专利名称：：由人体体表角质生长物测定体内甾体激素及其衍生物含量的检测方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种由人体体表的毛发、指甲或趾甲等角质生长物测定体内甾体激素及其衍生物含量的检测方法。甾体激素是人体内分泌激素中的主要组成部分之一，不仅对正常的新陈代谢和生理功能有重要和巨大的影响，而且体内不同种类的甾体激素含量水平的变化也常可预示和反映身体的不同生理状况，因而对其在体内含量水平的检测常用于医学诊断和其它有关领域的分析判断。例如，对雌二醇、孕酮等生殖激素的检测，在女性的生理变化或疾病诊断中是一个重要的检测项目和判断依据；在体育比赛的兴奋剂检测中，对运动员体内的雄性激素等甾体激素或其衍生物含量的检测也是用于判断的重要依据。此外，对体内多种肾上腺皮质类的甾体激素或其衍生物含量的检测在医学诊断和治疗上也常具有十分重要的意义和价值。目前临床上检测人体内甾体激素含量的方法都是通过对人体的血液、唾液、尿液、精液或组织等采样后才能进行检测，其中大多数又都是依赖抽取血样进行的。这些方法，特别是抽取血样的方法，许多缺点是十分明显的。首先，被采样者必须到医院或有相应条件的地点才能取血，血液的抽取量不能太大，并还容易因此传播或被传染上疾病，因而许多人不易接受。其次，血液样品的处理过程麻烦，易被污染，且必须在冰箱中保存，又不宜长途运输。而在对以雄性激素或其衍生物为主的兴奋剂检测时，长期以来一直使用对采集的尿液样品进行检测的方法。而尿液的采集也有许多困难，且尿液的处理也十分麻烦，检测仪器又非常昂贵，但最大的问题还是兴奋剂的服用者可以采取一些方法避开对其真实尿液的兴奋剂检测。因此，在兴奋剂的检测上目前也已有越来越多的呼吁以血液检测代替尿液检测，但随血液检测而来所不可避免的上述诸多缺点，必然又会成为无法回避和要解决的问题。本发明的目的是为解决上述问题而提供一种新的人体内甾体激素及其衍生物含量水平的检测方法，它是通过对人体的体表角质生长物为采样样品进行检测，从而克服和进免了目前以体液，特别是以血液为样品进行检测的诸多缺点和问题。本发明的体内甾体激素及其衍生物含量的检测方法，是以人体的头发、胡须、指甲或趾甲等体表的角质生长物为采样的样品，其中特别以人的头发为采样样品最方便和有实际应用价值。测定方法按下述步骤操作1)取人体体表的角质生长物粉碎，例如，可剪切成细碎小段或碎末后，用可溶解被检测的甾体激素或其衍生物成分的有机溶剂浸泡，充分萃取至少一次，一般可为两次，然后将全部萃取液挥尽溶剂，得到萃取提取物；2)将上步得到的萃取提取物置于pH7.2-7.4的磷酸缓冲液中，于相当于人体体温的温度，即35-39℃放置25-35分钟后，再于室温至少混旋1分钟；3)用常规的放射免疫方法或酶免疫方法测定上步混旋液中被测的甾体激素或其衍生物的含量。上述方法中所说萃取用的有机溶剂最好为沸点低于100℃的低沸点类溶剂，以便萃取后挥除或回收萃取溶剂的操作。例如可以使用常规的甲醇、乙醇、乙醚、丙酮等低沸点的含氧溶剂，也可以使用沸程为30-60℃的石油醚等非极性溶剂。其中尤以使用乙醚作为萃取溶剂为佳，萃取效果好，沸点低，易于挥除和回收，后处理方便，且价廉易得。本专利申请的发明以采集人头发样品为例，按下述方法进行处理，提取不同的甾体激素，进行了检测和有关的分析研究。将人的头发剪切成细碎次段后，用乙醚(或沸程为30-60℃的石油醚)作萃取溶剂，按每25-50毫克头发样品用溶剂约2毫升的比例混旋至少1分钟后，放置1小时以上，分离出萃取液后，再按上述一半的比例加入同种溶剂重复上述的萃取操作1-2次。合并各次萃取液自然挥尽或水浴加热挥尽溶剂后，得到萃取提取物。将磷酸二氧钠-磷酸氧二钠组成的pH7.2-7.4的磷酸缓冲液0.2-0.3毫升加入到该萃取提取物中混旋并置于35-39℃，通常最好可在37±0.5℃的水浴中约30分钟后取出，在室温下再混旋约1分钟，即成为供检测用的备用品。采用与对人血清(或血浆)甾体激素检测相同的放射免疫方法(RIA)或酶免疫方法(EIA)等常规检测方法，或者世界卫生组织(WHO)规定的放射免疫方法或酶免疫方法，对上述检测备用品中的有关甾体激素进行检测。以采用125碘标记的RIA检测方法为例，对上述人发样品中所含的甾体类生殖激素的含量变化情况及影响因素进行了检测和进一步的深入研究。将样本数n＝17例在24小时内未用任何洗发剂洗过的女性头发样品分别取样后，分为直接检测、分别用市售的中日合资上海花王有限公司生产的“花王牌洗发剂”和“诗芬牌洗发剂”洗过的三种被检测试样样品，并又均将其按发尖部、发中段和发根部三部分分别检测，以考察头发不同部位中的雌二醇(E2)和孕酮(P)两种甾体激素的分布差异，以及洗发剂对其在头发中含量的影响。实验结果分别如表1和表2所示。表1和表2的实验数据清楚显示出，在头发的不同部位间，E2和P两种甾体激素的含量，以及洗发剂对头发不同部位中该两种激素含量变化的影响，以表1所列各数据间的差异为大。对表1中“三种头发状况分部位的E2量平均值”的数据中的最大差异值(42.8与47.1)经统计学的处理，t＝0.90，0.677(t＜1.291，故0.50＞p＞0.20，表明其最大差异组间已无显著性差异。由此可知，其它各组数据间显然也更无显著性差异了。这既说明了人体内的甾体激素在人的头发中是普遍存在的，且其在头发中的存在和分布可不受头发的根、中、梢等采样部位差异的影响，也表明了其含量不会因是否用洗发剂清洗等外部处理因素的影响而改变，具有相对的稳定性，因而使本发明的方法具有了可实际应用的基础和价值。同时，这一实验所表明的另一方面的重要的意义和价值还在于如果某一洗发剂或化装品对头发或其它使用部位的体表角质生长物的甾体激素检测产生较大或是严重的影响，则至少可以作为表明该洗发剂或化装品很可能是不适合于人体使用的重要依据。分别将不同样本数的男性和女性的头发样品与血液样品中的同种激素的含量进行检测，并进行统计学处理，作其相关性研究。结果表明，此二者间存在有明显的相关性。有关相关性的实验和统计结果数据参见表3。将样本数n＝37例的女性在其正常月经周期中的卵泡期(月经第7-10天)、排卵期(月经第14天)和黄体期(月经第20-24天)三个生理阶段中分别取头发样品进行检测，以考察头发中的甾体激素含量与人体生理状况变化间的规律关系。检测得其中雌二醇的平均含量分别为22.8、21.8和25.6(pg/g)。此含量变化规律与L.特雷格在其所著的《类固醇激素》(科学出版社，1980)中记载的女性雌二醇激素的血浆水平与性周期关系研究结果中所表述的变化规律是完全吻合的。除以上述的头发样品进行实验外，以人的指甲为检测样品，同样进行了甾体激素含量的检验实验。将取自女性的指甲样品粉碎后，用上述相同的处理方法得到待测的混旋液后，检测到其中雌二醇的含量为102pg/g，孕酮的含量为5.9ng/g。表明除头发外，人体体表的其它角质生长物同样也含有可以利用并具有检测意义和价值的甾体激素。除上述激素外，对人体内的其它甾体激素的检测也同样是可行的。例如，分别对n＝7例的男性和n＝7例女性的进行检测发现，其每50毫克毛发中皮质醇激素的平均含量均为9ng。这些实验结果已充分表明，无论男性还是女性，甾体激素不仅在头发中均稳定存在，而且其含量及变化与其在血液中的存在状况具有显著的相关性。即，对其在头发中含量的检测与对其在血液中含量的检测是具有同等的意义和价值的。以放射免疫方法对上述有关甾体激素的检测实验结果及其结论，采用“磁性微粒分离的免疫酶联测定法(IEMA)”检测同样是可行的。显然，上述的检测原理及操作方法对于有关的甾体激素衍生物的检测无疑同样也是适用和可行的。由于迄今为止，人们并未认识到在人发中，当然更不可能认识到在人的胡须、指(趾)甲等人体体表的这些角质生长物中含有甾体激素，并有着与人体生理、病理状况的变化相适应的自身变化规律及其重要的应用价值，因此本发明的方法在科学上的重要意义是显而易见的。上述实验结果所表明的实际应用意义和价值同样也是显而易见的，它可以彻底改变对人体甾体激素及其衍生物的检测必须到医院或有相应条件的地点抽取血样的传统方式，以人体体表的角质生长物，特别是以量大易得而目前通常被视为废弃物的人发为检测样品，可以具有同等的意义和作用，简便易行，没有任何痛苦，不会感染和传播疾病，因而易于为人们广泛接受，而且避免了随对血液的采样和检测而带来的诸多弊端和不便，又大大降低了检测的费用成本，不仅在疾病的医学检验和诊断上有重大的使用意义和价值，在科学研究上也有重要意义，它可成为内分泌研究的重要手段。在简化和方便如对运动员的兴奋剂检测等其它有关领域的应用也具有重要和巨大的现实意义和价值。表1头发中雌二醇(E2)的含量测定结果(n＝17，E2含量单位为pg/g)</tables>注含量单位中的pg为10-12克表2头发中孕酮(P)的含量测定结果(n＝17，P含量单位为ng/g)</tables>注含量单位中的ng为10-9克表3人发与血液中同种甾体激素间的相关性\性别及样本数激素种类头发中含量血清中含量发中含量/血中含量相关值(r)相关性女n＝35雌二醇25.6pg/g59.8pg/ml42.8％0.3960.05＞p＞0.025显著性相关女n＝35孕酮8.25ng/g13.1ng/ml63.5％0.4400.025＞p＞0.01显著性相关男n＝5睾酮1.30ng/g4.86ng/ml26.7％0.9200.025＞p＞0.01显著性相关</table></tables>权利要求1.一种由人体体表角质生长物测定体内甾体激素及其衍生物含量的检测方法，其特征在于按下述步骤操作1)取人体体表的角质生长物粉碎后，用可溶解被检测的甾体激素或其衍生物成分的有机溶剂浸泡，充分萃取至少一次后，将全部萃取液挥尽溶剂，得到萃取提取物；2)将上步得到的萃取提取物置于pH7.2-7.4的磷酸缓冲液中，于35-39℃放置25-35分钟后，再于室温至少混旋1分钟；3)用常规的放射免疫法或酶免疫法测定上步混旋液中被测甾体激素或其衍生物的含量。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所说的有机溶剂为沸点低于100℃的低沸点有机溶剂。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所说的有机溶剂为含氧的低沸点有机溶剂。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所说的有机溶剂为乙醚。5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所说的有机溶剂为沸点范围为30-60℃的石油醚。6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所说的用溶剂萃取时有机溶剂的用量为25-50毫克的被萃取角质物用溶剂2毫升的比例，萃取次数至少为两次。7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于所说的用溶剂萃取时有机溶剂的用量为25-50毫克的被萃取角质物用溶剂2毫升的比例，萃取次数至少为两次，每次萃取和放置时间至少为60分钟，合并各次萃取液自然挥尽或水浴挥尽萃取溶剂后得到萃取提取物。8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于将所说的萃取提取物置于由磷酸二氢钠—磷酸氢二钠组成的缓冲液中，于37±0.5℃水浴下放置约30分钟后取出，再于室温下混旋1分钟后，用常规的免疫测定方法测定其中的甾体激素或其衍生物含量。9.如权利要求1至8之一所述的检测方法，其特征在于所说的人体体表角质生长物为人体的毛发。10.如权利要求1至8之一所述的检测方法，其特征在于所说的人体体表角质生长物为人体的指甲或趾甲。全文摘要本发明涉及的是一种由人体体表角质生长物测定体内甾体激素及其衍生物含量的检测方法,按下述步骤操作:1)取人体体表的角质生长物粉碎后,用可溶解被检测的甾体激素或其衍生物成分的有机溶剂浸泡,充分萃取至少一次后,将全部萃取液挥尽,得萃取提取物;2)将所得到的萃取提取物置于pH7.2—7.4的磷酸缓冲液中,于35—39℃放置25—35分钟后,再于室温至少混旋1分钟;3)用常规的放射免疫法或酶免疫法测定上步的混旋液中甾体激素或其衍生物的含量。文档编号G01N33/53GK1173641SQ97107498公开日1998年2月18日申请日期1997年5月19日优先权日1997年5月19日发明者杨惠钟申请人:四川省计划生育科学研究所