专利名称：杠板归药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材的指纹图谱的建立方法，尤其是杠板归药材高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的杠板归药材的标准指纹图谱。
背景技术：
我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量标准和科学的检测手段，难以有效的控制其内在质量，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。加强中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。杠板归(Polygonum perfoliatum L.)为寥科寥属植物，其以全草入药，性味酸、苦、寒，有小毒，具有清热解毒、利水消肿、清热活血等功效；别名蛇不过、蛇倒退、猫爪刺、梨头刺等；广布于四川、湖南、贵州等地，生于山谷、灌木丛中或水沟旁；是贵州常用的苗族 药材，在民间有广泛应用，在治疗炎症尤其是妇科炎症方面有很好的疗效。它具有较高的药用价值，全株可入药，并且疗效确切，具有很大的开发潜力。杠板归药材成分复杂，主要包括以下几类黄酮类、蒽醌类化合物、苯丙素类化合物、香豆素类的衍生物、苯丙素类及其他一些常见物质。研究表明，杠板归药材具有一定的药理作用。因此，对其某ー种或几种活性成分进行检测，就有失全面，不能真实反映杠板归药效的整体性。要全面有效地控制杠板归及其成方制剂的质量，必须对它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物的质量控制中亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已成为国际共识。为了有效控制及评价杠板归药材的质量，使其质量控制技术更加完善、科学，申请人对杠板归こ醇提取物进行了全面系统的指纹图谱研究，建立了杠板归药材こ醇提取物的指纹图谱測定方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种杠板归药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。本发明通过对杠板归药材HPLC指纹图谱的研究，提供了一种更好的杠板归质量检测方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使杠板归药材的质量控制技术更为完善、科学。本发明的技术方案杠板归药材指纹图谱的建立方法包括以下步骤( I)供试品溶液的制备取杠板归药材粉碎，过筛，称取样品，用こ醇加热回流提取I 4次，每次O. 5-3小时，然后浓缩，用甲醇定容,过滤,滤液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备取适量槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；(3)測定分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱仪測定；将杠板归供试品溶液注入高效液相色谱仪，以O. 05%H3P04水溶液为A相、こ腈为B相进行梯度洗脱，洗脱液进入DAD紫外检测器，检测器采集85min的检测数据；
(4)以对照品色谱峰的相对保留时间和峰面积为1，计算供试品色谱峰的相对保留时间和峰面积，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到杠板归药材标准指纹图谱。前述方法中，高效液相色谱测定时的色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为B相こ腈和A相O. 05%H3P04水溶液；检测波长340nm ;流速lmL/min。前述方法中，供试品溶液的制备过程为取杠板归药材粉碎过40目筛，准确称取样品I克，加入70%こ醇溶液80mL，置于80°C水浴中，加热回流提取I次、3h，然后浓缩至干，用甲醇定容至25mL，过滤，即得供试品溶液。前述方法中，对照品溶液的制备为取槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸两种对照品，分别加入甲醇，制成每Irnl分别含10 μ g槲皮素、10 μ g槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸的两种对照品溶液。前述方法的步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μし前述方法的流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的Α、B相变化为0 lOmin，B相10% 15% ；10 40min，B 相 15% 25% ；40 55min，B 相 25% 35% ；55 75min，B 相35% 50% ；75 76min，B 相 50% 90% ；76 85min，B 相 90%。如上所述杠板归药材指纹图谱的建立方法得到的杠板归药材标准指纹图谱；该图谱中的共用峰不得少于15个。与现有技术相比，本发明具有以下优点I.研究表明，杠板归药材有各种具体的药理作用，若对其某ー种活性成分进行检测，就有失全面。本发明以杠板归こ醇提取物建立起来的HPLC指纹图谱，提供了一种可全面评价杠板归药材的科学途径，能有效地表征杠板归药材的质量，可作为杠板归药材质量检测和质量控制的标准指标之一。2.将杠板归药材指纹图谱作为ー个整体看待，注重其整体面貌特征，既避免了只測定一、两个化学成分来判定杠板归整体质量的片面性，又減少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价杠板归药材的质量提供了新的对照标准，为提高杠板归及其成方制剂的质量和疗效做出贡献。3.本发明具有方法简便、稳定、精密度高以及重现性好等特点。由于指纹图谱不是为了測定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。因此，本发明选择在340nm波长处进行測定，其出峰较多，反映的信息较完全；各个峰吸收值良好，基线平稳，也避免了近紫外杂质峰较大吸收情況。4.以往为测定杠板归中某种化学成分的含量，往往要对样品进行较复杂的处理，而本发明选用加热回流提取其成分，提取方法简单，节约了检验的成本和时间。5.本发明方法所得杠板归指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。下面结合实施例和附图对本发明做进ー步的说明。


图I是加热回流提取的杠板归药材指纹图谱。图2是超声提取的杠板归药材指纹图谱。图3是甲醇作为提取溶剂的杠板归HPLC指纹图谱。图4是90%こ醇作为提取溶剂的杠板归HPLC指纹图谱。图5是70%こ醇作为提取溶剂的杠板归HPLC指纹图谱。图6是こ酸こ酯作为提取溶剂的杠板归HPLC指纹图谱。图7是以CH3CN-O. 2%HC00H为流动相按不同梯度进行測定的杠板归指纹图谱。图8是以CH3CN-O. 2%HAc为流动相按不同梯度进行測定的杠板归指纹图谱。 图9是以CH3CN-O. 02%H3P04为流动相按不同梯度进行測定的杠板归指纹图谱。图10是以CH3CN-O. 05%H3P04为流动相按不同梯度进行測定的杠板归指纹图谱。图11是用色谱柱ZORBAX SB-C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m)测得的杠板归药材指纹图
-i'Tfeレ曰。图12是用色谱柱Eclipse XDB-C8 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)测得的杠板归药材指纹图
-i'Tfeレ曰。图13是用色谱柱Lichrospher C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)测得的杠板归药材指纹图谱。图14是在258nm波长处进行测定的杠板归药材指纹图谱。图15是在310nm波长处进行测定的杠板归药材指纹图谱。图16是在340nm波长处进行测定的杠板归药材指纹图谱。图17是在370nm波长处进行测定的杠板归药材指纹图谱。图18是杠板归药材指纹图谱的共有模式图。图19是杠板归药材指纹图谱的叠加图。图20是杠板归药材HPLC标准指纹图谱。
具体实施例方式
具体实施例方式杠板归药材HPLC指纹图谱的建立方法及杠板归药材标准指纹图谱I.仪器与试药I. I 仪器安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦DAD检测器；安捷伦色谱工作站。I. 2 试药槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸，由实验室成员分离纯化，经IR、IH-NMR和13C-NMR等图谱数据鉴定为槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸；こ腈，色谱纯；乐百氏纯净水；针筒式微孔滤膜过滤器，直径13mm，0. 45 μ m ;杠板归药材。2.方法与结果2. I提取方法的选择在实验过程中，选择加热回流和超声提取两种方式进行了測定，分别见附图I、图2，结果表明，加热回流提取，能够体现更多的化学成分。为了更好更全面地选取指纹图谱的条件，实验对甲醇、90%こ醇、70%こ醇、こ酸こ酯等溶剂进行了測定，分别见附图3、图4、图5、图6，结合几个大峰峰面积的比较，结果70%こ醇提取效果最好。实验对70%こ醇的用量进行了考察，分别用40mL、60mL、70mL、80mL来提取杠板归药材，结果发现，80mL用量是最好的。还对加热回流提取时间2h、3h、4h、5h进行了测定，结果发现,加热回流3h是最适合的提取时间。综上所述，供试品溶液的制备 条件为取不同批次杠板归药材粉末各约lg，精密称定，置于150mL具塞锥形瓶中，加入70%こ醇80mL，置水浴中加热回流3h (80°C )，冷却，滤过，取续滤液，水浴挥干，浸膏用甲醇定容至25mL容量瓶中，用O. 45Mm滤膜滤过，取续滤液，即得。2. 2色谱条件2. 2. I流动相的选择申请人:用了四组流动相来进行比较，即CH3CN -O. 2%HC00H水系统、CH3CN -O. 2%HAc水系统、CH3CN -O. 02%H3P04水系统、CH3CN -O. 05%H3P04水系统。所得结果分别见附图7、图8、图9、图10。由图可见，图10的谱图最好。也就是CH3CN-O. 05%H3P04水系统作为流动相效果比其他3种系统明显要好，梯度洗脱效果最佳，谱图上各个色谱峰的分离度良好，保留时间适中，因此选择CH3CN-O. 05%H3P04水系统作为流动相梯度洗脱系统。2. 2. 2液相色谱柱的选择指纹图谱的研究一般需要用三根以上不同的色谱柱进行比较，经过实验比较后，固定用同一根色谱柱做完整个指纹图谱。申请人考察了 3根不同的色谱柱[①色谱柱ZORBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym) !② EclipseXDB_C8 (4· 6 X 250mm，5 μ m)色谱柱；③色谱柱Lichrospher C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)],在选定的相同色谱条件下进行測定。由所得谱图结果(见附图11、图12、图13)可见柱③的分离效果最好，柱效最高，故选择柱③进行杠板归药材指纹图谱的检测。2. 2. 3检测波长的选择为了获取多层次的信息，申请人选择了 258nm、310nm、340nm及370nm四个波长同时测定，并进行全波长扫描，选取最佳波长，见附图14、图15、图16及图17，结果在波长340nm下出现的色谱峰较多，槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸吸收最強，且基线平稳，故选择340nm作为杠板归HPLC指纹图谱的检测波长。通过以上实验，确定色谱条件如下色谱柱LichrospherC18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m);流动相こ腈-O. 05% 磷酸水溶液；流速lmL/min ;检测波长340nm ;柱温30で。3.杠板归药材指纹图谱的测定3. I. I杠板归指纹图谱的制备对照品溶液的制备取槲皮素、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸两种对照品，分别加入甲醇，制成姆Iml分别含10 μ g槲皮素、10 μ g槲皮素-3_0_β _D_葡萄糖醒酸的两种对照品溶液。參照物选用槲皮素、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸作为參照物。供试品溶液的制备取不同批次杠板归药材粉末各约lg，精密称定，置于150mL具塞锥形瓶中，加入70%こ醇80mL，置水浴中加热回流3h(80°C )，冷却，滤过，取续滤液，水浴挥干，浸膏用甲醇定容至25mL容量瓶中，用O. 45ΜΠ1滤膜滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μ L，分别注入高效液相色谱仪，进行測定，记录85分钟的色谱图，即得到所需指纹图谱。以槲皮素、槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸色谱峰的相对保留时间和峰面积计算供试品色谱峰的相对保留时间和峰面积。同吋，用指纹图谱软件对所得数据和图谱进行处理即得到标准指纹图谱。3. I. 2精密度实验取修文扎佐的杠板归药材，按本发明技术方案所述的供试品溶液制备方法制备供试品，连续进样6次，以槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸为检测指标，计算相对峰面积的RSD 为2. 47%，结果表明仪器精密度良好。3. I. 3稳定性实验取修文扎佐的杠板归药材，按本发明技术方案所述的供试品溶液制备方法制备供试品，分别在0、2、4、8、12、24h进样，进样量为20 μ L，以槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸为检测指标，计算相对峰面积的RSD为2. 51%，结果表明在24小时内，杠板归指纹图谱的色谱图基本稳定，没有明显变化，符合指纹图谱要求。3. I. 4重现性实验取修文扎佐的杠板归药材6份，按本发明技术方案所述的供试品溶液制备方法平行制备6份供试品，分别进样，以槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸为检测指标，计算相对峰面积的RSD为2. 51%，结果表明该方法的重现性良好。3. I. 5杠板归药材指纹图谱共有峰的确定和相似度计算通过对全国51批不同产地的杠板归药材指纹图谱的測定，药材来源见表1，并通过计算机辅助相似度评价系统指纹图谱软件(国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统(2004 A))对色谱图和測定的数据进行处理，确定共有峰15个。得到了 51批药材的指纹图谱叠加图(附图19)，指纹图谱共有模式图(附图18)，药材指纹图谱的相似性分析结果(表2,序号同表1)，其中以槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醒酸为參照物,其峰为6号峰(附图18)。全国不同产地杠板归指纹图谱相似度计算和相似性分析结果如下表I 51批杠板归药材来源
权利要求
1.一种杠板归药材指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤 (1)供试品溶液的制备取杠板归药材粉碎，过筛，称取样品，用乙醇加热回流提取I 4次，每次O. 5-3小时，然后浓缩，用甲醇定容，过滤，滤液作为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备取适量槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液； (3)测定分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱仪测定；将杠板归供试品溶液注入高效液相色谱仪，以O. 05%Η3Ρ04水溶液为A相、乙腈为B相进行梯度洗脱，洗脱液进入DAD紫外检测器，检测器采集85min的检测数据； (4)以对照品色谱峰的相对保留时间和峰面积为1，计算供试品色谱峰的相对保留时间和峰面积，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到杠板归药材标准指纹图-i'TfeP曰。
2.根据权利要求I所述杠板归药材指纹图谱的建立方法，其特征在于高效液相色谱测定时的色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为B相乙腈和A相O.05%H3P04水溶液；检测波长340nm ;流速lmL/min。
3.根据权利要求I所述杠板归药材指纹图谱的建立方法，其特征在于供试品溶液的制备过程为取杠板归药材粉碎过40目筛，准确称取样品I克，加入70%乙醇溶液80mL，置于80°C水浴中，加热回流提取I次、3h，然后浓缩至干，用甲醇定容至25mL，过滤，即得供试品溶液。
4.根据权利要求I所述杠板归药材指纹图谱的建立方法，其特征在于对照品溶液的制备为取槲皮素、槲皮素-3_0-i3-D-葡萄糖醛酸两种对照品，分别加入甲醇，制成每Iml分别含10 μ g槲皮素、10 μ g槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸的两种对照品溶液。
5.根据权利要求I所述杠板归药材指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μ L0
6.根据权利要求I所述杠板归药材指纹图谱的建立方法，其特征在于流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的Α、B相变化为0 lOmin，B相10% 15% ；10 40min，B相15% 25% ；40 55min，B 相 25% 35% ；55 75min，B 相 35% 50% ；75 76min，B 相 50% 90% ；76 85min, B 相 90%。
7.如权利要求I所述杠板归药材指纹图谱的建立方法得到的杠板归药材标准指纹图-i'TfeP曰。
8.根据权利要求7所述的杠板归药材标准指纹图谱，其特征在于所述图谱中的共用峰不得少于15个。
全文摘要
本发明公开了一种杠板归药材指纹图谱的建立方法，包括以下步骤供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、高效液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法得到的杠板归药材标准指纹图谱。与现有技术相比，本发明方法简便、稳定、精密度高、重现性好，所得杠板归指纹图谱的峰多，峰形好，峰分离效果好，峰面积较大，易于鉴别，相似性高，准确可靠；可作为杠板归药材的标准指纹图谱；提供了一种可全面评价杠板归药材的科学途径，能有效地表征杠板归药材的质量，可作为杠板归药材质量检测和质量控制的标准指标之一，为提高杠板归及其成方制剂的质量和疗效做出贡献。
文档编号G01N30/06GK102735766SQ201210161280
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者周欣, 田莉, 赵超, 陈华国 申请人:贵州师范大学, 贵州远程制药有限责任公司