专利名称：一种用于hplc测定丝瓜种子内源激素含量的样品前处理方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种用于HPLC测定丝瓜种子内源激素含量的样品前处理方法。
背景技术：
丝瓜是我国南北皆可栽培的蔬菜作物。丝瓜除自身具有丰富的营养价值外，还有医疗保健作用，具有清热化痰等功效。深入研究丝瓜种子，可为丝瓜良种繁育提供理论基 础。植物激素是植物生命活动的重要调控者。植物激素自身在植物体内含量甚微，组成复杂，再加上种子材料中干扰物质较多，因而，对种子内的植物激素进行测定比较困难。高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,又称高效液相层析，简称HPLC)，它作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中，常用于医药品、化学、环保、生命科学、与食品工业的研究上。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成份分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。高效液相色谱具有重现性好，检测限低等优点，是检测植物激素较为理想的方法。该方法也成功应用到多种植物种子内源激素测定上。然而，高效液相色谱法，对样品前处理要求高。因此设计一个合理的样品前处理方法是成功利用HPLC分析待测物质的关键环节。当前用于植物激素前处理的多是采用80%的甲醇作为提取液，利用旋转蒸发仪进行浓缩，使用PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮)或C18预处理小柱进行激素的纯化。这种前处理方法不但实验费用较高，而且操作复杂、费时费事。目前，对丝瓜种子内激素含量的测定，尚未见公开报道，且利用上述前处理方法，来处理丝瓜种子效果不甚理想。再加上丝瓜种子自身脂肪等干扰物质含量高，因此，设计一种适合丝瓜种子的前处理方法十分必要。

发明内容
本发明方法的目的是提供一种利用高效液相色谱测定丝瓜种子内源激素样品前处理的方法，处理步骤包括乙腈浸提，氮吹浓缩，冷冻去脂等，该方法可有效出去脂肪等杂质，且操作简单，结果可靠，经济高效。本发明提供的技术方案如下所述。一种用于HPLC测定丝瓜种子内源激素含量的样品前处理方法，其处理步骤包括
1)制备待测丝瓜种子植物激素粗提液；
2)浓缩粗提液后，再加入3ml pH=8. 0磷酸缓冲溶液(0. lmol/L)；3)冷冻去脂，过滤除杂；
4)用稀盐酸(0.5 mol/L)调解至pH=3. (T3. 5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；
5)将酯相浓缩后，用流动相定容至Iml，经0.45 Pm的微孔滤膜过滤，用于HPLC分析。其中，所述待测丝瓜种子植物激素粗提液的制备方法为准确称取I. 000 g去除外种皮的丝瓜种子，在液氮条件下研成粉末，并装入IOml带盖离心管中，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4°C冰箱浸提24 h，低温离心10 min (10000 r/m)取上清液，再向残渣中加入
4ml的冷乙腈低温超声振荡I h,离心10 min (10000 r/m)取上清液,重复提取2次,合并3次上清液。

其中，在所述的前处理方法中，所述步骤2)及步骤5)中的浓缩方法是指将步骤I)制备的丝瓜种子植物激素粗提液或步骤4)所得的酯相在35 1下用氮气吹干。其中，在所述的前处理方法中，所述步骤3)中冷冻去脂，过滤除杂的方法为将步骤2)所得溶液放入-80 °C超低温冰箱中冰冻30 min，然后在4°C条件下解冻，低温离心15min (10000 r/m),过滤弃去杂质即可。本发明的显著优点是本方法操作简单，成本低，可以一次处理多个样品，可节省时间，纯化过程中未做过柱处理，减少了待测物在提取过程中的损失。本方法可用于多种植物激素的提取的前处理，并可满足高效液相色谱对样品处理的要求。
具体实施例方式下面给出本发明的较佳的实施例，这些实施例并非限制本发明的内容。本发明所用仪器装置包括氮吹仪，超声振荡仪，低温高速离心机，超低温冰箱和普通冰箱。实施例I 处理步骤包括
准确称取样品I. 000 g去掉外种皮的丝瓜种子，在液氮条件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低温离心10 min (10000 r/m)取上清液，再向残渣中加入4 ml的冷乙腈低温超声振荡I h,离心10 min (10000 r/m)取上清液,重复提取2次，合并3次上清液。利用乙腈浸提不但可减少杂质的溶出，且乙腈易挥发，有利于加快氮吹浓缩的效率，缩短实验用时。在35 °C下用氮气吹干,加入3 ml pH=8. 0的磷酸缓冲溶液(0. I mol/L)。氮吹仪一次可处理多个样品，起到缩短实验用时的作用。放入-80 °C超低温冰箱中，冰冻30 min，在4 °C条件下解冻，低温离心15 min(10000 r/m)，过滤弃去杂质。相对于过柱处理，此操作方便易行。用盐酸(0. 5 mol/L)调解至pH=3. (T3. 5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；在35 1条件下氮气吹干，用流动相定容至I ml，溶液经0.45 U m的微孔滤膜过滤后进行HPLC测定。
实施例2
利用本方法测定发育中的丝瓜种子内源激素ABA的含量。
准确称取样品I. 000 g去掉外种皮的丝瓜种子，在液氮条件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低温离心10 min (10000 r/m)取上清液，再向残洛中加入4 ml的冷乙腈,低温超声振荡I h,离心10 min (10000 r/m)取上清液,重复提取2次,合并3次上清液。在35 °C条件下用氮气吹干，加入3 ml pH=8. 0的磷酸缓冲溶液(0. I mol/L)，放A -80 °C超低温冰箱中冰冻30 min,在4 °C条件下解冻,低温离心15 min (10000 r/m),过滤弃去杂质，用盐酸(0. 5 mol/L)调解至pH=3. (T3. 5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 1条件下氮气吹干，用流动相定容至I ml，溶液经0.45 y m的微孔滤膜过滤后进行HPLC测定。色谱条件Waters C18反相色谱柱(4. 6 mmX250 mm, 5 iim);柱温35 °C;流动向体积比为5:5的甲醇和水(含0. 2%磷酸)混合溶液；流速0. 8 ml/min ;进样量20 U I ;波长260 nm ;用外标法进行定量测定。利用本方法对植物激素进行前处理得到较好的纯化和富集。该方法与高效液相色 谱连用，成功测定了丝瓜种子内源激素ABA的含量。进行加标回收率实验，平均回收率为80. 53%，相对标准偏差(RSD)小于3. 43%，符合激素测定要求。实际测定授粉后发育28天的杂交丝瓜种子内源ABA含量为1496. 2ng/g Fff (鲜重)
实施例3
利用本方法测定发育中的丝瓜种子内源激素GA3的含量。准确称取样品I. 000 g去掉外种皮的丝瓜种子，在液氮条件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低温离心10 min (10000 r/m)取上清液，再向残洛中加入4 ml的冷乙腈,低温超声振荡I h,离心10 min (10000 r/m)取上清液,重复提取2次,合并3次上清液。在35 °C条件下用氮气吹干,加入3 ml pH=8. 0的磷酸缓冲溶液(0. I mol/L),放A -80 °C超低温冰箱中冰冻30 min,在4 °C条件下解冻,低温离心15 min (10000 r/m),过滤弃去杂质，用盐酸(0. 5 mol/L)调解至pH=3. (T3. 5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 1条件下氮气吹干，用流动相定容至I ml，溶液经0.45 y m的微孔滤膜过滤后进行HPLC测定。色谱条件Waters C18反相色谱柱(4. 6 mmX250 mm, 5 iim);柱温35 °C;流动向体积比为5:5的甲醇和水(含0. 2%磷酸)混合溶液；流速0. 8 ml/min ;进样量20 U I ;波长205 nm ;用外标法进行定量测定。利用本方法对植物激素进行前处理得到较好的纯化和富集。该方法与高效液相色谱连用，成功测定了丝瓜种子内源激素GA3的含量。进行加标回收率实验，平均回收率为71. 33%，RSD小于3. 84%，符合激素测定要求。实际测定授粉后发育28天的杂交丝瓜种子内源GA3含量为2223. 5 ng/g Fff (鲜重)。本方法具有良好的发展前景，可进一步用于其他植物激素的前处理。
权利要求
1.一种用于HPLC测定丝瓜种子内源激素含量的样品前处理方法，其特征在于，其处理步骤包括 1)制备待测丝瓜种子植物激素粗提液； 2)浓缩粗提液后，再加入3ml、pH=8. 0,0. lmol/L磷酸缓冲溶液； 3)冷冻去脂，过滤除杂； 4)用0.5 mol/L稀盐酸调解至pH=3. (T3. 5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相； 5)将酯相浓缩后，用流动相定容至Iml，经0.45 Pm的微孔滤膜过滤，用于HPLC分析。
2.如权利要求I所述的前处理方法，其特征在于，所述待测丝瓜种子植物激素粗提液的制备方法为准确称取I. 000 g去除外种皮的丝瓜种子，在液氮条件下研成粉末，并装入IOml带盖离心管中，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4°C冰箱浸提24 h，10000 r/m低温离心10 min取上清液,再向残洛中加入4 ml的冷乙腈低温超声振荡I h, 10000 r/m离心10 min取上清液，重复提取2次，合并3次上清液。
3.如权利要求I所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)及步骤5)中的浓缩方法是指将步骤I)制备的丝瓜种子植物激素粗提液或步骤4)所得的酯相在35 °C下用氮气吹干。
4.如权利要求I所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤3)中冷冻去脂，过滤除杂的方法为将步骤2)所得溶液放入-80 °C超低温冰箱中冰冻30 min，然后在4°C条件下解冻，10000 r/m低温离心15 min,过滤弃去杂质即可。
全文摘要
本发明提供一种用于HPLC测定丝瓜种子内源激素含量的样品前处理方法，其处理步骤包括制备待测丝瓜种子植物激素粗提液；浓缩粗提液后，再加入3ml、pH=8.0、0.1mol/L磷酸缓冲溶液；冷冻去脂，过滤除杂；用0.5mol/L稀盐酸调解至pH=3.0~3.5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；将酯相浓缩后，用流动相定容至1ml，经0.45μm的微孔滤膜过滤，用于HPLC分析。本方法操作简单，成本低，可以一次处理多个样品，可节省时间，纯化过程中未做过柱处理，减少了待测物在提取过程中的损失。本方法可用于多种植物激素的提取的前处理，并可满足高效液相色谱对样品处理的要求。
文档编号G01N30/06GK102830183SQ201210267580
公开日2012年12月19日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者胡晋, 秦国臣, 王洋, 朱岩芳, 祝水金 申请人:浙江大学