专利名称：基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的甲基对硫磷电化学生物传感器的制作方法
技术领域：
·
本发明涉及利用电化学传感器对甲基对硫磷进行检测，特点在于磺酸基功能化的石墨烯的应用，以及该检测方法的超灵敏及易操作性。
背景技术：
甲基对硫磷是一种高毒有机磷酸酯类杀虫剂，具有广谱。高效。量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等优点，曾被广泛应用于农业成产，对多种农作物上的多种害虫的防治起了重要作用。但其残留不仅对生态环境造成严重的污染与危害，而且还可以通过食物链作用在人体积累，引发各种疾病，危及人类健康。因此在很多国家已经被禁用，但在农产品的进出口贸易、环境安全和食品的监督检测中，甲基对硫磷等一类高毒化合物仍然是常规检测的重要污染物。为此，迫切需要加强甲基对硫磷农药的检测方法、检测器件的研究，建立快速、可靠、灵敏和实用的甲基对硫磷农药检测的分析方法，对保障食品安全、保护生态环境，维护人类身体健康有着重要的现实意义。目前，有关甲基对硫磷的测定方法主要有色谱法。色谱与质谱联用法、免疫测定法及电化学分析法。传统的甲基对硫磷检测方法色谱法与色-质联用法，尽管灵敏、准确，但是需要对样品进行繁琐的预处理、费时、成本高，而且所需仪器大都昂贵且庞大笨重，需要专业技术人员维护，不适用于现场检测。带有硝基芳香环的有机磷农药如甲基对硫磷、甲基对氧磷和乐果在电极表面展示出了良好的氧化还原性质；并且电化学方法因其拥有灵敏度高、稳定性好、设备成本低、所需空间小等优势成为研究的热点。石墨烯片是指只有一个碳原子层厚度的石墨，碳-碳间依靠共价键连接而形成蜂窝状结构。由于石墨烯具有较大的表面积、优良的导热和导电性能以及很高的机械强度等优点，将其应用于电化学检测已成为研究的热点。并且石墨烯对磷族化合物具有较强的吸附能力，芳香族有机磷农药可以较好地吸附在石墨烯上；同时石墨烯褶皱的表面有利于生物分子以及一些靶物质组装上。然后单层石墨烯之间存在很强的范德华力(5.9kJ moF1)进而容易重新聚集为石墨状态，所以要想利用石墨烯优良的性能要解决这个问题。

发明内容
本发明将新型材料石墨烯应用于甲基对硫磷的检测，以解决上述技术问题。基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的电化学酶传感器检测甲基对硫磷的方法将磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖修饰到裸玻碳电极表面，通过吸附作用将酶固定到电极表面，组成酶传感器。当检测环境中存在目标分析物甲基对硫磷时，目标物同固定在电极表面的乙酰胆碱酯酶发生不可逆的磷酸化反应，抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，进而使得固定酶同底物氯化乙酰胆碱反应产生的电活性物质巯基乙酰胆碱量减少，响应电流也随之减弱，以此现象对甲基对硫磷标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含有甲基对硫磷样品进行定量检测的目的。步骤为
(I)磺酸基功能化石墨烯的制备在冰浴的条件下，将2g的石墨片和I. 6g的硝酸钠添加到67. 5mL98%的H2SO4中；然后在搅拌中加入9g KMn04 :将混合物在35°C条件下搅拌35分钟；之后在室温下保持反应5天再将560mL温水缓缓加入烧瓶，并用30%的过氧化氢溶液处理，至悬浮液变成亮黄色；最后将悬浮液进行离心，用超纯水清洗后再70°C下烘干。将得到的氧化石墨烯在超纯水中超声2h，将未分散的氧化石墨烯离心除去；再取IOmL均一分散的氧化石墨烯同5mL浓度为lmg/mL的聚苯乙烯磺酸钠进行混合,搅拌30min ;接着将O. 4mL质量分数为85%的肼溶液添加进去，将此混合液在100°C下冷凝回流4h ;之后将混合物冷却至室温，离心后用超纯水清洗三遍以去除过量的肼和聚苯乙烯磺酸钠；将得到的浓度为lmg/mL磺酸基功能化的石墨烯在4°C下保存。(2)裸玻碳电极的抛光与清洗裸电极依次用粒径为I μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉末各打磨7min，每次换不同粒径氧化铝粉末前都用水将打磨布和电极上残余的粉浆冲洗干净，之后分别用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声5min，然后用氮气将电极吹干。(3)裸玻碳电极的测试称取3. 73g KCl及O. 082g K3Fe (CN)6溶于50mL容量瓶中，配成5mM Fe(CN)63_和I M KCl溶液，取5mL该溶液置于反应池中；以打磨好的电极为工作 电极，银/氯化银为参比电极，钼丝为对电极组成三电极系统进行测试，工作电压为-O. 2 O. 6V，扫速为100mV/s，直到得到峰形稳定、形状良好、峰与峰差值小于65mV的循环伏安图。(4)电极修饰将O. 25g壳聚糖溶于50mL2M醋酸溶液中得到O. 5%的壳聚糖溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至5. O。取100 μ L的壳聚糖溶液与200 μ L的石墨烯溶液混合，超声20min得到均一混合液；用移液枪吸取5 μ L的混合液并滴涂在电极表面,用红外灯烘干；然后用移液枪吸取4μ L酶液滴涂在修饰膜上，将电极至于25°C培养箱中30min，得到固定了酶的电极。本发明将磺酸基功能化石墨烯应用于电化学传感器，有效的解决了石墨烯重新团聚为石墨；并且石墨烯的应用大大提高了传感器的响应电流，起到了信号放大的作用，有效的防止了其他氧化物的干涉，提高了本发明甲基对硫磷残留检测的精度和灵敏度；该传感器以玻碳电极为工作电极，银/氯化银为参比电极，钼电极为对电极，以乙酰胆碱酯酶与氯化乙酰胆碱反应生成电活性的巯基乙酰胆碱为检测信号，通过对不同浓度甲基对硫磷标准品的检测，建立标准曲线，达到对含甲基对硫磷样品进行定量检测的目的，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。


图I :基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖电化学酶传感器检测甲基对硫磷的实验原理图。图2 :制备石墨烯材料的表征图。a :制备的氧化石墨烯的原子力显微镜图；b :制备的磺酸基功能化石墨烯的透射电镜图。图3 :对甲基对硫磷检测的相关图。A :不同浓度农药标准品抑制后的循环伏安曲线图:固定酶抑制率与农药浓度对数值的标准曲线。
具体实施例方式实施例I :
将制备好的电化学酶传感器置于甲基对硫磷标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0ng/mL、0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、IOng/mL、50ng/mL、100ng/mL，选用工作电压为0. 2V LOV，扫速为100mV/s，工作缓冲体系为NaH2PO4-Na2HPO4 (pH = 7. O)，每个浓度分别抑制16min ;取出电极后用超纯水清洗电极表面以除去残留的农药，然后将电极置于装有浓度为5mM氯化乙酰胆碱的反应池中反应2min，用公式A%= (I0-IP)/I0X100% (其中A%代表酶抑制率，Ic^P Ip表示未被农药抑制与被农药抑制后反应的峰电流值)计算出固定酶的抑制率，并据此与对应的甲基对硫磷标准品浓度建立标准曲线，线性范围是A%= O. 061gC+0. 2458，R2 = O. 9898 :检测限为5pg/mL。实施例2:将白菜叶片撕下展开，将农药均匀喷洒在叶片上，然后切碎混匀。称取10. OOg混匀的试样，置于250mL具塞锥形瓶中，加入30g无水硫酸钠脱水，剧烈振摇；再加入O. 25g活性炭进行脱色；之后加70mL 二氯甲烷，在振荡器上振摇30min，用滤纸对混合物进行过滤。量取35mL滤液，室温下在通风橱中自然挥发至近干，用二氯甲烷少量研洗残渣3次，移入5mL带刻度离心管中，并定容至2. OmL备用。选用工作电压为O. 2V 1.0V，扫速为IOOmV/S，工作缓冲体系为NaH2PO4-Na2HPO4 (pH = 7. O)，将制备的酶电极置于提取液中16min，取出电极后用超纯水清洗电极表面以除去残留的农药，然后将电极置于装有浓度为5mM氯化乙酰胆碱的反应池中反应2min，然后进行电化学测量。表I制备的酶传感器对白菜样品中有机磷农药加标回收试验
权利要求
1.基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的甲基对硫磷电化学生物传感器，其特征在于对裸玻碳电极抛光处理，然后将制备的磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖复合物修饰在电极，接着将こ酰胆碱酯酶固定到复合膜上，制备出电化学酶传感器，对甲基对硫磷标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含甲基对硫磷样品进行定量检测的目的。
2.如权利要求I所述的基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的甲基对硫磷电化学生物传感器的制备，其特征在于裸玻碳电极的抛光处理裸电极依次用粒径为I μ m、0. 3 μ m、·0.05 μ m的氧化铝粉末各打磨7min，每次换不同粒径氧化铝粉末前都用水将打磨布和电极上残余的粉浆冲洗干净，之后分别用超纯水、无水こ醇、超纯水分别超声5min，然后用氮气将电极吹干。
3.如权利要求I所述的基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的甲基对硫磷电化学生物传感器的制备，其特征在于磺酸基功能化石墨烯的制备在冰浴的条件下，将2g的石墨片和I. 6g的硝酸钠添加到67. 5mL98%的H2SO4中；然后在搅拌中加入9g KMn04 ;将混合物在35°C条件下搅拌35分钟；之后在室温下保持反应5天；再将560mL温水缓缓加入烧瓶，并用30%的过氧化氢溶液处理，至悬浮液变成亮黄色；最后将悬浮液进行离心，用超纯水清洗后再70°C下烘干。将得到的氧化石墨烯在超纯水中超声2h，将未分散的氧化石墨烯离心除去；再取IOmL均一分散的氧化石墨烯同5mL浓度为lmg/mL的聚苯こ烯磺酸钠进行混合,搅拌30min ;接着将O. 4mL质量分数为85%的肼溶液添加进去，将此混合液在100°C下冷凝回流4h ;之后将混合物冷却至室温，离心后用超纯水清洗三遍以去除过量的肼和聚苯こ烯磺酸钠；将得到的浓度为lmg/mL磺酸基功能化的石墨烯在4C下保存。
4.如权利要求I所述的基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的甲基对硫磷电化学生物传感器的制备，其特征在于裸玻碳电极的修饰将O. 25g壳聚糖溶于50mL2M醋酸溶液中得到·O.5%的壳聚糖溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至5. O。取100 μ L的壳聚糖溶液与200 μ L的石墨烯溶液混合，超声20min得到均一混合液；用移液枪吸取5μ L的混合液并滴涂在电极表面，用红外灯烘干；然后用移液枪吸取4μ L酶液滴涂在修饰膜上，将电极至于25°C培养箱中30min,得到固定了酶的电极。
5.基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的甲基对硫磷电化学生物传感器，利用循环伏安法，优化各项工作条件工作电压为O. 2 I. 0V，工作缓冲体系为NaH2PO4-Na2HPO4 (pH =·7.O);农药抑制时间为16min，反应时间为2min，固定酶量为4 μし
全文摘要
基于磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖的电化学生物传感器检测甲基对硫磷的方法，属于电化学传感器技术领域，用于蔬菜、水果及其制品中甲基对硫磷残留量的检测。本发明的基础是甲基对硫磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，乙酰胆碱酯酶能够催化氯化乙酰胆碱产生巯基乙酰胆碱的电化学反应。将磺酸基功能化石墨烯-壳聚糖修饰到裸玻碳电极表面，不仅可以有效的将乙酰胆碱酯酶固定在电极上，而且对电化学信号起放大的作用；甲基对硫磷残留量与电化学峰电流相关，进而建立甲基对硫磷定量检测的标准曲线。本发明旨在建立灵敏度高、可操作性强的甲基对硫磷定量检测方法，并拓展新型材料石墨烯的应用。
文档编号G01N27/26GK102706934SQ201210208988
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者何良兴, 张伟龙, 王周平, 贾飞, 金旭忠, 魏云潇 申请人:杭州市余杭区农产品监测中心, 江南大学