式结合靶复合体。在一实施方案中，确定所述化合物是否改变了 GPCR与受体配体(如上文所限定)的结合。GPCR与其配体的结合可以利用本文所述本领域已知的标准配体结合方法测定。例如，配体可以是放射性标记的或荧光记的。可以对全细胞或或对从细胞获得的膜或水溶解的受体用去污剂进行所述测定。所述化合物的特征是，其能改变标记的配体的结合(还参见实施例部分)。所述化合物降低GPCR与其配体之间的结合，或可以将GPCR与其配体之间的结合提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍。因此，根据更具体的实施方案，任何上述筛选方法所用的复合体还包含受体配体。优选地，受体配体选自小分子、多肽、抗体或其来源的任何片段、天然产物等。更优选地，受体配体是上文所述的完全激动剂或部分激动剂或反向激动剂或拮抗剂。根据具体实施方案，本发明的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，还可以用于先导化合物鉴定(lead identification)和肽模拟物设计。利用生物相关肽或蛋白结构作为用于先导化合物鉴定的起始点，代表了现代药物发现的最有效的方法之一。肽模拟物是这样的化合物，其基本要素(药效团)在3D空间中模拟天然肽或蛋白，并且其保留了与生物靶标相互作用并产生相同的生物作业的能力。设计肽模拟物，从而避免一些与天然肽有关的问题:例如针对蛋白水解的稳定性(活性持续时间)和拙劣的生物利用率。某些其他特性，如受体选择性或能力，经常可以获得实质改善。作为非限制性实例，本发明的纳米抗体可以与长⑶R环结合，深入受体的核心，以发挥生物作用。纳米抗体-GPCR复合体中这些台以及它们的伴随结构可以用作先导化合物鉴定和肽模拟物设计的起始点。因此，本发明的蛋白结合结构域，特别是纳米抗体，可以用于筛选测定。用于药物发现的筛选测定可以是固相或液相测定，如结合测定，如放射性配体结合测定。在高通量测定中，以96-、384-或1536-孔模式，一天筛选高达数百个不同的调节剂或配体是可能的。例如，微量滴定版的每一个孔都可以用于针对所选的潜在调节剂运行单独的测定，或如果要观察弄多或孵育时间影响，则每5-10个孔可以测试单个调节剂。因此单个标准微量滴定版可以测定约96个调节剂。每天测定许多平板是可能的；现今，用于高达约6.000,20.000、50.000或更多不同化合物的测定筛选是可能的。此外，本发明的蛋白结合结构域，如纳米抗体，还可以用于基于细胞的测定。基于细胞的测定对于评价新生物靶标的作用机制和化学化合物的生物学活性也是关键的。目前用于GPCR的基于细胞 的测定包括，测量通路激活(Ca2+释放、cAMP产生或转录活性)；用6 标记GPCR和下游元件，测量蛋白运输；以及利用F0rster共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)或酵母双杂交方法，直接测量蛋白之间的相互作用。通过本领域熟知且常用的任何方式，在细胞内，将本发明的蛋白结合结构域、特别是纳米抗体引入所述细胞的相关区域(compartment)(细胞内或细胞外)可以产生新的或更好的基于细胞的测定。特别是，需要使其天然激活配体还未得到鉴定的GPCR “去孤儿化(de-orphanise) ”。利用本发明的蛋白结合结构域稳定功能构象状态的GPCR,能使在天然配体未知的情况下用于鉴定“孤儿”GPCR的配体的筛选方法成为可能。孤儿GPCR的配体可以从生物样品中鉴定，如血样或组织提取物，或从配体文库中鉴定。例如，已经采用了各种“去孤儿化”方法，包括针对已知配体家族的阵列-测定。可以利用本身已知的任何合适的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型或上述的任何组合，测试化合物和/或包含其的组合物的功效，这取决于所涉及的具体疾病或病症。因此，在一具体实施方案中，因此提供了用于任何上述筛选方法的固相支持物，所述支持物固定有本发明的蛋白结合结构域和/或包含本发明的蛋白结合结构域和功能构象状态的GPCR的复合体。在一实施方案中，任何上述筛选方法所用的测试化合物选自上文所限定的多肽、肽、小分子、天然产物、肽模拟物、核酸、脂质、脂质肽、碳水化合物、抗体或其来源的任何片段如Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH结构域的片段、重链抗体(hcAb)、单结构域抗体(sdAb)、微型抗体、来源于骆驼重链抗体的可变结构域(VHH或纳米抗体)、来源于鲨鱼抗体的新抗原受体的可变结构域(VNAR)、蛋白支架，包括α体、蛋白Α、蛋白G，设计的锚蛋白-重复结构域(DARPins)、纤连蛋白III型重复、抗运载蛋白、打结素、工程化CH2结构域(纳米抗体)。测试化合物可以任选地共价或非共价连接于可检测标记。合适的可检测标记及其连接、使用和检测技术，对技术人员而言是清楚的，并包括但不限于光谱、光化学、生化、免疫化学、电气、光学或化学手段可检测的任何组合物。有用的标记包括磁珠(如免疫磁珠(dynabead))、突光染料(如所有Alexa Fluor染料、突光素异硫氰酸盐、德克萨斯红、若丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(如3H、1251、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。检测这类标记的方式是本领域技术人员熟知的。因此，例如，可以利用感光胶片或闪烁计算器检测放射性标记，荧光标记可以利用光检测器检测发射的照度来检测。酶标记通常通过以下方式检测:提供酶与底物，并检测酶在底物上的作用所产生的反应产物，而比色标记可以通过使有色标记可视而检测。其他合适的可检测标记更早地描述于本发明有关蛋白结合结构域的第一方面的内容中。在优选的实施方案中，测试化合物是上文所述的抗体或其来源的任何片段，包括纳米抗体。例如但并非限制目的，测试化合物可以是针对包含本发明的蛋白结合结构域和功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR(包括变体，如上文所述)的复合体而产生的抗体(如本文以其最广泛的含义所限定)。体内产生抗体的方法是本领域已知的。优选地，以与本文以前所述相似的方式(在存在受体配体的情况下，用GPCR进行免疫；还参见实施例部分)，在存在功能构象状态稳定的蛋白结合结构域、更优选活性状态稳定的蛋白结合结构域的情况下，用GPCR免疫动物。本发明还涉及用于选择对功能构象状态、优选活性构象状态的GPCR具有特异性的抗体的方法涉及，筛选编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库，所述基因在细菌、酵母、丝状噬菌体、核糖体或核糖体亚基或其他展示系统中在含有GPCR和稳定GPCR的功能构象状态的蛋白结合结构域的复合体内表达。本发明的第七方面涉及包含本发明的蛋白结合结构域或本发明的复合体或本发明的细胞组合。所述试剂盒还包含试剂的组合，如缓冲液、分子标签、构建体、参照样品材料以及何时的固相支持物。这类试剂盒可以用于本文所述的本发明的任何应用。例如，所述试剂盒可以包含可用于化合物筛选应用的测试化合物(文库)。最后，本发明的最后一个方面是，用途任何本发明的蛋白结合结构域分离负责特异性结合GPCR的功能构象状态、特别是GPCR活性构象状态的构象表位的氨基酸序列，并基于所述氨基酸序列构建人工蛋白结合结构域。应当认识到，本发明的蛋白结合结构域、构架区以及互补决定区是已知的，并且结合GPCR的功能构象状态、特别是GPCR的活性构象状态的相同构象表位的蛋白结合结构域衍生物的研究，会允许推导出参与结合所述构象表位的必需氨基酸。所述知识可以用于构建最小蛋白结合结构域，并产生其衍生物，这可以利用本领域技术人员已知的技术常规进行。下述实施例意图促进对本发明的进一步了解。尽管参考说明性实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解到，本发明并不限于此。具有本领域普通技术并且接触所述教导的人应当认识本发明范围内的其他修饰和实施方案。因此，本发明仅受本文所附的权利要求的限制。
实施例稳定人I^AR的功能构象状态的蛋白结合结构域实施例1.免疫、文库构建以及最初筛选为了体内获得成熟的针对i32AR的纳米抗体，用在Gly365(i32AR_365)处截短的重组β 2AR免疫美洲骑(无峰骆骑(Llama glama)),以排除对羧基末端的免疫应答。将i32AR-365在昆虫细胞中表达，并按以前所述(Day et al, 2007)重构抗原。施用重构的截短激动剂结合受体6周后，从免疫的美洲驼的血液分离淋巴细胞，并如实施例的材料和方法中所述，制备并筛选噬菌体文库(见下文)。两次筛选鉴定了识别天然32AR而不是变性受体的构象纳米抗体。实施例2.利用ELISA选择构象特异性纳米抗体在第一次筛选中，我们在ELISA中比较纳米抗体对天然和热变性β 2AR抗原的结合。对于每一抗体，用含有激动剂结合的β 2AR_365的磷脂泡涂覆一个孔(0.1 μ g蛋白/孔)。结下来，将这种平板在80° C下孵育2hr (小时)。接着，在不加热的情况下，用含有激动剂结合的β 2AR-365的磷脂泡涂覆同一平板的另一孔(0，I μ g蛋白/孔)。所有纳米抗体都能选择性结合天然受体，而不结合热失活的受体，这表明16种粘合剂识别构象表位。实施例3.利用斑点印迹选择构象特异性纳米抗体在下一筛选中，相比天然反向激动剂结合的受体、SDS变性的受体，我们利用斑点印迹分析，比较纳米抗体对天然激动剂结合的P2AR受体的特异性。所述筛选鉴定了 16种不同的构象纳米抗体，其识别天然激动剂结合的i32AR-365，但不识别反向激动剂或热变性受体(图2(斑点印迹))。实施例4.选择具有G蛋白样行为的纳米抗体最初的筛选鉴定了 16种识别天然激动剂结合的β 2AR、但不识别变性受体的克隆。我们的下一目是，鉴定具有G蛋白样行为的纳米抗体。β 2AR优选与Gs偶联，并且激动剂结合增强G蛋白相互作用。而且，在存在Gs的情况下，P2AR以较高的亲和性结合激动剂。因此，我们(1)利用尺寸排阻层析研究了激动剂对结合P2AR的纳米抗体的影响，(2)在膜中纳米抗体对β Ar激动剂结合亲和性的影响，以及⑶纳米抗体对构象变化的影响，这可以通过环境敏感的mono-bromo bimane (mBBr)突光团监测。实施例5.具有G蛋白样行为的纳米抗体特异性结合纯化的激动剂结合的受体在存在稳定非活性构象的激动剂或反向激动剂的情况下，将纯化的纳米抗体与纯化的去污剂增溶的P2AR受体一起孵育。随后利用基于大小分离蛋白的尺寸排阻层析(SEC)分析混合物。在存在激动剂且不存在反向激动剂的情况下，仅7种纳米抗体结合i32AR，并且作为复合体在SEC上迁移(实施例显示于图1A、图3以及图4中)。剩余的纳米抗体不以足够高的亲和性结合，以改变β 2AR在SEC上的移动性。
实施例6.具有G蛋白样行为的纳米抗体增强β 2AR对激动剂的亲和性当与G蛋白复合时，许多GPCR都表现出较高的激动剂结合亲和性。这归因于激动剂占据的受体与G蛋白之间的协同相互作用。我们的SEC实验提供了 7种纳米抗体优先结合激动剂占据的P2AR并因此可以以与G蛋白Gs相似的方式稳定活性状态的证据。在存在和不存在这7种纳米抗体的情况下，进行激动剂竞争结合实验。在存在纳米抗体65、67、69、71、72、80以及84的情况下，P2AR对激动剂(异丙肾上腺素)的亲和性增强了 2_30倍(图1B和表I)。相比之下，NbSO并不增强i32AR或β 2AR - T4L对反向激动剂IC1-118、551 (ICI)的亲和性(图15)。实施例7.Nb80和G蛋白在TM6的细胞质结构域处诱导相似的构象改变最近视蛋白的晶体结构以及对视紫红质(Park et al.2008)和β 2AR(Yao etal.2009)的生物物理研究表明，跨膜节段6 (TM6)的细胞质端，在激动剂结合后经历了需要G蛋白偶联的构象变化。为了研究纳米抗体对TM6细胞质结构域运动的影响，我们用mono-bromo bimane在C265处标记纯化的β 2AR(mBB- β 2AR)。我们以前证明，激动剂结合和G蛋白偶联两者都诱导与TM6的向外运动相容的mBB-132AR的荧光变化(Yao et al.2008)，这正如在视蛋白晶体结构中所观察的(Park et al.2008)。在mBB-β 2AR中，添加激动剂与G蛋白，导致比单独的激动剂或G蛋白大的荧光变化。这与在激动剂竞争结合测定中所观察到的协同相互作用一致(Yao et al.2009) 0同样，在添加仅激动剂异丙肾上腺素或仅Nb80的情况下，在mBB-β 2AR中观察到荧光的相对小的变化；然而，当一起添加激动剂和纳米抗体时，观察到更大的变化(图1C)。观察了纳米抗体65、67、69、71、72以及84的可比较的结果(图5)。实施例8.纳米抗体稳定的^2AR活性状态的表征我们随后比较NbSO与Gs对β 2AR结构和激动剂结合亲和性的影响。用m__brom。bimane在TM6细胞质端在C265处标记β 2AR，并将其重构到HDL颗粒中。在激动剂激活后，TM6相对于TM3和TM5移动(图6A)，并且我们以前已经证明，共价连接于C265的Bimane周围的环境随着激动剂结合和G蛋白偶联而改变，从而导致Bimane强度降低和λ _的红移(Yaoet al.2009)。Bimane荧光的变化与TM6的运动一致，这与在视紫红质中通过DEER光谱和在低PH视蛋白的结构中所观察的相似。如图6B所示，儿茶酚胺激动剂异丙肾上腺素和Gs都稳定活性样构象，但是Gs的影响在存在异丙肾上腺素的情况下更大，这与激动剂和Gs对^2AR结构的协同相互作用一致。单独的Nb80对无配体的β 2AR的Bimane荧光和λ _具有影响，这与Gs的相似(图6C)。在结合反向激动剂IC1-118，551的β 2AR中并未观察到这种影响。在存在10 μ M异丙肾上腺素时，NbSO的影响增强。这些结果表明，NbSO不识别β 2AR的非活性构象，但是有效结合激动剂占据的β 2AR，并产生不能与在存在Gs和异丙肾上腺素时所观察的Bimane荧光区分的Bimane荧光。图6D和6E表示Gs和Nb80对β 2AR的激动剂亲和性的影响。将β 2AR重构到HDL颗粒中，并在不存在或存在Nb80和Gs的情况下进行激动剂竞争结合实验。在不存在任一种蛋白的情况下，异丙肾上腺素的抑制常数(Ki)为107nM。在存在Gs的情况下，观察到两种亲和状态，因为并不是所有P2AR都与Gs偶联。在Gs偶联的状态下，异丙肾上腺素的亲和性增加了 100倍(Ki=l.07nM)(图6D和表4)。同样，在存在Nb80的情况下，异丙肾上腺素的亲和性增加了 95倍(Ki=l.13nM)(图6E和表4)。这些结合数据表明，NbSO稳定WT β 2AR的构象，其与Gs稳定的非常相似，从而激动剂和Gs结合的有力偶联被Nb80忠实地模拟。用i32AR_T4L融合蛋白，获得β 2AR非活性状态的高分辨率结构。我们以前证明，32八1^1礼比11^41 对异丙肾上腺素(Rosenbaum et al.2007)具有更高的亲和性。然而在存在Nb80的情况下，亲和性增加了 60倍，从而导致与结合Nb80的WT β 2AR的亲和性可比较的亲和性(Ki=0.56nM)(图6F和表4)。尽管由于T4L所致的空间位阻我们未能研究β 2AR-T4L中的G蛋白偶联，但是结果表明，T4L不防止Nb80的结合，并且在存在Nb80的情况下，对结合野生型β 2AR和β 2AR-T4L的激动剂的相同的Ki值表明，Nb80在这两种蛋白中稳定相似的构象。实施例9.纳米抗体促进激动剂结合的β 2AR的结晶最初利用两种不同的方法使结合反向激动剂卡拉洛尔的P2AR结晶。第一种晶体由结合Fab片断的β 2AR获得，所述Fab片段识别由连接TMs5和6的第三细胞内环的氨基或羧基末端构成的表位(Rasmussen et al.2007)。在第二种方法中，第三细胞内环被T4溶菌酶取代(β 2AR_T4L) (Rosenbaum et al.2007)。使β 2AR_Fab复合体和结合不同激动剂的32AR-T4L结晶的努力，未能产生用于结构测定的充分质量的晶体。我们因此试图使与Nb80复合的激动剂结合的β 2AR和β 2AR_T4L结晶。尽管在脂质Bicelle和脂质立方相(LCP)中获得两种复合体的晶体，但是从在LCP中生长的β 2AR-T4L-Nb80的晶体，获得高分辨率衍射。这些晶体于pH8.0下生长于39_44%PEG400、IOOmM Tris、4%DMS0 以及 1%1，2，3-heptanetriol 中。实 施例10.Nb80有助于β 2AR在晶格中的包装从生长于LCP的β 2AR-T4L-Nb80获得高分辨率衍射。这些晶体于pH8.0生长于39-44%PEG400、IOOmM Tris、4%DMS0 以及 1%1，2，3-heptanetriol 中。由23个晶体于3.5 A获得一组合并的数据(表5)。利用卡拉洛尔结合的β 2AR和纳米抗体作为研究模型，通过分子取代系解析结构。图7表示β 2AR-T4L-Nb80复合体在晶格中的包装。Nb80结合P2AR的细胞质端，并且，第三互补决定区(OTR)环突出到受体的核心。P2AR纳米抗体复合体以脂质双层近似平行于晶体的be平面的方式排列。双面对称相关纳米抗体分子沿a轴相互作用，从而在该方向产生紧密包装的晶格。在双层内，受体分子以反平行排列的方式相互作用，并且一个P2AR分子的TM1、2、3以及4靠着相邻分子的TM4和5包装。沿着b轴在平行晶格邻居的螺旋8与TM5之间，和在TMl的细胞外部分与第三反平行邻居TM6的细胞质端之间，进行接触。沿着c轴，包装最弱，这可能部分归因于T4L与相邻受体和/或纳米抗体分子的非特异性相互作用。不存在可解释的T4L电子密度，但是考虑到TM5和TM6的可视末端，T4L的位置受到高度限制。推测T4L相对于受体采用许多定向和可能由于其铰链运动而导致的一系列内部构象(Zhang et al.1995)，所述内部构象最终平均了其密度。然而，T4L可能有助于晶体的结构，因为我们不能在这些条件下产生天然β 2AR-纳米抗体复合体的晶体，尽管可能的是，在天然受体中连接TM5和TM6的韧性环，防止晶格形成。实施例11.β 2AR的纳米抗体稳定的活性状态的结构图8比较了非活性β 2AR结构(来自卡拉洛尔结合的β 2AR-T4L结构)与β 2AR的活性状态。在受体的细胞质面，发现了最大差异，同时在P2AR-T4L-Nb80复合体中，相对于非活性结构，TM5和TM6向外位移且TM7和TM3向内运动(图8A、B)。在细胞外表面，变化相对较小(图8C)。TM3与TM4之间的第二细胞内环(ICL2)采用两轮α螺旋，这与在火鸡^1AR结构中所观察到的相似(Warne et al.2008)。这种螺旋在非活性β 2AR结构中不存在，可能反映了有关ICL2的晶格接触。图9A-C更详细地显示了 Nb80与β 2AR的细胞质侧的相互作用。⑶R3的8氨基酸序列刺入TM节段3、5、6以及7的氨基酸所形成的疏水口袋。⑶Rl的4氨基酸序列提供了与TM节段5和6的其他稳定相互作用。图9D比较了 β 2AR活性和非活性构象的细胞质表面。在视蛋白中，⑶R3占据的位置与转导蛋白的羧基末端肽相似(Scheerer et al.2008)(图10)。Nb80与P2AR之间的大多数相互作用都受疏水接触的介导。当比较活性和非活性结构时，在TM6中观察到最大变化，在Glu2686 3°(离子锁的一部分)(在该形式中上标表示保守的GPCR残基的Ballesteros - Weinstein编号(Ballesteros and Wei nsteinl995)处具有11.4.A的轴运动(图9D)。这一大变化由居于保守Pro2886 5°之前的转角中TM6的小的顺时针旋转而实现，所述顺时针旋转是由脯氨酸处主链氢键的中断和Phe2826 44的重新包装(参见下文)从而使螺旋向外旋转而造成。活性β 2AR-T4L-Nb80相对于非活性的卡拉洛尔结合的β 2AR_T4L的变化，与在视紫红质和视蛋白之间观察到的变化非常相似(Scheerer et al.2008;Park et al.2008)(图9E，图10)。高度保守的Argl313 5°与Asp/Glul3 0 3 49之间的离子锁中的盐桥断裂。在视蛋白中，Argl353 5°与TM5的Tyr2235 58和转导蛋白肽的主链羰基相互作用。P2AR的Argl313.50同样与Nb80的CDR3的主链羰基相互作用。然而，Nb80妨碍了 Argl313 5°与Tyr2195.58之间的相互作用，即使酪氨酸占据了视蛋白和β 2AR_T4L_Nb80活性构象中的相似位置。与在视蛋白中一样，高度保守的NPxxY序列的Tyr3267 53运动到非活性状态的TM6所占据的空间中。在非活性的卡拉洛尔结合的i32AR-T4L中，我们观察到涉及TM1、2、6以及7中高度保守的氨基酸和数个水分子的氢键相互作用的网络(Rosenbaum et al.2007)。尽管β 2AR-T4L-Nb80的分辨率不足以检测水，但是显然，我们观察到的结构变化会实质上改变这种网络。与在β 2AR-T4L_Nb80的细胞质结构域所观察到的相对大的变化相比，激动剂结合口袋中的变化相当小。Trp6 48在家族A GPCRs中高度保守，并且认为其旋转异构体状态在GPCR激活中发挥作用(旋转异构体切换开关)(Shi et al.2002)。我们在TM6中的Trp2866.48的侧链旋转异构体中未观察到变化，Trp2866.48位于配体结合口袋的底部附近，尽管其位置由于附近残基Ilel213 4°和Phe2826 44的重排而稍微移位。尽管在激活视紫红质后，存在Trp6 48环境变化的光谱证据(Ahuja et al.2009)，但是在视紫红质和低pH视蛋白的晶体结构中，并未观察到旋转异构体变化。此外，最近有关组胺受体的诱变实验证明，Trp6_48不是血清素激活5HT4受体所需的(Pellissier et al.2009)。有意思的是，推测激动剂结合口袋周围的小变化如何与促进Nb80和Gs结合的TMs5、6以及7的细胞质区域中大得多的结构变化偶联。图11显示了潜在的构象连接。激动剂相互作用可以稳定活性受体构象，其包括相对于非活性结构，2075_46位置处的TM5向内运动2.1 A和保守的Pro2115 5°向内运动1.4 A。在非活性状态，Pro2115.50、Ilel213.40、Phe2826.44以及Asn3 1 8 7 45之间的相互作用稳定TM5、TM3、TM6以及TM7的相对位置。在活性状态中观察到的Pro2115 5°的位置与这种相互作用的网络不一致，并且Ilel213 4°和Phe2826 44被重新定位，同时TM6围绕Phe2826 44旋转，这导致TM6的细胞质端向外运动。
尽管在P2AR-T4L_Nb80复合体的细胞质结构域中所观察到的一些结构变化是由与Nb80的特异性相互作用引起的，但是，Nb80和Gs在β 2AR中诱导或稳定相似的结构变化这一事实表明，Nb80和Gs识别相似的激动剂稳定的构象，所述变化可以由荧光光谱和激动剂结合亲和性测定。视紫红质和P2AR的细胞质结构域在激活后经历相似的结构变化，这一观察结果进一步提供了支持，即激动剂结合的β 2AR-T4L-Nb80代表活性构象并且与G蛋白激活的保守机制一致。然而，激动剂诱导或稳定这些构象变化的机制可能因不同的配体和不同的GPCR而不同。视紫红质与P2AR的构象平衡的不同，如以下事实所证明，即视紫红质在缺少G蛋白的情况下可以采用完全的活性构象而P2AR不能这样。因此，激活能量和构象取样在不同GPCR之间可以不同，这可能引起这些配体所展示的配体功效的多样性。激动剂仅需要破坏稳定非活性状态所需的一个关键的分子内相互作用，因为组成性受体活性可以来自GPCR不同区域氨基酸的单个突变(Parnot et al.2002)。因此，激动剂或突变破坏这些稳定相互作用，降低了分割非活性和活性状态的能障，并增大受体可以与G蛋白相互作用的可能性。总之，上述这些结果表明能产生识别和稳定GPCR的激动剂结合的状态的纳米抗体。在β 2AR的情况下，这种纳米抗体稳定的状态在功能上与G蛋白Gs稳定的状态相似。最后，纳米抗体促进衍射质量的晶体的形成。现在将这种方法应用于其他GPCR和其他膜蛋白。实施例12.Nb80稳定肾上腺素能受体家族成员的活性构象状态与相关受体交叉反应的激活状态稳定纳米抗体，可以用作稳定那些相关受体构象状态的工具。为了说明这一原理，我们分析NbSO是否选择性结合人P1AR受体的活性构象。@#1 和P2AR是密切相关的肾上腺素能受体。利用PISA服务器(Krissinel&Henrick, 2007)，并基于 Nb80_P 2AR 复合体的晶体结构，鉴定了与 β 2AR-Nb80界面中的Nb80相互作用的30个i32AR AA残基在。氨基酸序列比对(图17)表明，参与Nb80相互作用的这30个残基中有28个残基在P1AR和P2AR中是保守的。剩余的界面残基是i32AR中的赖氨酸，并且已经被对应于保守取代的PlAR中的精氨酸取代(如图17中灰色框所示)。因此，看起来两种受体共享非常相似的NbSO的结合位点。基于这一分析，我们还测量了 Nb80对激动剂异丙肾上腺素和反向激动剂CGP20712A(图18)的P1AR亲和性的影响。对于β 2AR, Nb80也诱导异丙肾上腺素对β ,AR亲和性的增强(图18，图版A和C)。Nb80不改变拮抗剂CGP20712A的亲和性(图18，图版D)，这证明Nb80选择性稳定β 的活性状态构象。在不相关受体，如多巴胺Dl受体汇总观察到NbSO的这种作用(数据未显示)O实施例13.β 2AR活性状态稳定纳米抗体是改善激动剂筛选的极好工具当与G蛋白复合时，许多GPCR都表现出更高的激动剂结合亲和性。这归因于激动剂占据的受体与G蛋白之间的协同相互作用。具有G蛋白样行为的纳米抗体，可能增强i32AR对激动剂的亲和性 (参阅实施例6)。这种行为在新激动剂发现中具有重要影响。例如，与拮抗剂相比，具有G蛋白样行为的Nbs可以增强GPCR对激动剂的表观亲和性。当筛选针对这类GPCR-Nb复合体的化合物文库时,这可能引起搜索中(among the hits)的激动剂偏爱性。为了评估这种方法的实用性，我们在竞争性放射性配体结合实验中分析了 P2AR活性状态稳定纳米抗体Nb80对P2AR与数个熟知的P2AR配体的相互作用的影响(参见材料和方法)。测试了 10种激动剂和5种拮抗剂:㈠异丙肾上腺素HCl (激动剂)、(-)-阿普洛尔(拮抗剂)、柳丁氨醇(部分激动剂)、ICI118551 (反向激动剂)、卡维地洛(拮抗剂)、CGP12177A(拮抗剂)、昔萘酸沙美特罗(完全激动剂)、特布他林半硫酸盐(部分激动剂)、盐酸多巴酚丁胺(部分激动剂)、奥西那林半硫酸盐(激动剂)、盐酸丙卡特罗(激动剂)、盐酸苄羟麻黄碱(激动剂)、氢溴酸非诺特罗(完全激动剂)、富马酸福莫特罗二水化物(formoterol fumarate dehydrate,激动剂)以及马来酸噻吗洛尔盐(timolol maleatesal,拮抗剂)，所有都通过Sigma Aldrich购买。在存在和不存在500nM Nb80的情况下，对含有全长人β 2AR的商业膜，进行配体竞争结合实验。用3H-二氢阿普洛尔(DHA)作为竞争性放射性配体。配体竞争结合实验的代表性实例显示于图16中。对于所有化合物而言，在存在过量Nb80的情况下获得IC50值，并将其与在存在不相关纳米抗体的情况下获得的IC50值(阴性对照)进行比较(表6)。与实施例6、8以及12 —致，我们观察到，当β 2AR与Nb80复合时，所有激动剂的潜能增加。未观察到拮抗剂或反向激动剂的这一作用。实施例14.利用β 2AR活性状态稳定纳米抗体进行化合物文库筛选在旨在鉴定针对具体构象即所谓“药物可控制的”靶构象的化合物的筛选测定中，锁定所述具体构象的GPCR具有优于利用非构象稳定的靶标(代表构象库)的优势。构象选择性NbSO允许使用野生型受体，因此使优于定点诱变所致的人工构象变化的潜在风险最小化。为了证明NbSO是否促进鉴定选择性结合活性构象的β 2AR的配体，利用放射性配体结合测定，对由约1500个不同的低分子量化合物(<300Da)组成的片段文库进行激动剂筛选。对于这个测定，将含有全长β 2AR的膜与NbSO或不相关Nb (阴性对照)一起预孵育，并添加于含有文库化合物和2nM3H- 二氢阿普洛尔(DHA)放射性配体的96孔板(参见材料和方法)。文库化合物，与含有不相关纳米抗体的样品相比，其明显取代含有与Nb80复合的β 2AR的样品中放射性配体，是是优先结合受体的活性构象的化合物。选择性结合受体的活性构象的文库化合物，具有行为如同激动剂的高倾向性，因为GPCR活性构象的正位或变构稳定诱发生物应答。所选的文库化合物必须通过G蛋白偶联、下游信号传导事件或生理输出进行测量而进一步筛选其激动作用。实施例15:用纳米抗体热稳定β 2AR受体对膜本体蛋白的结合和功能研究，已经受到它们在去污剂中不稳定性的阻碍。尽管出现了允许产生毫克数量的表达和纯化方法，但是用这些分子实现稳定性，或许是最难以克服的障碍。纯化必须通过去污剂增溶从脂质双层释放膜蛋白，这是蛋白的疏水表面涂覆表面活性剂单体从而形成蛋白-去污剂复合体的过程。然而，在蛋白周围形成的去污剂带，是脂质双层的拙劣取代物。因此，膜蛋白的溶解经常导致去稳定、解折叠以及随后聚集。通过定点诱变可以实现膜蛋白的热稳定(Zhou&Bowie, 2000;Magnini et al.，2008)。在此，我们证明，构象选择性纳米抗体的结合代表了用于去污剂增溶的GPCR的热稳定的创新可选方案。利用荧光热稳定测定(图13)和尺寸排阻层析(图14)，分析构象选择性纳米抗体对i32AR受体热稳定性和随后聚集的影响。对于这些实验，将重组P2AR表达于Sf9昆虫细胞，溶解于1%十二烷基麦芽糖苷、IOOmM NaCl、20mM Hepes pH7.5和蛋白酶抑制剂中，并通过MlFLAG亲和性层析进行纯化(参见实施例的材料和方法)。突光热稳定性测定利用硫醇特异性突光染料N-[4_ (7_ 二乙氨基_4_甲基_3_香豆素基)苯基]马来酰亚胺(CPM)测量包埋于蛋白内部作为膜蛋白折叠状态整体完整性的传感器的天然半胱氨酸的化学反应性(Alexandrov et al.，2008)。对于突光热稳定性测定，将去污剂增溶的受体(在0.1%十二烷基麦芽糖苷、IOOmM NaCl以及20mM Hepes pH7.5中)与异丙肾上腺素(10 μ M)在存在或不存在2:1摩尔过量Nb80的情况下于RT(室温)下预孵育lh。随后将样品与CPM荧光团混合，于10° C-94° C温度下孵育2min (分钟)，并收集荧光发射。实验一式三份进行，并导致与获得的GPCR APJ的稳定性谱相似的熔解曲线(Alexandrov et al.，2008)。解折叠转变可以由简单双态模型来描述,包括代表熔解曲线下限和上限的天然(折叠)状态和变性状态。激动剂结合受体的熔解曲线与与NbSO复合的激动剂结合受体的熔解曲线的比较表明，纳米抗体通过将激动剂结合受体的解链温度(Tm)提闻12° C而稳定的活性构象。我们还通过尺寸排阻层析(SEC)分析了 NbSO对激动剂结合的受体的热解折叠和聚集的影响。对于该实验，将十二烷基麦芽糖苷增溶的受体与异丙肾上腺素(ΙΟμΜ)仪器在存在或不存在2:1摩尔过量Nb80的情况下于RT预孵育45分钟。接下来，在温度增加的情况下将样品孵育10分钟，并随后通过SEC分析(图14)。不同层析的比较表明，NbSO保护激动剂结合的受体避免温度诱发的聚集。蛋白结合结构域稳定大鼠血■管'紧张素IIla型受体(ATlaR)的功能构象状态实施例16.免疫、文库构建以及初始筛选为了体内获得成熟的抗大鼠ATlaR纳米抗体，将两个美洲驼(无峰骆驼)用在Lys318之后截短以排除针对羧基末端的免疫应答的重组ATlaR-T4溶菌酶(T4L)融合物免疫。在昆虫细胞中表达ATlaR(Shluka et al.2006)，并按以前所述，将抗原重构于脂质泡(Day et al, 2007 )中。一个美洲驼用血管紧张素(无偏爱激动剂)结合受体免疫，一个美洲驼用结合于受体的抑制蛋白偏爱性配体TRV023 (Violin et al.2010)免疫。在施用重构的、截短的激动剂结合的受体6周后，从免疫的美洲驼的血液分离淋巴细胞，并按实施例的材料和方法所述，制备和筛选噬菌体文库。固相ELISA鉴定了识别ATla受体的纳米抗体。实施例17.利用ELISA选择构象特异性纳米抗体在第一此筛选中，我们在ELISA中比较了纯化的纳米抗体在天然和热变性大鼠ATlaR抗原上的结合。对于每一纳米抗体，用受体涂覆一个孔。接下来将这个平板于80° C孵育2hr。随后，用受体涂覆同一平板的另一空孔，但不加热。能选择性结合天然受体但不结合热失活的受体的纳米抗体识别构象表位。实施例18.通过斑点印迹选择构象状态特异性纳米抗体在下一筛选中，我们利用斑点印迹分析比较了与拮抗剂结合的受体相比将构象表位结合于激动剂结合的ATlaR受体的纳米抗体的结合。与拮抗剂结合的(非活性状态)的受体相比，这种筛选鉴定了选择性识别激动剂结合的(活性状态)的受体的构象的纳米抗体。实施例19.筛选选择性稳定受体的活性构象的ATlaR纳米抗体除了用于ATlaR特异性的结合测定(ELISA)夕卜，在与实施例6、12和13所述的放射性配体测定相似的放射性配体竞争实验中，评估纯化的纳米抗体。增强ATlaR对激动剂亲和性的纳米抗体被认为稳定受体的活性构象。蛋白结合结构域稳定大鼠M3毒蕈碱受体的功能构象状态实施例20.免疫、文库构建以及初始筛选为了体内获得成熟的抗大鼠M3R的纳米抗体，将美洲驼(无峰骆驼)用在N和C末端位点截短以排除针对末端的免疫应答的重组M3R-T4溶菌酶(M3R-T4L)融合物免疫。在M3R-T4L中，第三细胞内环被T4溶菌酶替代。在昆虫细胞中表达M3R-T4L，并按以前所述，重构抗原(Day et al, 2007) 在施用重构的拮抗剂(噻托溴铵)结合的受体6周后，从免疫的美洲驼的血液分离淋巴细胞，并入实施例的材料和方法所述，制备并筛选噬菌体文库。实施例21.利用ELISA选择构象特异性纳米抗体在第一次筛选中，我们在ELISA中比较纯化的纳米抗体在天然和热变性大鼠M3R抗原上的结合。对于每一纳米抗体，用受体涂覆每一孔。接下来，将该平板于80° C下孵育2hr。随后，用受体涂覆同一平板的另空孔，但不加热。能选择性结合天然受体但不结合热失活的受体的纳米抗体识别构象表位。实施例22.利用斑点印迹选择构象状态特异性纳米抗体在下一筛选中，我们利用斑点印迹分析比较了与拮抗剂结合的受体相比将构象表位结合于激动剂结合的M3受体的纳米抗体的结合。与拮抗剂结合的(非活性状态)受体相比，该筛选鉴定了选择性识别激动剂结合的(活性状态)受体的构象的纳米抗体。实施例23.筛选选择性稳定受体的活性构象的M3R纳米抗体。除了用于M3R特异性的结合测定(ELISA)之外，在与实施例6、12和13所述的放射性配体测定相似的放射 性配体竞争实验中，评估纯化的纳米抗体。增强M3R对激动剂亲和性的纳米抗体被认为稳定受体的活性构象。实施例的材料和方法β 2AR 制备在氨基酸365之后截短的i32AR(i32AR_365)具有氨基末端Flag表位标签，按以前所述(Kobilkal995)，将其在Sf9昆虫细胞中表达并通过顺序Ml抗体和阿普洛尔亲和层析纯化。将纯化的 β 2AR_365 固定化于 Flag 柱(Sigma)上，并用 5mg/ml DOPC (Avanti PolarLipids)与 0.5mg/ml 脂质 A(Sigma)在 l%(w/v)辛基葡糖苷(Anatrace) > IOOmM NaCl、20mMHepes pH7.5、2mMCaC12以及I μ M激动剂(如异丙肾上腺素)中的10柱体积的混合物平衡。随后在含有EDTA的相同缓冲液中洗脱i32AR。将洗脱的P2AR的浓度调整到5mg/ml。这经常涉及用相同的缓冲液稀释蛋白，但是偶尔需要用Amicon超滤单元(IOOkDa孔)将蛋白浓缩高达2倍。然后于4° C用含有I μ M激动剂的磷酸缓冲盐水透析蛋白，以除去去污齐U。在用于免疫前，将重构的蛋白储存于-80° C。ATlaR 制备将在第三环中具有Τ4溶菌酶的ATlaR在氨基酸318之后截短(ATlaR-318)。这种构建体具有氨基末端Flag表位标签和10个组氨酸的C末端标签。在Tni昆虫细胞中表达ATlaR-318，并于室温下在20mM Hepes, pH7.4UM NaCl和0.5%MNG中溶解2h。利用顺序 N1-NTA 和 FLAG-M1 抗体亲和层析纯化受体。在 5mg/ml DOPC (Avanti Polar Lipids)与 0.5mg/ml 脂质 A(Sigma)在 l%(w/v)辛基葡糖苷(Anatrace) >IOOmM NaCl、20mM HepespH7.5以及100 μ M激动剂(如血管紧张素II)的混合物中重构纯化的ATlaR。将洗脱的AtlaR的浓度调整至l_2mg/ml。随后于4° C用含有100 μ M激动剂的磷酸缓冲盐水透析蛋白，以除去去污剂。在用于免疫前，将重构的蛋白储存于-80° C。M3受体制备在存在I μ M阿托品的情况下，在Sf9昆虫细胞中表达具有氨基末端FLAG表位标签和羰基末端六聚组氨酸标签的M3毒蕈碱受体(Vasudevan et al.1995)。受体的细胞内环3或者缺失(M3RA i3)或者被T4溶菌酶取代(M3R-T4L)。离心细胞，随后通过渗透休克裂解，并将蛋白溶解于1%十二烷基麦芽糖苷、0.1%胆固醇半琥珀酸酯、750mM氯化钠、20mMHEPES pH7.5中。然后利用镍亲和层析、随后FLAG亲和层析纯化溶解的受体。接着利用尺寸排阻层析分离纯化的蛋白，以选择按所述(Day et al, 2007)重构的单体受体。抗β 2AR的纳米抗体的选择单个美洲驼接受6周的重构截短的β 2AR给药。从免疫的美洲驼的血液分离淋巴细胞，并从这些细胞制备总RNA。利用RT-PCR扩增纳米抗体库的编码序列，并将其克隆到曬菌体展示载体pMES4(genbank GQ907248) (Conrath et al.2001)中。通过在土涂覆了重构的β 2AR-365受体的Maxisorp (Nunc) 96孔平板上进行体外选择，富集β 2AR特异性卩遼菌体。用三乙胺pHll从抗原涂覆的孔回收抗原结合的噬菌体，并用Tris-HCl pH7或通过添加新鲜生长的TG1E.col细胞中和。在两轮生物淘筛后，随机挑选96个个体菌落，并在TGl细胞的周质中产生纳米抗体作为可溶的HIS标记的蛋白。固相ELISA鉴定了识别天然激动剂结合的P2AR-365但不结合热变性的受体的16个不同的构象纳米抗体。抗ATlaR的纳米抗体的选择一个单个美洲驼接受6周结合激动剂血管紧张素的重构的ATlaR-318给药。另一单个美洲驼接受6周结合偏爱性激动剂TRV023的ATlaR-318给药。在免疫后，从每一美洲驼的单独血液分离淋巴细胞。从这些细胞制备总RNA。利用RT-PCR从每一样品扩增纳米抗体库的编码序列，并将其单独克隆(Conrath et al.2001)到曬菌体展示载体pMESy4_载体中，从而产生2个独立的文库。pMESy4是携带C末端His6标签、随后是氨基酸EPEA的pMES4 (genbank GQ907248)的衍生物(De Genst et al.2010.J.Mol.Biol402:326-343)。通过在Maxisorp (Nunc) 96孔板上进行体外选择，富集ATlaR特异性曬菌体,所述96孔板涂覆了分别结合血管紧张素或TRV023的重构的、截短的ATlaR受体(重组受体的变体，但没有T4L插入)。利用胰蛋白酶消化，从抗原涂覆的孔回收抗原结合的噬菌体。在两轮生物淘筛后，随机挑选92个个体菌落(46位于ATlaR-血管紧张素上，46位于ATlaR-TRV023上)，并在TGl细胞的周至中产生纳米抗体，作为可溶的HisIS-EPEA-标记的蛋白。抗M3R的纳米抗体的选择一个单个美洲驼接受6周结合拮抗剂噻托溴铵的重构的、截短的M3R-T4L给药。在免疫后，从所述美洲驼的血液分离淋巴细胞，并从这些细胞制备总RNA。利用RT-PCR扩增纳米抗体库的编码序列，并将其克隆(Conrath et al.2001)到曬菌体展示载体pMESy4_载体中。为了富集M3R特异性噬菌体，在存在激动剂卡巴胆碱或拮抗剂奎宁环基苯甲酸(QNB)的情况下，利用不同形式的抗原，进行不同的体外选择策略。抗原形式包括携带大鼠M3RAi3受体(即在第三细胞内环中具有缺失的M3受体)、含有M3R(Perkin Elmer)的人CHO细胞的膜、重组重构的M3R-T4L或重组重构的M3RA i3的病毒样颗粒(VLPs)。任选地，利用涂覆于Maxisorp (Nunc) 96孔板上的麦胚凝集素，捕获携带大鼠M3R Λ i3受体或人M3R膜的VLP。利用胰蛋白酶消化，从抗原涂覆的孔回收抗原结合的噬菌体。可选地，利用过量拮抗剂，洗脱选择于激动剂结合的抗原上的噬菌体，反之亦然。在两轮生物淘筛之后，随机挑选180个菌落，并在TGl细胞的周质中产生纳米抗体，作为可溶的His-EPEA标记的蛋白。在M3R-T4L受体上，与ATlaR_T4L受体相比，可比较的固相ELISA产生66个M3R特异性纳米抗体。用于生化表征的纳米抗体纯化在WK6E.coli细胞质中，表达HIS-标记的或HIS-EPEA标记的纳米抗体。使周质提取物在硫酸镍(II)快流速琼脂糖(GE Healthcare)上进行固定的金属亲和层析。在IOOmMMES pH6.5、100mM NaCl缓冲液中，过夜透析IMAC蛋白级分。通过阳离子交换层析(具有Mono S10/100GL柱的ΑΚΤΑ FPLC )，进一步纯化透析的纳米抗体。尺寸排阻层析在缺少或存在40 μ M纳米抗体的情况下，于RT下将20 μ M激动剂或反向激动剂(卡拉洛尔)结合的i32AR-365N孵育Ihr后，利用尺寸排阻层析鉴定激动剂选择性纳米抗体。在存在I μ M各自配体的情况下，利用具有Superdex20010/300GL柱的AKTAFPLC，在 0.l%DDM、20mM HEPES pH7.5、100mM NaCl 中，进行层析。在来自昆虫细胞的膜制剂中，配体结合于截短的P2AR受体在缺少或存在I μ M纳米抗体的情况下，于RT、在含有0.5ηΜ[3Η] - 二氢阿普洛尔和浓度范围为IO-11M至KT4M的(-)_异丙肾上腺素的结合缓冲液(75mM Tris ρΗ7.5,12.5mMMgCl2UmM EDTA、0.05%BSA 和 10 μ MGTP γ S)中，对表达于 Sf9 昆虫细胞膜中的 P2AR_365 进行90min竞争结合实验。利用Br andel采集机,在Whatman GF/B滤器上,分离结合的放射性配体与未结合的放射性配体。数据是一式三份进行的两个独立实验的平均值土S.E.。Bimane 突光使纯化的β 2AR与在IOOmM NaCl、20mM HEPES、pH7.5，0.1%十二烷基麦芽糖苷中的1:1当量的mono-bromo bimane (mBBr, Invitrogen)反应，并在冰上避光孵育过夜。通过在用相同缓冲液平衡的脱盐柱上进行凝胶过滤，在使用前，适当纯化荧光团标记的受体。在Spex FluoroMax-3分光突光计(Jobin Yvon Inc, NJ)上，以光子计数模式,利用4nm的激发和发射带通，进行荧光光谱实验。在25° C进行所有实验。对于发射扫描，将激发设定在370nm，并且以ls/nm的积分时间，测量由430_530nm的发射。为了测定纳米抗体和配体的作用，将3个个体标记蛋白样品与I μΜ纳米抗体或10 μ M异丙肾上腺素或两者一起孵育。孵育I小时后，采集样品的发射光谱。在所有实验中，针对来自缓冲液和配体的背景荧光，校正荧光强度。数据是一式三份进行的两个独立实验的平均值土S.E.。制备用于晶体学的β 2AR_T4L和纳米抗体-80在感染了 β 2AR_T4L杆状病毒的Sf-9昆虫细胞培养物中表达β 2AR_T4L，并根据以前所述方法(Kobilkal995)使其溶解。在阿普洛尔-琼脂糖层析(Kobilkal995)之前和之后，通过MlFLAG亲和层析(Sigma)获得功能蛋白。在第二 Ml层析步骤中，用受体结合的阿普洛尔交换高亲和性激动剂，并用十二烷基麦芽糖苷交换MNG-3两亲物，用于增强受体稳定性(Chae and Gellman,未发表)。在 IOmM HEPES pH7.5、100mM NaCl、0.02%MNG_3 以及10 μ M激动剂中洗脱激动剂结合的和去污剂交换的β 2AR-T4L，随后通过用PNGaseF(NEB)处理除去N-连接的糖基化。用IOOkDa分子量截止Vivaspin浓缩器(Vivascience),将蛋白浓缩为约50mg/ml。在用IPGT诱导后，在大肠杆菌菌株WK6的周质中表达携带C末端His6标签的的纳米抗体-80 (Nb80)。在含有0.1%葡萄糖、2mM MgCl2以及50 μ g/ml氨苄青霉素的TB培养基中，于37° C，将0.6L的培养物生长至0D_=0.7。于28° C将诱导的培养物生长过夜。通过离心收获细胞，并在冰冷缓冲液(50mM Tris pH8.0、12.5mM EDTA以及0.125M蔗糖)中裂解，随后离心，以除去细胞碎片。利用镍亲和层析纯化Nb80、用缓冲液(IOmM HEPES pH7.5、IOOmM NaCl)透析并旋转离心至约120mg/ml。结晶将激动剂结合的β 2AR-T4L和纳米抗体(如Nb80)以1: 1.2摩尔比混合，于RT孵育2小时后，与含有10%胆固醇(C8667，Sigma)的液化的单油酸甘油酯(M7765，Sigma)以 1:1.5 蛋白与脂质比(w/w)，利用 Martin Caffrey (Caffrey and Cherezov2009)所发明的双注射器混合方法混合。最初的结晶先导(crystallization lead)利用内部筛选鉴定，并在24孔玻璃夹心平板中利用50nL蛋白:脂质小滴优化，所述小滴手动送递、在每一孔中用0.8μ I沉淀溶液覆盖并用玻璃盖片密封。利用0.8μ I在Mill1-Q水中稀释 2-4 倍的储备溶液(reservoir solution, 36-44%PEG400UOOmM Tris ρΗ8.0、4%DMS0、l%l，2，3-h印tanetriol)，通过悬滴蒸汽扩散，于20° C生长用于数据收集的晶体。在7-10天，晶体生长至实际大小。以储备溶液作为冷冻保护剂，将晶体闪冻并储存于液氮中。微观结晶学数据收集和处理以先进光子源(Advanced Photon Source)的光束线23-1D,利用10 μ m直径光束，测量衍射数据。用低剂量的1.0°旋转图像定位并集中用于数据收集的晶体。以1.0°的框、通常为5-10秒的曝光时间、5x的衰减光束，测量数据。在发射明显的辐射损伤前，仅能测量5-10°的数据。整合数据，并以HKL2000包进行标定(Otwinowski 1997)。结构解析和精化(refinement) 用Phaser程序(McCoy2007)，获得分子取代相。研究模型为I)高分辨率卡拉洛尔结合的P2AR结构，PDB id2RHl，但是除去了 T4L和所有的水、配体和脂质分子)和纳米抗体(PDB id3DWT，除去了水分子)，作为研究模型。在放置β 2AR模型后，旋转和平移函数Z得分为8.7和9.0，随后放置的纳米抗体模型的旋转和平移函数Z得分为3.5和11.5。利用组B因素模型，一个B用于主链原子，一个B用于侧链原子，在Phenix (Afonine2005)和Buster (Blanc2004)中精化模型。表5给出了精化统计。不管强各向异性如何(表5)，对于侧链的布局而言，电子密度都是清楚的。配体结合于在HDL颗粒中重构的截短的P2AR受体在竞争结合实验中，比较Nb80和Gs对激动剂的受体亲和性的影响。根据以前公开的方法(Whorton et al.2007),在高密度脂蛋白(HDL)颗粒中重构按以前所述(Rosenbaumet al.2007; Rasmussen et al.2007)纯化的 β 2AR 和 β 2AR_T4L (两者都在位置 365 处截短)，然后将Gs重构到含有β 2AR的HDL颗粒中。用0.6nM[3H] - 二氢阿普洛尔(3H-DHA)作为放射性配体，并用浓度为10_12-10_4M的(-)_异丙肾上腺素(ISO)作为竞争剂。使用IyM的 Nb80。使用 10 μ M 的 GTP Y S。使用含有 0.1%BSA 的 TBS (50mM Tris ρΗ7.4，150mM NaCl)作为结合缓冲液。通过穿过Whatman GF/B滤器(预浸于具有0.3%聚乙烯亚胺的TBS中)，在Brandel采集机上分离结合的3H-DHA与未结合的3H-DHA,并在冷TBS中洗涤。在BeckmanLS6000闪烁计数器中测量放射性配体结合。利用GraphPad Prism软件，由饱和结合曲线，测定DHA的配体结合(Kd)。利用公式Ki=IC50/(1+[L]/Kd)，由IC50值，测定ISO的结合亲和性(Ki值，在表4中制成表)。配体结合于在来自昆虫细胞的膜提取物中的全长β 2AR受体上，用于改善激动剂鉴定基本上按Seifert 和其合作者所述(Seifert et al.1998.Eur.J.Biochem.255:369-382)，对膜提取物进行竞争放射性配体结合实验。将来自昆虫细胞的含有人 β 2AR (Perkin Elmer, cat nr6110106400UA)的 10 μ g 均质膜提取物与 Nb80 或非相关纳米抗体(阴性对照；Irr Nb) 一起,于37° C、在24孔板(Corning Costar)中的在孵育缓冲液(75禮 Tris-HCl,12, 5mM MgC12UmM EDTA 以及 0，2%w/v BSA)中孵育 lh。以 5OOnM的终浓度，应用纳米抗体，相比肾上腺素能受体，所述浓度对应于3000倍过量的纳米抗体。随后，将所研究的适当稀释度系列的配体以及2nM3H-DHA放射性配体(Perkin Elmer catnr NET720001MC;特异性活性为104.4Ci/mmol)添加于纳米抗体结合的膜提取物。用孵育缓冲液将每孔的总体积调整为500 μ 1，并且于37° C将反应混合物在水浴中进一步再孵育I小时。在用细胞采集机(Inotech)将膜提取物收获到玻璃纤维滤器(Whatmann GF/B滤纸)上后，用冰冷的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH7, 4)洗涤滤器，并且将风干的滤器部分转移到含有3.5ml Optiphase ‘Hisafe2’闪烁液体的闪烁管(Perkin Elmer)中。于室温下孵育I小时后，在LKB Wallace闪烁计数器中测量放射性。化合物文库筛选利用竞争放射性配体结合测定，对化合物文库进行激动剂筛选。为此，将10μ g来自表达(表达水平为约lOpmol/mg膜蛋白)人β 2AR的HEK293T细胞的内部制备的膜提取物，与Nb80或非相关纳米抗体(阴性对照)，于30° C、在孵育缓冲液(50mM Hepes pH7.4、ImM CaCl2、5mM MgCl2UOOmM NaCl 以及 0，5%w/v BSA)中预孵育 lh。以 500nM 的终浓度应用纳米抗体，与P2AR相比，其大约对应于3000倍过量的纳米抗体。随后，将装载纳米抗体的膜添加于含有文库化合物和2nM3H-二氢阿普洛尔(DHA)放射性配体的96孔板中。用孵育缓冲液，将每孔总体积调整为100 μ 1，并且将反应幻化为于30° C进一步再孵育I小时。随后，利用在0.3%聚乙烯亚胺中预浸的GF/B玻璃纤维96孔过滤板(Perkin Elmer)，收获膜结合的放射性配体。将过滤板用冰冷的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4)洗涤，并于50° C 干燥 30 分钟。在添加 25 μ I 闪烁流体 MicroScint -0，Perkin Elmer)后，在 WallacMicroBeta TriLux闪烁计数器中测量放射性(cpm)。在HDL颗粒中重构的β 2AR的Bimane荧光光谱为了比较Gs和Nb80结合对受体构象的影响，用环境敏感的荧光探针mono-bromobimane (Invitrogen)、在位于TM6的细胞质端的半胱氨酸265处标记纯化的β 2AR,并将其重构到HDL颗粒(mBB-132AR/HDL)中。在获得荧光发射光谱之前，于RT、在缓冲液(20mM HEPES pH7.5, IOOmM NaCl)中，在缺少或存在10 μ M IS0、lyM反向激动剂IC1-118, 551 (ICI)、300nM Gs 异三聚体或 300nM Nb80 或 ISO 与 Gs 组合、ISO 与 Nb80 组合以及 ICI 与 Nb80 组合的情况下，将 IOnM mBB- β 2AR/HDL 孵育 30min。在 Spex FluoroMax-3分光焚光计(Jobin Yvon Inc.)上、以光子计数模式、利用5nm的激发和发射带通，进行焚光光谱。将激发设定在370nm，并且以Inm增量、0.3sec/nm积分时间，从415-35nm收集发射。针对来自缓冲液和配体的背景荧光，校正荧光强度。表1.β 2AR特异性纳米抗体的列表
权利要求
1.蛋白结合结构域，其能特异性结合GPCR的功能构象状态。
2.权利要求1的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域在结合后能稳定GPCR的功能构象状态。
3.权利要求1-2中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域在结合后能在GPCR中诱导功能构象状态。
4.权利要求1-3中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR的功能构象状态选自基础构象状态或活性构象状态或非活性构象状态。
5.权利要求1-4中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR的功能构象状态是活性构象状态。
6.权利要求1-5中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域能特异性结合与激动剂结合的GPCR和/或增强GPCR对激动剂的亲和性。
7.权利要求1-6中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域在结合后能增强GPCR的功能构象状 态的热稳定性。
8.权利要求1-7中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域能特异性结合所述GPCR的功能构象状态的构象表位。
9.权利要求8的蛋白结合结构域，其中所述构象表位是细胞内表位。
10.权利要求8-9中任一项的蛋白结合结构域，其中所述构象表位包含于用于下游信号传导蛋白的结合位点中。
11.权利要求8-10中任一项的蛋白结合结构域，其中所述构象表位包含于G蛋白结合位点中。
12.权利要求1-11中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4个构架区和3个互补决定区或其任何合适的片段。
13.权利要求1-12中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域来源于骆驼抗体。
14.权利要求1-13中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域包含纳米抗体序列或其任何合适的片段。
15.权利要求14的蛋白结合结构域，其中所述纳米抗体包含选自SEQID ΝΟ:1_29的序列或其任何合适的片段。
16.权利要求1-15中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR是哺乳动物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆虫蛋白。
17.权利要求16的蛋白结合结构域，其中所述哺乳动物蛋白是人蛋白。
18.权利要求1-17中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR选自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR视紫红质家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCR Frizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。
19.权利要求1-18中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR是肾上腺素能受体，如α肾上腺素能受体或β -肾上腺素能受体，或其中所述GPCR是毒蕈碱受体,如Ml毒蕈碱受体或M2毒蕈碱受体或M3毒蕈碱受体或Μ4毒蕈碱受体或Μ5毒蕈碱受体,或其中所述GPCR是血管紧张素受体，如血管紧张素IIl型受体或血管紧张素Π2型受体。
20.复合体，包含(i)蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体。
21.权利要求20的复合体，包含(i)权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体。
22.权利要求20-21中任一项的复合体，其中所述受体配体选自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体或其任何合适的片段。
23.权利要求20-22中任一项的复合体，其中所述复合体采用溶解的形式或固定化于固相支持物。
24.权利要求20-23中任一项的复合体，其中所述复合体是晶体。
25.晶体形式的复合体，包含⑴蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体，其中所述晶体形式是通过使用权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域获得的。
26.细胞组合物，包含权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域和/或权利要求20-24中任一项的复合体。
27.权利要求26的细胞组合物，其中所述蛋白结合结构域在GPCR结合所述蛋白结合结构域后能稳定和/或诱导所述GPCR的功能构象状态。
28.权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域或权利要求20-24中任一项的复合体或权利要求26-27中任一项的细胞组合物用于稳定和/或诱导GPCR的功能构象状态的用途。
29.权利要求28的用途，用于结晶和/或解析功能构象状态的GPCR的结构。
30.权利要求1-19 中任一项的蛋白结合结构域或权利要求20-24中任一项的复合体或权利要求26-27中任一项的细胞组合物用于捕获功能构象状态的GPCR的用途。
31.权利要求30的用途，用于捕获与受体配体复合或与一个或多个下游相互作用蛋白复合的功能构象状态的GPCR。
32.权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域或权利要求20-24中任一项的复合体在GPCR相关疾病如癌症、自身免疫病、传染病、神经病、心血管疾病的诊断或预后中的用途。
33.测定功能构象状态的GPCR的晶体结构的方法，所述方法包括以下步骤: (i)提供权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域、靶GPCR以及任选存在的受体配体，和 (ii)形成所述蛋白结合结构域、所述GPCR以及任选存在的所述受体配体的复合体，以及 (iii)结晶步骤(ii)的所述复合体，从而形成晶体， 其中测定功能构象状态的GPCR晶体结构。
34.权利要求33的方法，其中所述方法还包括从所述晶体获得原子坐标的步骤。
35.捕获功能构象状态的GPCR的方法，所述方法包括以下步骤: a.提供权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域和靶GPCRjP b.形成所述蛋白结合结构域与所述GPCR的复合体， 其中捕获功能构象状态的GPCR。
36.捕获功能构象状态的GPCR的方法，所述方法包括以下步骤: a.将含有多种构象状态的GPCR的溶液应用于具有固定化的权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域的固相支持物，和b.形成所述蛋白结合结构域与所述GPCR的复合体，以及 c.除去弱结合或未结合的分子， 其中，捕获功能构象状态的GPCR。
37.权利要求35-36中任一项的方法，其中所述方法还包括纯化所述复合体的步骤。
38.药物组合 物，包含治疗有效量的权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域和至少一种药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。
39.权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域或权利要求38的药物组合物用于调节GPCR信号传导活性的用途。
40.权利要求39的用途，用于阻断G蛋白介导的信号传导。
41.权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域或权利要求38的药物组合物，用于治疗GPCR相关疾病如癌症、自身免疫病、传染病、神经病、心血管疾病。
42.试剂盒，包含权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域或权利要求20-24中任一项的复合体或权利要求任一项的细胞组合物。
全文摘要
本发明涉及GPCR结构生物学和信号传导领域。具体而言，本发明涉及针对或能特异性结合G蛋白偶联受体(GPCR)的功能构象状态的蛋白结合结构域。更具体地，本发明提供能增强GPCR的功能构象状态的稳定性、特别是能增强活性构象状态的GPCR的稳定性的蛋白结合结构域。本发明的蛋白结合结构域可以用作对结合各种天然和合成配体的G蛋白偶联受体进行结构和功能表征的工具，以及用于以GPCR为目标的筛选和药物发现工作的工具。此外，本发明还包括这些蛋白结合结构域用于GPCR相关疾病的诊断、预后以及治疗的用途。
文档编号G01N33/543GK103180734SQ201180044888
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年7月16日
发明者J·斯泰亚特, E·帕尔东, S·拉斯穆森, J·冯, B·科比尔卡, T·莱里曼斯 申请人:弗拉芒区生物技术研究所, 布鲁塞尔自由大学, 利兰斯坦福初级大学董事会