专利名称：雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测雌激素类兽药的器具，特别是涉及一种雌二醇、雌三醇和己 烯雌酚三联检测卡及其检测样品的处理方法，属于雌激素类兽药残留检测技术领域。
背景技术：
人类对动物内分泌干扰物所造成的环境污染和危害的普遍认知和系统研究还不 到十年的历史，但越来越多的研究表明，具有内分泌干扰性的污染物不断富集所造成的污 染正通过各种途径给人类和野生动物带来危害，且其已在世界范围内的自然水体，城市污 水处理系统及供水系统中被广泛检出。其中尤以雌性激素污染更为严重，目前应用最广的主要有天然激素中的雌二醇、 雌三醇及人工合成的己烯雌酚。雌二醇是天然雌激素的主要成分，因其可以促进动物生长和提高畜禽瘦肉比，而 在畜牧业中有应用。它可在动物体内残留，通过食物链危害人体健康，使女性儿童提前发 育，男性儿童乳腺组织发育女性化，男性生殖系统异常化，引起病变，并导致女性乳腺癌和 子宫内膜异位症发生率上升，且存在明显致癌性，欧美等发达国家相继禁止使用雌二醇作 为饲料添加剂。雌三醇是广泛存在于人和动物体内的一种类固醇激素，在检测食品特别是动物食 品中这种激素的含量，保障食品卫生与人类健康方面有重要的意义和作用。己烯雌酚是第一个口服有活性的人工合成雌激素。但由于其具有促进动物生长， 增加蛋白质沉积和提高饲料转化率的作用，也被作为促生长剂，广泛应用于畜牧养殖业。己 烯雌酚残留会使正常人的生理功能发生紊乱，更严重的是影响儿童正常的生长发育。近期 研究发现，己烯雌酚能引发动物和人的癌症和致畸毒性，且妊娠期间使用还会引起后代生 殖系统疾病。因此，世界许多国家禁止在饲料中使用己烯雌酚来促进动物生长。这三类激素大都可以促进少女早熟，因此，对食品中尤其是对畜禽产品进行这几 类雌激素检测是很有必要的。目前，现有技术对于这三类雌激素类饲料添加剂的检测主要依赖化学仪器分析、 放射免疫检测试剂盒及酶免疫检测试剂盒，这些方法操作过程繁琐、时间长，操作人员须具 有一定的专业技术知识才能操作，因此应用范围受限。也有单独检测雌二醇、雌三醇及己烯 雌酚的检测试纸条，但到目前为止，没有同时检测这三种物质的检测器具。
发明内容本实用新型的目的在于提供一种操作简便快捷、成本低、携带方便、非专业人员也 能操作及可进行现场检测的胶体金试纸，且能同时检测三类雌性激素，克服现有技术操作 繁琐、专业要求高及只能逐一单项检测的缺陷。本实用新型的技术方案一种雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡它在长条 扁平薄壳状的检测卡外壳1中设置测试条2，检测卡外壳表面有检测窗孔3和加样孔4，测试条2是由支承背板5上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫8、含抗雌二醇抗体胶体金标记 物的玻璃纤维膜11、含抗雌三醇抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜10、含抗己烯雌酚抗体胶 体金标记物的玻璃纤维膜7、硝酸纤维素膜6和吸水膜9所组成；支承背板中部叠置粘贴硝 酸纤维素膜6，支承背板一端叠置粘贴吸水膜9，另一端叠置粘贴样品垫8，吸水膜内端与样 品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部，两者之间夹 置粘贴粘贴三段胶体金膜11、10、7 ；胶体金膜11、10、7依次是含抗雌二醇抗体胶体金标记 物的玻璃纤维膜、抗雌三醇抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜、及抗己烯雌酚抗体胶体金标 记物的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有三条检测带和一条质控带，依次是含雌二醇蛋白质 偶联物检测带12，含雌三醇蛋白质偶联物检测带13，含己烯雌酚蛋白质偶联物检测带14， 质控带15，质控带为抗兔抗体或抗鼠抗体，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔， 硝酸纤维素膜正对检测窗孔。所述的雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡检测样品的处理方法，检测样品为 尿液样品、饲料样品或动物组织、肉、肝脏样品，对于各种不同的检测样品有不同的处理方 法；尿液样品的处理方法尿液直接用作检测样品，浑浊状态的尿液用滤纸过滤，取清 亮上清液作测试样品样品，澄清的尿液直接作测试样品；测试样品滴入加样孔后用于检测。饲料样品的处理方法称取0. 5克饲料样品，加入ImL样品抽提液，在试管中搅拌 1分钟，静置10分钟后，取清亮上清液作测试样品滴入加样孔后用于检测。动物组织、肉、肝脏样品的处理方法取Ig剪碎或勻浆过的动物组织、肉、肝脏样 品，加入含ImL样品抽提液的试管中，扭紧管盖，振摇样品1分钟后，经100°C水浴加热5分 钟，冷却至室温，取清亮的中间部分作测试样品滴入加样孔后用于检测。所述样品抽提液为pH 7. 0、浓度50mmol/L Tris-HCL缓冲液。本实用新型的有益效果本发明的三联检测卡能同时检测出尿液或饲料、动物组 织、肉、肝脏中含有的雌二醇、雌三醇及己烯雌酚，本三联检测卡易于制备且节省检测费用， 使用方便快速，结果准确。

图1雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡的外壳及测试条在外壳内的安置图。 1、检测卡外壳，2、测试条，3、检测窗孔，4、加样孔。图2雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡的测试条结构示意图。5、支承背板，6、 硝酸纤维素膜，7、含抗己烯雌酚抗体胶体金标记物的胶体金膜，8、样品垫，9、吸水膜，10、含 抗雌三醇抗体胶体金标记物的胶体金膜，11、含抗雌二醇抗体胶体金标记物的胶体金膜。图3雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡的硝酸纤维素膜上显示印迹示意图。 6、硝酸纤维素膜，12、含雌二醇蛋白质偶联物检测带，13、含雌三醇蛋白质偶联物检测带， 14、含己烯雌酚蛋白质偶联物检测带，15、质控带。
具体实施方式
本实用新型结合具体实施例参见附图进一步说明如下。实施例1[0022]一种雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡，它是在检测卡外壳1中设置测试条 2，检测卡外壳1的结构及测试条2的设置参见附图1、图2。检测卡外壳1为长条扁平薄壳 状外壳，长7cm，宽2cm，厚0. 5cm,薄壳壁厚0. Icm,由工程塑料制成。检测卡外壳1由壳盖 与壳座两半联接构成，在检测卡外壳1壳盖上有检测窗孔3和加样孔4。测试条2放置在检 测卡外壳1的壳座内。测试条2是多层结构的窄条薄片，片长约6. 0cm，片宽约0. km，厚度小于2. 5mm。 测试条2是多层结构底层是支承背板5，为聚氯乙烯塑料薄片，厚约0. 5mm,长6. Ocm,宽 0. 4cm ；支承背板5中部叠置粘贴硝酸纤维素膜6，硝酸纤维素膜厚0. 5mm，长2_2. 5cm,宽 0. 4cm0硝酸纤维素膜6上有四条间隔开的横向显示印迹带，参见附图3，四条显示印迹中， 第一条是检测带12，含雌二醇蛋白质偶联物，第二条检测带13，含雌三醇蛋白质偶联物，第 三条是检测带14，含己烯雌酚蛋白质偶联物，第四条是质控带15，含抗兔抗体或抗鼠抗体。 调节蛋白质偶联物浓度大约为lmg/ml，抗兔抗体或抗鼠抗体浓度大约为0. lmg/ml时喷膜。 支承背板5 —端上叠置粘贴吸水膜9，支承背板5另一端上叠置粘贴样品垫8，吸水膜9内 端与样品垫8内端各自分别与硝酸纤维素膜6 —端搭接，在样品垫8与硝酸纤维素膜6的 搭接部，两者之间夹置粘贴三段胶体金膜11、10、7，胶体金膜11、10、7依次是含抗雌二醇抗 体胶体金标记物的玻璃纤维膜、抗雌三醇抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜、及抗己烯雌酚 抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜。胶体金膜厚0. 5-0. 8mm,长0. 5-0. 6cm,宽0. 4cm0样品垫 8 厚 0. 5-0. 8mm,长 2cm，宽 0. 4cm。吸水膜 9 厚 0. 5-0. 8mm,长 1. 6_2cm，宽 0. 4cm。胶体金膜 是将抗体与胶体金颗粒标记后，调节浓度大约为ID涂布胶体玻璃纤维膜，烘干后备用。胶 体金膜11、107、样品垫8及吸水膜9与硝酸纤维素膜6搭接长度为0. 1-0. 2cm。吸水膜9 材料是吸水纸，样品垫8材料是吸水玻璃纤维膜。本实用新型雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡用于检测畜牧饲料或动物尿样 或动物组织、肉、肝脏中是否含有雌二醇、雌三醇及己烯雌酚，据此鉴别畜牧食品的安全性。实施例2检测样品的处理方法针对尿液样品的处理方法是尿液直接用作检测样品，若尿样呈浑浊状，需先经滤 纸滤过，取上清液作测试样品；若尿液澄清，则直接作测试样品。针对饲料样品的处理方法是称取0. 5克饲料样品，加入ImL样品抽提液(pH 7. 0、50mmol/L的Tris-HCL)，在试管中搅拌1分钟，静置10分钟后，取清亮上清液作测试样品。针对动物组织、肉、肝脏样品的处理方法是取1克剪碎或勻浆过的动物组织、肉、 肝脏样品，置于含ImL样品抽提液(pH 7. 0、50mmol/L的Tris-HCL)的试管中，扭紧管盖，振 摇样品一分钟后，经100°C水浴5分钟，冷却至室温，取清亮的中间清液作测试样品。使用雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡进行检测时，先将待检测的样品液从 加样孔4中滴注入雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡的样品垫8，由于虹吸作用原理， 带动待检测的样品液及胶体金膜所含的抗雌二醇、抗雌三醇和抗己烯雌酚单克隆抗体或多 克隆抗体胶体金标记物一起向硝酸纤维素膜6扩散，5-10分钟内观察结果。检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应，在硝酸纤维素膜上迁移的胶体金 标记的抗体，在测试带上分别与含雌二醇蛋白质偶联物、含雌三醇蛋白质偶联物、含己烯雌酚蛋白质偶联物，以及质控带抗兔抗体或抗鼠抗体反应，形成棕红色条带。当样品中有相应 的待检雌二醇、雌三醇及己烯雌酚存在，则样品加入后即与相应的抗体发生反应，而不会与 相应的检测带所含的雌二醇蛋白质偶联物、含雌三醇蛋白质偶联物、含己烯雌酚蛋白质偶 联物反应，从而不显色。主要反应的结果有以下9种情况1、所述检测带12、13、14和质控带15同时显现棕红色印迹带，表示检测结果为阴 性，说明被检测样品中雌二醇、雌三醇和己烯雌酚含量均没有超过允许值。2、所述检测带12、13、14不显示颜色，只有质控带15显现棕红色印迹，检测结果为 阳性，表明被检测样品中雌二醇、雌三醇和己烯雌酚含量均超过允许值。3、所述检测带12、13不显示颜色，检测带14和质控带15同时显现棕红色印迹，检 测结果为阳性，表明被检测样品中雌二醇和雌三醇含量均超过允许值，而己烯雌酚含量没 有超过允许值。4、所述检测带12、14不显示颜色，检测带13和质控带15同时显现棕红色印迹，检 测结果为阳性，表明被检测样品中雌二醇和己烯雌酚含量均超过允许值，而雌三醇含量没 有超过允许值。5、所述检测带13、14不显示颜色，检测带12和质控带15同时显现棕红色印迹，检 测结果为阳性，表明被检测样品中雌三醇和己烯雌酚含量均超过允许值，而雌二醇含量没 有超过允许值。6、所述检测带12不显示颜色，检测带13、14和质控带15同时显现棕红色印迹，检 测结果为阳性，表明被检测样品中雌二醇含量超过允许值，而雌三醇、己烯雌酚含量均没有 超过允许值。7、所述检测带13不显示颜色，检测带12、14和质控带15同时显现棕红色印迹，检 测结果为阳性，表明被检测样品中雌三醇含量超过允许值，而雌二醇、己烯雌酚含量均没有 超过允许值。8、所述检测带14不显示颜色，检测带12、13和质控带15同时显现棕红色印迹，检 测结果为阳性，表明被检测样品中己烯雌酚含量超过允许值，而雌二醇、雌三醇含量均没有 超过允许值。9、所述检测带12、13、14和质控带15均不显色，则表明测试条失效。
权利要求1. 一种雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡，其特征在于它在长条扁平薄壳状的 检测卡外壳(1)中设置测试条(2)，检测卡外壳表面有检测窗孔(3)和加样孔(4)，测试条 (2)是由支承背板(5)上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫(8)、含抗雌二醇抗体胶体金标 记物的玻璃纤维膜(11)、含抗雌三醇抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜(10)、含抗己烯雌酚 抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜(7)、硝酸纤维素膜(6)、和吸水膜(9)所组成；支承背板中 部叠置粘贴硝酸纤维素膜(6)，支承背板一端叠置粘贴吸水膜(9)，另一端叠置粘贴样品垫 (8)，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜的 搭接部，两者之间夹置粘贴抗雌二醇抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜(11)、抗雌三醇抗体 胶体金标记物的玻璃纤维膜(10)、及抗己烯雌酚抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜(7)，硝 酸纤维素膜上有三条检测带和一条质控带，依次是含雌二醇蛋白质偶联物检测带(12)， 含雌三醇蛋白质偶联物检测带(13)，含己烯雌酚蛋白质偶联物检测带(14)，质控带(15)， 质控带为抗兔抗体或抗鼠抗体，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔，硝酸纤维素 膜正对检测窗孔。
专利摘要一种雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三联检测卡，属于雌激素类兽药残留检测技术领域。本实用新型三联检测卡外壳内有测试条，由支承背板上依次粘贴样品垫、胶体金膜、硝酸纤维素膜和吸水膜所组成；胶体金膜为含抗雌二醇抗体、抗雌三醇抗体、及抗己烯雌酚抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有3条检测带，分别含雌二醇蛋白质偶联物、雌三醇蛋白质偶联物、己烯雌酚蛋白质偶联物，另有1条含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带。本实用新型优点是能同时检测出尿液或饲料、动物组织、肉、肝脏中含有的雌二醇、雌三醇及己烯雌酚。检测卡易于制备且节省检测费用，使用方便快速，结果准确。
文档编号G01N33/558GK201876459SQ20102061294
公开日2011年6月22日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者吴文晔, 周坚, 熊晓芳 申请人:无锡安迪生物工程有限公司