检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，包被酶标板以重组蛋白Nh作为包被抗原。研究及实践证明，本发明具有特异性强、敏感度高、操作简单等特点，易于大范围推广使用，具有广阔的市场前景，可用于流行性腹泻感染情况的血清学调查、抗体监测及疫苗免疫效果的评估等方面。
【专利说明】检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于ELISA试剂盒【技术领域】，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹湾(porcine epidemic diarrhea, PED)由冠状病毒科的猪流行性腹湾病毒(porcine epidemic diarrhoea virus, PEDV)引起，以发病猪腹湾、呕吐、脱水以及哺乳仔猪高致死率为主要特征。该病主要危害哺乳仔猪，2-7日龄仔猪感染率高，主要表现为腹泻、脱水、呕吐、精神沉郁。10日龄以内仔猪感染出现腹泻2?4天后，大量死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。在上世纪八、九十年代，欧洲的许多国家，包括英国、荷兰、法国、t匕利时、德国和瑞士都有PED的流行。近年来，PEDV在欧洲的流行越来越少；与之相反，在亚洲的许多国家，包括中国、韩国、日本、菲律宾和泰国，PEDV的流行及严重程度远大于欧洲。目前，PED已成为我国养猪业重要的腹泻病之一。鉴于该病主要危害仔猪，发病仔猪迅速大量脱水衰竭而死，目前紧急的药物治疗只能减轻或减缓腹泻症状，给仔猪免疫也由于抗体产生时间较慢达不到免疫保护效果，唯有足够高的母源抗体仔猪提供免疫保护力，可大大降低仔猪发病死亡的风险，因此，对母猪进行猪流行性腹泻病毒的抗体水平检测具有十分重要的意义。
[0003]由于PEDV适应细胞培养在较长一段时间内未获成功，应用于PED及其抗体检测的诊断试剂制备受到了一定的制约。目前，国内虽有部分厂家生产了商品化的流行性腹泻病毒试剂盒，但是大多数主要以全病毒制备的抗原或抗体为主。制备全病毒抗原存在潜在排散危险，且全病毒大多是以CV777株弱毒株制备，大部分研究表明我国当前流行毒株基因序列与CV777株差异较大，其检测效果有待进一步分析评估。因而，急需一种针对流行毒株的更加安全且易于制备的新型诊断试剂的研制。

【发明内容】

[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、稳定性好的检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，用于猪群猪流行性腹泻病毒抗体水平的检测，以判断猪群猪流行性腹泻病毒的感染情况和监测免疫效果等。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，包被酶标板以重组蛋白Nh作为包被抗原。
[0006]重组蛋白Nh具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的喊基序列的基因编码。
[0007]包被酶标板每孔包被重组蛋白Nhl μ g，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5%的脱脂奶粉作为封闭液进行封闭。
[0008]阴性对照血清和阳性对照血清各2mL ;酶标二抗为60mL,由美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得；浓缩洗涤液为IOX洗涤液，为含0.5%吐温-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL ;样品稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和
0.01%叠氮钠pH7.2-7.4的0.0lM的PBS溶液，共IOOmL,以稀释被检血清和酶标二抗；显色液包括显色液A和显色液B，显色液A:称取200mg四甲基联苯胺，溶于IOOmL的无水乙醇中，双蒸水定容至IOOOmL ;显色液B:称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL,双蒸水定容至IOOOmL,调节PH值为4.5-5.0。显色液A和显色液B均为60mL ；终止液为2M的H2SO4溶液，共30mL。
[0009]重组蛋白Nh按以下操作制备:以猪流行性腹泻病毒流行毒株为材料，通过RT-PCR扩增N基因内部主要亲水区序列135-319位氨基酸，并获得重组质粒pMD-Nh ;再将Nh片段亚克隆到表达载体pET-32a(+)中获得原核表达质粒pET32a-Nh ;将原核表达质粒pET32a-Nh转化进宿主表达菌BL-21 (DE3)中，经IPTG诱导表达获得重组蛋白Nh ;利用Ni2+亲和层析法纯化获到具有生物学活性的重组蛋白Nh。
[0010]间接ELISA具有操作简单、特异性及稳定性好等诸多优点，目前在临床上广泛应用于各种细菌、病毒及寄生虫等病原抗体水平的检测。发明人依据间接ELISA的原理，建立了预包被有重组蛋白Nh的酶标板的检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒:首先，通过筛选抗原性强且保守的猪流行性腹泻核衣壳蛋白，扩增和克隆基因；然后构建原核表达载体，原核表达融合蛋白；接着通过Western blotting进行抗原性分析,筛选表达量高、抗原性较好的重组蛋白抗原进行纯化作为包被抗原，最终获得了灵敏度较高、特异性强、稳定性好的间接ELISA试剂盒。
[0011]应用本发明对猪传染性胃肠炎病毒标准阳性血清、猪瘟病毒标准阳性血清、猪繁殖与呼吸综合症病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、口蹄疫病毒标准阳性血清、伪狂犬病毒标准阳性血清进行检测，结果均为阴性，说明该试剂盒具有很好的特异性，所用的诊断抗原与其他病原抗体之间无交叉反应；血清吸附试验及竞争性抑制试验结果均表明以本发明为基础建立的ELISA方法具有较好的特异性。本发明在广西部分城市猪流行性腹泻病毒抗体的检测实践中得到进一步验证，其具有特异性强、敏感度高、操作简单等特点，易于大范围推广使用，具有广阔的市场前景，可用于流行性腹泻感染情况的血清学调查、抗体监测及疫苗免疫效果的评估等方面。
【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1是猪流行性腹泻病毒N基因(编码核衣壳蛋白)扩增的电泳图，图中:泳道1、2 为 N 基因，泳道 M 为 DNA Marker DL2000。
[0013]图2是Nh序列(扩增核衣壳蛋白内部主要亲水区序列)扩增的电泳图，图中:泳道
1、2为 Nh，泳道 M 为 DNA Marker DL2000。
[0014]图3是Nh基因插入原核表达载体pET32a ( + )中得到的原核表达质粒pET32a_Nh的酶切鉴定图，图中:泳道1-4为重组质粒pET32a-Nh的双酶切片段，泳道Ml为DNA MarkerDL2000，泳道 M2 为 IKb Ladder。
[0015]图4是重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE分析图，图中:泳道I为PET32a空载体诱导菌体蛋白，泳道2为Nh未诱导菌体蛋白，泳道3为Nh诱导菌体蛋白，泳道M为预染蛋白质 Marker0[0016]图5是重组菌诱导表达产物的Western-blot分析图，图中:泳道I为纯化后蛋白Nh,泳道2为Nh诱导菌体蛋白，泳道3为pET32a-BL21 (DE3)菌体诱导蛋白，泳道M为预染蛋白Marker
[0017]图6是纯化后的重组蛋白Nh的抗原性鉴定图(一抗采用猪流行性腹泻病毒阳性猪血清)，图中:泳道I为纯化后的重组蛋白Nh (用以作为猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的包被抗原)，泳道M为预染分子量蛋白Marker。
[0018]图7是N蛋白DNAStar-Protean软件分析图，图中:N蛋白序列两箭头中间为本试验选择的Nh蛋白序列。
【具体实施方式】
[0019]1.Nh序列的扩增及原核表达载体的构建
[0020]参考杨敏(硕士学位论文，甘肃农业大学，2006)设计的N基因引物扩增扩增猪流行性腹泻核衣壳蛋白基因，扩增N基的上游引物为:5’ -CCGAGTGCGGTTCTCACAGAT-3’(序列表 SEQ.1D.N0.4)，下游引物为:5’ -CATAGCCAGGATAAGCCGGTC-3’(序列表 SEQ.1D.N0.5);以猪流行性腹泻病毒广西流行毒株为模板PCR扩增N基因(图1，序列表SEQ.1D.N0.3)。PCR反应体系为 10 X PCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (IOmM) 0.25 μ L, Ex-Taq 聚合酶(5U/ μ L) 0.25 μ L,上下游引物Ν1/Ν2 (25ρπιο1/μ L)各0.5μ L，以无菌ddH20加至25μ L。PCR反应程序95°C 5min ；94°C lmin、48°C lmin、72°C lmin30s，共 35 个循环；72°C IOmin ;4°C保存。目的基因回收并克隆至PMD-18T中获得克隆质粒pMD-N。再设计一对添加酶切位点的引物，扩增 Nb 基因片段的上游引物为:5’ CGC GGATCC GTTGAACCTAACACA-3’(序列表 SEQ.1D.N0.6)；下游引物为:5’ -CCG CTCGAG GTAGCCTGAGGCATC-3’(序列表 SEQ.1D.N0.7);PCR 扩增保守且抗原性较强的N蛋白内部主要亲水区序列，即Nh (图2，序列表SEQ.1D.N0.2)。PCR体系为10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (IOmM) 0.25 μ L，Ex-Taq 聚合酶(5U/μ L) 0.25 μ L，上下游引物Nhl/Nh2 (25pmol/y L)各0.5μ L，以无菌ddH20加至25μ L。PCR反应程序为94°C预变性4min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，72°C延伸7min，4°C保存。目的基因回收并克隆至PMD-18T中获得克隆质粒pMD-Nh，经BamH I和Xho I双酶切以及测序鉴定正确后再将Nh基因亚克隆到原核表达载体pET32a(+)中，经BamH I和Xho I双酶切以及测序鉴定正确得到原核表达质粒pET32a-Nh (图3)。
[0021]2.1PTG诱导表达
[0022]将原核表达质粒pET32a_Nh转入到宿主表达菌BL21(DE3)中，将阳性菌株接种于新鲜含有AMP (100μ g/mL)的LB培养基中，37°C震荡培养，待0D600达到0.6左右时加入IPTG (终浓度1.0mM), 28°C诱导8h，表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，结果表明重组蛋白Nh得到高效表达(图4和图5，序列表SEQ.1D.N0.1)。收集表达菌株，冻融数次并进行超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果表明重组蛋白Nh为大部分可溶性表达。用猪流行性腹泻病毒阳性血清作为一抗，二抗用山羊抗猪IgG抗体，对重组蛋白的抗原性进行分析，结果表明重组蛋白Nh具有良好的抗原性。
[0023]3.重组蛋白的纯化
[0024]因重组蛋白Nh融合有多聚组氨酸(6XHis)标签，故采用Ni2+亲和层析的方法纯化重组蛋白Nh。经鉴定重组蛋白Nh为大部分可溶性表达，故取可溶性上清液过N1-NTA，通过改变缓冲液的PH值来洗去杂蛋白，纯化目的蛋白。纯化后得到大小为39kDa，条带单一的目的蛋白，对纯化后的重组蛋白Nh复性后进行Western-blot分析其抗原性，结果表明纯化后的重组蛋白Nh具有良好的抗原性(图6)。
[0025]4.包被液、洗涤液、稀释液的配制
[0026]包被液为ρΗ9.6 的 0.05Μ 碳酸盐缓冲液(Na2CO30.159g，NaHCO30.293g，加灭菌ddH20至1OOmL) ； 10 X洗涤液为含0.5%吐温-20的0.1M的PBS溶液(pH7.2-7.4);样品稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%叠氮钠的0.01M的PBS溶液(pH7.2-7.4)。
[0027]5.显色液及终止液的配制
[0028]显色液A:称取200mg四甲基联苯胺，溶于1OOmL的无水乙醇中，双蒸水定容至1000mL ;显色液B:称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL,调节PH值为4.5-5.0。显色液A和显色液B均为60mL。终止液:终止液为2M H2SO4，将11.1mL的浓硫酸缓慢加入水中稀释，并定容至100mL。
[0029]6.ELISA反应条件的确定
[0030]最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定。采用方正试验，分别将包被抗原进行1:10，1:20, 1:40, 1:80, 1:160 和 1:320 稀释，酶标二抗进行 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000和1:16000稀释，组成方正进行ELISA。最终确定最佳抗原包被量为1 μ g，酶标二抗的最佳稀释度为1:8000。并对最佳包被条件、最佳封闭液及封闭条件、待检血清稀释倍数、血清孵育时间、二抗作用时间以及底物显色时间等作了逐一优化，最终确定本研究的检测猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA的最佳反应条件为:最佳包被抗原量为1 μ g，37°C湿盒包被2h ；5%的脱脂奶粉，37°C封闭2h ;待检血清稀释80倍，37°C孵育Ih ;二抗稀释度为1:8000，37°C反应1h ;底物显色条件为TMB底物室温避光显色IOmin。
[0031]7.猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA阴阳性临界值的确定
[0032]收集20份猪流行性腹泻病毒阴性猪血清，用优化好的ELISA反应条件检测这20份猪流行性腹泻病毒阴性血清的OD45tl值。经计算20份阴性血清的0D450值的平均值为0.211，标准差为0.049，所以阴阳性临界值=阴性血清样本的平均值+3倍标准差=0.211+3X0.049=0.358。故将阴阳性临界值定为0.358，为了判定方便，把临界值定为
0.36。即在已优化好的ELISA反应条件下，P/N值≥2.1，待检血清样本0D450值≥0.36即判定为阳性，反之为阴性。
[0033]8.猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA检测试剂盒组成:
[0034]1) ELISA板(预包被重组蛋白Nh):5块
[0035]2) 10X浓缩洗涤液，规格为200mL ；
[0036]3)样品稀释液，规格为1OOmL ；
[0037]4)羊抗猪酶标二抗(酶标抗体)，美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得，规格为60mL;
[0038]5 )显色液A，规格为60mL ；
[0039]6)显色液B，规格为60mL ；
[0040]7 )终止液为2M的H2SO4溶液，规格为30mL ；
[0041]8)猪流行性腹泻阴阳性对照血清各2mL。
[0042]9.猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA操作步骤:[0043]I)在稀释板中将待检血清及阴阳性对照血清用样品稀释液进行80倍稀释，混匀后取100 μ L加入到酶标板中，37°C孵育2h ;倾去酶标板内液体，加入300 μ L洗涤液洗涤3-5次，每次3min，最后一次拍干；加入酶标抗体100μ L，37°C孵育Ih ;倾去酶标板内液体，加入300 μ L洗涤液洗涤3-5次，每次3min，最后一次拍干；依次加入显色液A和显色液B各50 μ L，室温避光显色IOmin ;加入终止液50 μ L终止显色，用酶标仪测定OD45tl值，并根据OD值判定结果。
[0044]2 )结果判定:当阳性对照的OD45tl值与阴性对照的OD45tl值的比(Ρ/Ν值)≥2.1，待检血清样本OD45tl值> 0.36即判定为阳性，反之为阴性。
[0045]10.临床血清样品的检测结果
[0046]用该试剂盒对2012年8月至2013年5月收集的来自广西南宁、贵港、防城港玉林、桂平、柳州6市12个猪场的704份猪血清样品的检测结果如表3-13。
[0047]来自不同猪场的血清样品阳性率各不相同，从31.4%~92.9%。其中，柳州4场的PEDV血清阳性率最低，为31.4% ;其余的11个猪场，血清阳性率均高于50%。临床样品采自哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、后备母猪、经产母猪、种公猪等，其中，来自南宁某场的126份种猪血清在采血前一个月免疫过猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活苗(利力佳，成都天邦)，该场血清阳性率最高，为92.9%。
[0048]表1临床血清样品的检测结果
[0049]
【权利要求】
1.一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，其特征在于:所述包被酶标板以重组蛋白Nh作为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述重组蛋白Nh具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的喊基序列的基因编码。
3.根据权利要求2所述的检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述包被酶标板每孔包被重组蛋白Nhl μ g，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5%的脱脂奶粉作为封闭液进行封闭。
4.根据权利要求3所述的检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述阴性对照血清和阳性对照血清各2mL ； 所述酶标二抗为60mL，由美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得； 所述浓缩洗涤液为10 X洗涤液，为含0.5%吐温-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL ； 所述样品稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%叠氮钠pH7.2-7.4的0.0lM的PBS溶液，共IOOmL ； 所述显色液包括显色液A和显色液B，显色液A:称取200mg四甲基联苯胺，溶于IOOmL的无水乙醇中，双蒸水定容至IOOOmL ;显色液B:称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至IOOOmL,调节PH值为4.5-5.0。显色液A和显色液B均为60mL ； 所述终止液为2M的H2SO4溶液，共30mL。
5.根据权利要求4所述的检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述重组蛋白Nh按以下操作制备:以猪流行性腹泻病毒流行毒株为材料，通过RT-PCR扩增N基因内部主要亲水区序列135-319位氨基酸，并获得重组质粒pMD-Nh ;再将Nh片段亚克隆到表达载体pET-32a(+)中获得原核表达质粒pET32a-Nh ;将原核表达质粒pET32a_Nh转化进宿主表达菌BL-21 (DE3)中，经IPTG诱导表达获得重组蛋白Nh ;利用Ni2+亲和层析法纯化获到具有生物学活性的重组蛋白Nh。
【文档编号】G01N33/569GK103675274SQ201310701145
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】黄伟坚, 郭旋, 龙凤 申请人:广西大学