专利名称：：珍菊降压制剂质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及药物制剂制备领域，具体涉及珍菊降压制剂质量控制方法。
背景技术：
：珍菊降压制剂是我国特有的小复方中西成药制剂，其活性成份包括野菊花膏粉、珍珠层粉、氢氯噻嗪、芦丁和盐酸可乐定。其中中药成分野菊花，主含菊甙、腺嘌吟、胆碱、小苏碱等，能平肝息风、清心利血脉，具有显著的降血压和改善心肌供血作用。主治头眩、利五脉，药理研究有很好的降压作用，为中药潜阳平肝之品；珍珠层粉主要成分为碳酸钙、壳角质、含有多种氨基酸。有清肝明目、镇静作用，为中药平肝定惊之品。珍菊降压制剂中的西药成分可乐定为中枢性降压药物，并有中枢镇静作用，它主要作用于延髓的背侧孤束核和腹侧“S区”以及下丘脑前部，激活这些区域的α受体，使抑制血管运动中枢兴奋性的神经通路激活，明确可乐定是α受体激动剂，它作为基础药用于神经—内分泌调节作用的研究和作为高血压治疗药。氢氯噻嗪有利尿降压作用，通过利尿排钠，使血浆与细胞外液容量减少，血容量及心排血量降低，因而血压降低。芦丁能降低血管通透性，资料结果显示，该药具有肯定的降压疗效，对于阴虚阳亢患者症状改善尤为明显，经24小时动态血压监测证实，其降压作用明显，降压幅度曲线平稳持久，而单纯西药组治疗前后降压曲线有交叉，说明了珍菊降压制剂组方的合理性。大量临床观察验证，珍菊降压片对各期高血压患者均有明显的降压作用，I、II、III期患者的总有效率分别达到75.6％、79％、71.9％，可见珍菊降压制剂对I、II期高血压疗效较满意。中医认为，高血压患者多因肝肾阴虚、肝阳上亢所致，常见心悸失眠、头痛眩晕等诸多症状，珍菊降压制剂除了对阳虚病因所致的患者无效外，对阳亢型、阴虚阳亢型、阴阳两虚型都有很好疗效。观察珍菊降压片对原发性高血压的疗效。67例原发性高血压患者为观察对象，珍菊降压制剂0.48g/次，每日3次，4周为1疗程，用药前及用药期间测右臂坐位血压，并观察症状改善情况。结果对高血压患者均有效，症状好转，无明显不良反应。结论采用珍菊降压制剂治疗高血压病，无论在降压、缓解症状等方面疗效满意，且副作用小，病人易于接受。由于珍菊降压制剂，价格低廉，疗效确切，因此深受病家的欢迎。但长期以来该复方制剂一直没有准确的定量分析质量控制方法，因此影响正确评价制剂产品的质量。随着国家对药物的安全性、有效性、均一性和稳定性的要求的逐步加强，对于复方制剂的药物组分定量分析显得更为重要。
发明内容本发明所要解决的技术问题，在于根据珍菊降压制剂各组分的特性，制定快速、准确、全面，适应于工业化生产的质量控制方法。本发明公开的珍菊降压制剂的质量控制方法包括1、采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，扫描波长为300-600nm的吸收值，计算制剂中总黄酮的含量；其中最佳扫描波长为510nm；2、采用高效液相法，以芦丁和槲皮素为对照品，以乙腈-0.1％-0.4％磷酸水为流动相，检测波长为360-375nm，测定制剂中芦丁和槲皮素含量；其中最佳检测波长为365nm；3、采用高效液相法，以甲醇-磷酸盐缓冲液或乙腈-0.5％的醋酸水溶液为流动相，检测波长为210-230nm，测定制剂中盐酸可乐定含量；其中最佳检测波长为210-214nm；4、采用高效液相法，以甲醇一磷酸盐缓冲液或乙腈-pH3-4的酸水溶液为流动相，检测波长为254nm，测定制剂中氢氯噻嗪的含量。制剂中含总黄酮不得少于8％，含芦丁、槲皮素不得少于6％和0.07％；盐酸可乐定含量标准为标示量的80.0～120.0％，氢氯噻嗪含量为每片标示量的80.0～120.0％。本发明在总黄酮含量测定中根据黄酮化合物与金属盐类试剂(硝酸铝溶液)的络合反应，生成的络合物为黄色，有荧光，可用于定量分析的原理，采用紫外分光光度法进行测定，其具体步骤包括取珍菊降压制剂适量，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入水1ml，充分溶解后，再精密加入甲醇9ml至刻度，超声提取处理15分钟后，放冷，加甲醇至刻度，充分摇匀，取上清液用微孔滤膜滤过，为供试品溶液。芦丁的甲醇液对照品。岛津UV-2401PC，络合试剂是硝酸铝溶液，扫描波长为300-600nm。本发明芦丁、槲皮素含量测定具体步骤包括取珍菊降压制剂适量，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入水1ml，充分溶解后，再精密加入甲醇9ml至刻度，超声提取处理15分钟后，放冷，加甲醇至刻度，充分摇匀，取上清液用微孔滤膜滤过，为供试品溶液。芦丁和槲皮素的甲醇液为对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-0.1-0.4％磷酸水0-9分钟(19∶81)，10-17分钟(33∶67)，18-20分钟(40∶60)，21-22分钟(19∶81)，检测波长360-375nm。本发明盐酸可乐定含量测定中，由于制剂为复方，直接用所得样品液进行液相色谱图，存在很多其他吸收峰，盐酸可乐定的主峰被其他杂峰掩盖，单靠流动相的调整，无法达到理想的分离效果，因此本发明根据盐酸可乐定的物理化学性质，采用酸提取法或碱提取法，对样品进行预处理，然后进行测定，具体步骤如下1、酸提取法取珍菊降压制剂适量，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入1％盐酸50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，加1ml氨水，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，为样品溶液；或碱提取法取本品适量，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入氨水(1→10)50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用水20ml溶解，1％盐酸调节PH至4.0，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，为样品溶液。2、以盐酸可乐定的甲醇液为对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇—磷酸盐缓冲液(15～30∶85～70)或乙睛-0.5％的醋酸水溶液(10～30∶90～70)。磷酸盐缓冲液在1000ml水中加入1g磷酸二氢铵，加磷酸调节pH至3.0，即得。检测波长210-230nm。本发明氢氯噻嗪含量测定具体步骤包括取珍菊降压制剂适量，精密称定，研极细，取0.25g，精密称定，加丙酮50ml，冷浸过夜，振摇提取30分钟，过滤，再用丙酮10ml洗涤残渣，合并滤液，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至50ml，滤过，取续滤液，为供试品溶液。氢氯噻嗪用流动相溶解后作为对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇—磷酸盐缓冲液(15～30∶85～70)，或乙睛-pH3～4的酸水溶液(10～20∶90～80)。磷酸盐缓冲液在0.1M的磷酸二氢钠1000ml水中加入磷酸调节pH至3.0，即得。检测波长254nm。本发明对珍菊降压制剂中各有效成份进行了全面、准确的质量控制，以保证制剂中各有效成份的含量的可控性，使制剂各组份达到有效剂量范围，从而保证疗效。下面通过实施例对本发明质量控制方法及其方法的确定作进一步的描述。图1、芦丁对照品UV全波长扫描2、芦丁、槲皮素标准品HPLC图其中A为芦丁，B为槲皮素图3、盐酸可乐定标准品HPLC4、氢氯噻嗪标准品HPLC5、实施例1芦丁、槲皮素HPLC6、实施例1盐酸可乐定HPLC7、实施例1氢氯噻嗪HPLC图具体实施例方式实施例1、珍菊降压片取野菊花膏粉100g、珍珠层粉100g、盐酸可乐定0.03g、氢氯噻嗪5g、芦丁20g，其中野菊花膏粉、珍珠层粉、氢氯噻嗪和芦丁混匀混匀，另加70％乙醇液适量溶解盐酸可乐定，将乙醇均匀拌入上述混合粉中，反复搅拌后，制成颗粒，干燥，加入润滑剂适量，压制成1000片，包薄膜衣，即得。每次1片，3次/日。测定各组份含量1、总黄酮UV检测波长510nm，含量为9.97％；2、芦丁、槲皮素HPLC检测波长为365nm，含量为6.9％和0.089％，见图5；3、盐酸可乐定HPLC检测波长为210nm，含量为24.7ug，为标示量的82.3％，见图6；4、氢氯噻嗪HPLC检测波长为254nm，含量为4.33mg，为标示量的86.6％，见图7。实施例2、总黄酮含量测定方法学研究1.1方法照中国药典2000年版一部分光光度法(附录VB)测定。1.2仪器与试剂仪器岛津UV-2401PC试剂无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯对照品芦丁(中国药品生物制品检定所批号0080-9905)2方法的专属性本试验根据黄酮化合物与金属盐类试剂(硝酸铝溶液)的络合反应，生成的络合物为黄色，有荧光。可用于定量分析。本实验对方法学进行验证如下2.1对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置50ml量瓶中，加乙醇20ml，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)。2.2对照品最大吸收值确定取上述配制备用的对照品溶液3ml，置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的溶液为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在300～600nm的波长测定，全波长扫描。对照品在300～600nm全波长扫描结果，510nm波长处有最大吸收。见图1。2.3标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0与6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的溶液为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在510nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。表1珍菊降压片总黄酮含量测定方法的标准曲线数值线性方程为Y＝0.0116X-0.0101，相关系数r＝0.9998，表明芦丁量在范围10μg/ml～60μg/ml内与峰面积呈良好的线性关系。2.4样品提取方法取本品约20片，精密称定，研成细粉，精密称取适量(约相当于5片的重量)，精密加入稀乙醇25ml，密塞，摇匀，对不同的超声处理时间和静止时间实验，滤过。精密量取续滤液4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，并取同样量的供试品溶液加水至25ml作空白。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的百分含量，计算，即得。具体如下2.4.1超声时间的研究取本品适量，按供试品溶液项下制备，对超声提取时间在5～25分钟内进行考察。表2珍菊降压片总黄酮含量测定方法的提取时间实验实验结果表明提取5分钟，可以认为提取完全。2.4.2静置时间的研究取本品适量，按供试品溶液项下制备，对静置时间1～3小时内进行考察，实验。表3珍菊降压片总黄酮含量测定方法的静止时间实验结果表明3小时反应稳定。2.5样品、阴性空白样品全波长扫描取本品约20片，精密称定，研成细粉，精密称取适量(约相当于5片的重量)，精密加入稀乙醇25ml，密塞，摇匀，超声处理5分钟，静止3小时，滤过。精密量取续滤液4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，测定吸收度。同法制备空白芦丁、野菊花浸膏的阴性空白样品。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在300～600nm的波长测定，全波长扫描。样品在510nm波长处也有最大吸收，与对照品最大吸收重叠。阴性空白样品510nm波长处没有吸收。结论510nm波长作为本实验的测试波长。2.6珍菊降压片总黄酮含量测定方法的精密度试验精密量取对照品溶液3.0ml，置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的溶液为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在510nm的波长处测定吸收度。平行试验5份。数据见表4。表4珍菊降压片总黄酮含量测定方法的精密度试验结论珍菊降压片总黄酮含量测定方法精密度试验结果的RSD％＜1.0％，证明其方法精密度良好。2.7珍菊降压片总黄酮含量测定方法的日间稳定性试验取同一批号021001的样品约20片，精密称定，研成细粉，精密称取适量(约相当于5片的重量)，精密加入稀乙醇25ml，密塞，摇匀，超声处理5分钟，静止3小时，滤过。精密量取续滤液4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。样品溶液的稳定性试验，分别于0、2、4、8、12、24小时，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度。表5珍菊降压片总黄酮含量测定方法的稳定性结论珍菊降压片总黄酮含量测定溶液放置2、4、8、12、24小时的含量测定结果的RSD％＜2.0％，证明其测定溶液稳定，可用于含量测定。2.8珍菊降压片总黄酮含量测定方法的重现性试验取本品批号021001约20片，精密称定，研成细粉，精密称取适量(约相当于5片的重量)，精密加入稀乙醇25ml，密塞，摇匀，超声处理5分钟，静止3小时，滤过。精密量取续滤液4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度。平行试验五份。表6珍菊降压片总黄酮含量测定方法的重现性试验结论珍菊降压片总黄酮含量测定方法重现性试验结果的RSD％＜2.0％，证明其方法重现性良好。2.9珍菊降压片含量测定的加样回收率分别称取批号021101的样品9份，每份精密称定，加入一定量的对照品，再按样品溶液的制备方法处理，测定其相吸收值，进行计算回收率。表7珍菊降压片总黄酮含量测定方法的加样回收结论总黄酮方法回收率测定结果表明回收率99.31％，RSD＝0.76％，回收率较高，符合要求。根据上述实验结果，本品以样品含量的80％为标准，暂定为本品含总黄酮不得少于8％。实施例3、芦丁、槲皮素含量测定项方法学研究1.1方法照中华人民共和国药典2000年版一部高效液相色谱法(附录VID)测定。1.2仪器与试剂仪器Agilent1100SeriesChemStationforLCRev.A.09.01试剂乙腈(MERCK色谱纯)水(双蒸水，自制)对照品芦丁(中国药品生物制品检定所批号0080-9905)；槲皮素(中国药品生物制品检定所批号0081-9905)。流动相乙腈-0.1％磷酸水0-9分钟(19∶81)，10-17分钟(33∶67)，18-20分钟(40∶60)，21-22分钟(19∶81)检测波长365nm。固定相SBC18柱。理论板数按芦丁峰计算应不低于6000。1.3方法的专属性不同波长的选择根据文献报道芦丁和槲皮素的吸收波长分别为362和375nm，经过本实验360～375nm的摸索，能保证芦丁和槲皮素测定处于最佳的吸收，故将365nm定为测试波长。表8芦丁浓度0.5ml/mg；槲皮素浓度0.5ml/mg。从上述数据分析，能使芦丁和槲皮素的含量测定取365nm检测波长下测定较为合适。流动相的选择分离黄酮类化合物芦丁在水中在酸性条件下稳定性好、峰面积大，实验多采用0.4％的磷酸，但磷酸影响柱子的稳定性，为延长色谱柱的使用寿命，在保证分离度的情况下，将磷酸的含量降至0.1％，表9流动相选择乙腈比例在19％时芦丁峰型对称性好，乙腈比例在33％时槲皮素峰型对称性好，乙腈比例调至40％时，有利于杂质的洗脱，最后乙腈比例在19％，判断基线的平稳性。经过试验槲皮素出峰后调整为乙腈-0.1％磷酸水(V∶V＝40∶60)，可使峰敏锐，对称性在0.95～1.05之间，调整流动相配比，分析时间缩短，并保证了分离度。2、提取方法和时间的确定供试品不同制备方法a取本品10片，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置脂肪提取器中，加入水1ml，充分溶解后，加入60ml甲醇，水浴加热回流4小时，回收甲醇至干，精密置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，充分摇匀，用微孔滤膜滤过(0.2μm)，取滤液，即得。b取本品10片，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置脂肪提取器中，加入60ml甲醇，充分溶解后，水浴加热回流4小时，回收甲醇至干，精密置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，充分摇匀，用微孔滤膜滤过(0.2μm)，取滤液，即得。表10c取本品10片，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入甲醇，充分溶解后，再精密加入甲醇至刻度，超声提取处理如下时间后，置冷藏室放置5分钟后，取出至常温放置10分钟，加甲醇至刻度，充分摇匀，用微孔滤膜滤过(0.2μm)，取滤液，即得。表11从上述的提取方法研究，样品先用少量水溶解，有利于提取，超声提取优于回流提取，超声提取时间在15分钟，样品中的成份趋于稳定。结论取本品10片，精密称定，研细，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入水1ml，充分溶解后，再精密加入甲醇9ml至刻度，超声提取处理15分钟后，置冷藏室放置5分钟后，取出至常温放置10分钟，加甲醇至刻度，充分摇匀，用微孔滤膜滤过(0.2μm)，取滤液，即得。2.1不同干扰试验(甲醇溶剂、乙腈溶剂和阴性样品试验)空白品溶液的制备取珍菊降压片野菊花和芦丁空白样品精密称定，研细，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入水1ml，充分溶解后，再精密密加入甲醇9ml至刻度，超声提取处理15分钟后，置冷藏室放置5分钟，取出至常温放置10分钟，加甲醇至刻度，充分摇匀，用微孔滤膜滤过(0.2μm)，取滤液，即得。结论供试品色谱在与对照品色谱保留时间相同的位置上有芦丁峰和槲皮素出现(图2)，保留时间一致，供试品色谱中芦丁、槲皮素前后的峰与芦丁、槲皮素的分离度均超过1.5，达到基线分离的要求。空白品色谱在相应保留时间范围内没有峰出现，且基线平稳。甲醇溶剂和乙腈溶剂在相应保留时间范围内没有峰出现和积分值。2.2珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定的线性范围标准溶液配制精密称取槲皮素对照品9.96mg用甲醇适量溶解于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5ml置10ml量瓶中，再精密称取芦丁对照品39.0mg，用甲醇精密加入至10ml量瓶中定容至刻度，摇匀，使成浓度为0.0498mg/ml和3.9mg/ml。2.2.1槲皮素线性范围在上述的色谱条件下，分别精密量取上述溶液2、4、6、8、10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，数据见表12。表12珍菊降压片中槲皮素的线性范围以含量为横坐标，槲皮素峰面积为纵坐标，作线性回归，得线性方程A＝149.17X-15.41r＝0.9999。结论槲皮素含量在0.1μg～0.5μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.2.2芦丁线性范围在已定的色谱条件下，分别精密量取上述溶液1、2、3、4、6μl注入液相色谱仪，记录色谱图，数据见表13。表13珍菊降压片中芦丁的线性范围以含量为横坐标，芦丁峰面积为纵坐标，作线性回归，得线性方程(见图3)A＝695.42X+298.39r＝0.9994。结论芦丁含量在3.9μg～23.4μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。3、珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定方法的精密度试验取芦丁浓度为1.0mg/1ml对照品溶液5.0ml，槲皮素浓度为0.996mg/1ml对照品溶液0.5ml，移入10ml量瓶中，用甲醇精密定容至刻度，摇匀，备用。在已定的色谱条件下，分别精密量取上述溶液10μl，连续注入5次液相色谱仪，测定其相对峰面积，进行计算，结果见表14。表14珍菊降压片含量测定方法的精密度试验结论珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定方法精密度试验结果的RSD％＜2％，证明其方法精密度良好。4、珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定方法的重现性试验供试品021001溶液的制备取重量差异项下的本品，除去薄膜衣，研细，精密称取约0.2g，平行五份，分别按样品的处理方法制备。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，在已定的色谱条件下，测定，即得。结果见下表15、16。表15珍菊降压片芦丁含量测定方法的重现性试验表16珍菊降压片槲皮素含量测定方法的重现性试验结论珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定方法重现性试验结果的RSD％＜2％，证明其方法重现性良好。5、珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定方法的稳定性试验取本品批号为021001重视性试验项下溶液分别于0、2、4、8、12小时测定计算含量平均值及RSD％，结果见表17、18。表17珍菊降压片槲皮素含量测定方法的稳定性试验表18珍菊降压片芦丁含量测定方法的稳定性试验结论珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定溶液放置2、4、8、12、24小时的含量测定结果的RSD％＜2％，证明其测定溶液稳定，可用于芦丁、槲皮素含量测定。6、珍菊降压片芦丁、槲皮素含量测定的加样回收率分别称取已测含量的供试品(批号021002)5份适量，精密称定，精密加入适量的对照品溶液，再按供试品溶液的制备方法处理，测定其相对峰面积，进行计算。加样标准品浓度，槲皮素0.986mg/ml溶液3ml，置10ml量瓶中，再加入精密称定的芦丁标准品10.42mg，加甲醇至10ml刻度，使成浓度芦丁1mg/ml、槲皮素0.2958mg/ml的加样标准液。精密加入上述加样标准液1ml在样品中，按照样品制备方法制备，进样10μl，具体结果见下表。表19珍菊降压片槲皮素含量测定的加样回收率<tablesid="table19"num="019"><tablewidth="794">试验号12345供试品量(g)0.100150.100160.100220.100150.10017供试品槲皮素含量(mg)0.089970.089970.089970.089970.08997槲皮素对照品加入量(mg)0.29580.29580.29580.29580.2958测得峰面积611.8241611.921610.316610.447603.624测得槲皮素量(mg)0.37530.37540.37440.37440.3703槲皮素回收率(％)96.596.596.196.294.8槲皮素平均回收率(％)96.0RSD(％)0.19</table></tables>表20珍菊降压片芦丁含量测定的加样回收率<tablesid="table20"num="020"><tablewidth="742">试验号12345供试品量(g)0.100150.100160.100220.100150.10017供试品含量(mg)8.3978.3978.3978.3978.397芦丁对照品加入量(mg)1.0421.0421.0421.0421.042测得芦丁量(mg)9.4909.4869.4939.4909.437芦丁回收率(％)104.5105.1105.2104.999.85芦丁平均回收率(％)103.9RSD(％)2.2</table></tables>结论槲皮素的平均回收率为96.0％，RSD＝0.19％，芦丁的平均回收率为104.0％，RSD＝2.2％。样品含量测定分别取六个批号的本品适量，按供试品制备方法制备，测定，结果见表。表21样品中槲皮素、芦丁含量测定结果根据上述实验结果，以样品含量的80％为标准，暂定为本品含芦丁、槲皮素不得少于6％和0.07％。实施例4、盐酸可乐定含量测定盐酸可乐定方法学研究1.仪器与试剂Agilent1100系列四元泵，全自动进样器，柱温箱，紫外检测器(VWD)，色谱柱ODS(5um，250*4.6mm)，Agilent1100化学工作站。甲醇为高效液相色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。2.对照品和样品盐酸可乐定由中国药品生物制品检定所提供，批号10071-9905样品为本单位实验室制备，批号040101、040102、021104、021105、0211063.色谱条件盐酸可乐定的检测波长为210nm。流动相为甲醇—磷酸盐缓冲液(25∶75)，柱温为室温，流速为1.0ml/min。磷酸盐缓冲液在1000ml水中加入1g磷酸二氢铵，加磷酸调节pH至3.0，即得。4.样品溶液的制备对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸可乐定6mg，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含盐酸可乐定60μg)。供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，研极细，取1g，精密称定，加入1％盐酸50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，加1ml氨水，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。5.试验项目5.1检测波长选择根据盐酸可乐定原料在流动相中的紫外吸收图谱，其最大吸收在210-230nm附近，故本实验选择在210nm作为盐酸可乐定的检测波长。5.2提取方法的研究5.2.1取本品20片，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入流动相50ml，超声处理20分钟，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液为样品溶液。经该法提取所得样品液液相色谱图中，存在很多其他吸收峰，盐酸可乐定的主峰被其他杂峰掩盖，经过流动相的调整，还是无法达到理想的分离效果，故根据盐酸可乐定的物理化学性质，采用酸提取法和碱提取法，具体如下5.2.2酸提取法取本品20片，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入1％盐酸50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，加1ml氨水，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，为样品溶液。5.2.3碱提取法取本品20片，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入氨水(1→10)50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用水20ml溶解，1％盐酸调节PH至4.0，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，为样品溶液。综合比较酸提取法及碱提取法处理的样品溶液，酸提取法处理的样品盐酸可乐定提取得率较碱提取法都较高，但是酸提取的色谱峰中其他干扰峰较少，故优选酸提取法为盐酸可乐定含量测定的提取方法。5.2.4超声处理时间和氯仿萃取次数的研究①超声处理时间的研究本实验采用超声10分钟、20分钟和30分钟进行实验，结果如下表22由结果可知，本实验采用超声20分钟较为合理。②氯仿萃取次数的研究本实验采用萃取3次、并将萃取3次后残渣再萃取2次进行实验比较，结果显示3次萃取后的残渣再萃取2次所得的结果占重量的10％左右，故本实验采用萃取为5次，从加样回收率的数据(平均值为96.9％)也证明萃取5次较为合理。5.3方法的专一性供试品色谱在与对照品色谱保留时间相同的位置上有盐酸可乐定峰出现。见图3。取盐酸可乐定空白样品，按供试品溶液的制备方法处理，按上述色谱条件分别进样10μl，在盐酸可乐定对照品出峰处没有吸收峰。5.4线性关系按对照品溶液的制备方法分别配置3.0μg/ml、4.5μg/ml、6.0μg/ml、7.5μg/ml、9.0μg/ml的对照品溶液。按上述色谱条件分别进样20μl，测定峰面积，以峰面积值为横坐标(X)，进样浓度为纵坐标(Y)。以最小二乘法计算回归方程。得回归方程Y＝0.0078X+0.3243，相关系数r＝0.99999，结果表明在3.0～9.0μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。5.5稳定性试验取同一批号040101的样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24小时进样，检测，其盐酸可乐定峰面积见表23。表23批号040101的样品溶液的稳定性试验结果平均峰面积为624.7，RSD＝0.2％，故供试样品溶液在48小时内稳定性较好。5.6精密度试验盐酸可乐定标准品溶液，连续进样5次，盐酸可乐定峰面积见下表。表24盐酸可乐定标准品溶液的精密度试验结果盐酸可乐定相对峰面积RSD为0.3％，符合规定。5.7重复性试验取同一批号040101的样品5份，分别按样品制备方法处理，其每片盐酸可乐定含量见下表。表25批号040101的样品溶液的重复性试验结果盐酸可乐定含量的RSD为2.9％，符合规定。5.8加样回收试验分别称取批号040101的样品9份，每份适量，精密称定，加入一定体积的对照品溶液，再按样品溶液的制备方法处理，测定其相对峰面积，进行计算，结果回收率分别为96.2％、95.4％、99.6％、96.3％、95.5％、97.6％、96.0％、98.4％、97.5％，平均回收率为96.9％，RSD＝1.5％，具体结果见表26。表26加样回收试验结果三批中试生产样品，照珍菊降压片盐酸可乐定含量测定方法测定，结果见表27。表27珍菊降压片中试盐酸可乐定含量测定结果结论依据以上含量测定数据可以认为按本工艺试制的珍菊降压片，含量稳定，重复性好，故拟定珍菊降压片中盐酸可乐定含量标准为每片标示量的80.0～120.0％。实施例5、氢氯噻嗪方法学研究1.仪器与试剂Agilent1100系列四元泵，全自动进样器，柱温箱，紫外检测器(VWD)色谱柱ODS(5um，250*4.6mm)，Agilent1100化学工作站。甲醇为高效液相色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。2.对照品和样品氢氯噻嗪由中国药品生物制品检定所提供，批号10309-0001样品为本单位制备，批号040101、040102、021104、021105、0211063.色谱条件氢氯噻嗪的检测波长为254nm。流动相为甲醇—磷酸盐缓冲液(20∶80)，柱温为室温，流速为1.0ml/min。磷酸盐缓冲液在0.1M的磷酸二氢钠1000ml水中加入磷酸调节pH至3.0，即得。4.样品溶液的制备对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的氢氯噻嗪5mg，置50ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，摇匀，即得(每1ml中含氢氯噻嗪0.1mg)。供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，研极细，取0.25g，精密称定，加丙酮50ml，冷浸过夜，振摇提取30分钟，过滤，再用丙酮10ml洗涤残渣，合并滤液，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至50ml，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。5.试验项目5.1检测波长选择根据氢氯噻嗪原料在流动相中的紫外吸收图谱，本实验选择在254nm作为氢氯噻嗪的检测波长。5.2提取方法的研究5.2.1取本品20片，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，加入流动相50ml，超声处理20分钟，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液为样品溶液。经该法提取所得样品液液相色谱图中，存在很多其他吸收峰，氢氯噻嗪的主峰被其他吸收峰掩盖，经过流动相的调整，还是无法达到理想的分离效果，故根据氢氯噻嗪的物理化学性质(在丙酮中溶解，在乙醇中微溶)，采用丙酮提取法和乙醇提取法，具体如下5.2.2丙酮提取法取本品20片，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，加入丙酮50ml，冷浸过夜，振摇提取30分钟，过滤，再用丙酮10ml洗涤残渣，合并滤液，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至50ml，滤过，取续滤液，即得。5.2.3乙醇提取法取本品20片，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，加入95％乙醇50ml，超声处理20分钟，过滤，滤液水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至50ml，滤过，取续滤液，即得。综合比较丙酮提取法及乙醇提取法处理的样品溶液的色谱图可知，丙酮提取法处理的样品提取比较完全，无杂质干扰，乙醇提取法处理的样品中有较多杂质峰干扰且不易达到理想分离，故优选丙酮提取法为氢氯噻嗪含量测定的提取方法。5.2.4丙酮冷浸时间及提取次数的研究①冷浸时间的研究本实验采用冷浸30分钟、60分钟和120分钟及冷浸过夜几种条件进行实验，结果如下表28由结果可知，冷浸过夜提取较为完全。②提取次数的研究本实验采用提取3次、分别测试每次提取得率进行实验比较，结果显示1次提取后的残渣再提取2次，所得提取物中几乎不含氢氯噻嗪，证明丙酮冷浸过夜振摇提取30分钟这种方法的提取效果较好，提取较为完全，故采用该方法作为氢氯噻嗪含量测定的提取方法是比较合理的。5.3方法的专一性(阴性)供试品色谱在与对照品色谱保留时间相同的位置上有氢氯噻嗪峰出现，见图4。取氢氯噻嗪空白样品，按供试品溶液的制备方法处理，按上述色谱条件分别进样10μl，在氢氯噻嗪对照品出峰处没有吸收峰。5.4线性关系按对照品溶液的制备方法分别配置0.048mg/ml、0.072mg/ml、0.096mg/ml、0.12mg/ml、0.144mg/ml的对照品溶液。按上述色谱条件分别进样10μl，测定峰面积。表29以进样浓度为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)。以最小二乘法计算回归方程。得回归方程Y＝19265X+9.5933，相关系数r＝0.9999，结果表明在48～144μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。5.5稳定性试验取同一批号040101的样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24小时进样，检测，其氢氯噻嗪峰面积见表30。表30批号040101的样品溶液的稳定性试验结果平均峰面积为844.0，RSD＝0.1％，故供试样品溶液在48小时内稳定性较好。5.6精密度试验氢氯噻嗪标准品溶液，连续进样5次，氢氯噻嗪峰面积见下表。表31氢氯噻嗪标准品溶液的精密度试验结果氢氯噻嗪相对峰面积RSD为0.35％，符合规定。5.7重复性试验取同一批号040101的样品5份，分别按样品制备方法处理，其每片氢氯噻嗪含量见下表。表32批号040101的样品溶液的重复性试验结果氢氯噻嗪平均含量为4.34mg/片(86.8％)，其RSD为0.9％，符合规定。5.8加样回收试验分别称取批号040101的样品6份，每份适量，精密称定，加入一定体积的对照品溶液，再按样品溶液的制备方法处理，测定其相对峰面积，进行计算，结果回收率分别为96.7％、97.1％、102.4％、98.3％、100.3％、99.8％，平均回收率为99.1％，RSD＝2.15％，具体结果见表33。表33加样回收试验结果5.9.样品的含量用五批样品，照珍菊降压片氢氯噻嗪含量测定方法测定，结果见表34。表34珍菊降压片中试氢氯噻嗪含量测定结果结论依据以上含量测定数据可以认为按本工艺试制的珍菊降压片，含量稳定，重复性好，故拟定珍菊降压片中氢氯噻嗪含量标准为每片标示量的80.0～120.0％。权利要求1.珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于该方法包括1)采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，扫描波长为300-600nm的吸收值，计算制剂中总黄酮的含量；2)采用高效液相法，以芦丁和槲皮素为对照品，以乙腈-0.1-0.4％磷酸水为流动相，检测波长为360-375nm，测定制剂中芦丁和槲皮素含量；3)采用高效液相法，以甲醇-磷酸盐缓冲液或乙腈-0.5％的醋酸水溶液为流动相，检测波长为210-230nm，测定制剂中盐酸可乐定含量；4)采用高效液相法，以甲醇一磷酸盐缓冲液或乙腈-pH3-4的酸水溶液为流动相，检测波长为254nm，测定制剂中氢氯噻嗪的含量。2.根据权利要求1所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用紫外分光光度法测定总黄酮含量方法为取珍菊降压制剂适量，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入水1ml，充分溶解后，再精密加入甲醇9ml至刻度，超声提取处理15分钟后，放冷，加甲醇至刻度，充分摇匀，取上清液用微孔滤膜滤过，为供试品溶液，芦丁的甲醇液为对照品，络合试剂是硝酸铝溶液，扫描波长为300-600nm。3.根据权利要求1所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用高效液相法测定芦丁、槲皮素含量方法为取珍菊降压制剂适量，精密称定，研细，取约0.2g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入水1ml，充分溶解后，再精密加入甲醇9ml至刻度，超声提取处理15分钟后，放冷，加甲醇至刻度，充分摇匀，取上清液用微孔滤膜滤过，为供试品溶液，芦丁和槲皮素的甲醇液为对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-0.1％磷酸水0-9分钟(19∶81)，10-17分钟(33∶67)，18-20分钟(40∶60)，21-22分钟(19∶81)，检测波长360-375nm。4.根据权利要求1所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用高效液相法测定盐酸可乐定含量的方法为1)酸提取法取珍菊降压制剂适量，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入1％盐酸50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，加1ml氨水，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，为样品溶液；或碱提取法取本品适量，精密称定，研细，取1g，精密称定，加入氨水(1→10)50ml，超声处理20分钟，离心，精密吸取25ml上清液，用氯仿萃取5次，每次30ml，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用水20ml溶解，1％盐酸调节PH至4.0，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至10ml，滤过，取续滤液，为样品溶液；2)以盐酸可乐定的甲醇液为对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液(15～30∶85～70)或乙睛-0.5％的醋酸水溶液(10～30∶90～70)；检测波长为210-230nm。5.根据权利要求1所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用高效液相法测定氢氯噻嗪含量方法为取珍菊降压制剂适量，精密称定，研极细，取0.25g，精密称定，加丙酮50ml，冷浸过夜，振摇提取30分钟，过滤，再用丙酮10ml洗涤残渣，合并滤液，水浴挥干，残渣用流动相溶解，定容至50ml，滤过，取续滤液，为供试品溶液。氢氯噻嗪用流动相溶解后作为对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液(15～30∶85～70)，或乙睛-pH3～4的酸水溶液(10～20∶90～80)；检测波长254nm。6.根据权利要求4或5所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的磷酸盐缓冲液是在0.1M的磷酸二氢钠1000ml水中加入磷酸调节pH至3.0后获得。7.根据权利要求1或2所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用紫外分光光度法测定总黄酮含量，扫描波长为510nm。8.根据权利要求1或3所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用高效液相法测定芦丁、槲皮素含量，检测波长为365nm。9.根据权利要求1或4所述的珍菊降压制剂质量控制方法，其特征在于其中所述的采用高效液相法测定盐酸可乐定含量，检测波长为210-214nm。全文摘要本发明涉及珍菊降压制剂质量控制方法。该方法采用紫外分光光度法测定制剂中总黄酮的含量，采用高效液相法测定制剂中芦丁和槲皮素含量、盐酸可乐定含量和氢氯噻嗪的含量。本发明根据珍菊降压制剂各组分的特性，制定了快速、准确、全面，适应于工业化生产的质量控制方法。该方法保证了制剂中各有效成分的含量的可控性，使制剂各组份达到有效剂量范围，从而保证疗效。文档编号G01N35/00GK1707269SQ200410025109公开日2005年12月14日申请日期2004年6月11日优先权日2004年6月11日发明者杨继斌,杨莉娅,汤晓枢申请人:上海实业联合集团药业有限公司,上海实业联合集团药物研究有限公司