专利名称：微装配成像流式细胞仪的制作方法
微装配成像流式细胞仪本申请为2011年3月3日提交的、标题为“Microassembled Imaging FlowCytometer”的第13/039，990号美国专利申请的PCT申请，并且要求于2010年3月15日提交的、标题为 “Microassembled Confocal Imaging Flow Cytometer，，的第 61/314，056 号美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请的全部公开内容通过引用合并于此。
背景技术：
细胞计量术是涉及生物细胞的计数和表征的技术专业。图I示出了用于执行被称为成像流式细胞计量术的技术的系统的简化图。在成像流式细胞计量术的基本形式中，细胞101悬浮在流体中并在狭窄的透明管102内单行(single-file)夹带。该夹带可以通过包括流体动力聚焦的几种方法中的任一种来实现。当每个细胞101经过测量位置时，光源103照射每个细胞101。光源103可以例如为激光器。来自光源103的光因正被测量的细胞101而散射。部分光105被物镜106聚集并被重导向以在光传感器107处形成图像。光 传感器107可以例如为显微镜或摄像装置的部件。各种光学部件可以与物镜106协作将光105导向传感器107，例如包括部分反射镜108和附加透镜109。来自传感器107的输出信号被发送至处理单元110，该处理单元110可以存储并分析这些信号以识别与每个细胞有关的信息，例如细胞的大小和与细胞的内部结构有关的一些信息。在一些应用中，会期望紧凑型细胞计量系统，例如用于便携式使用、或用于在小诊所中的循环肿瘤细胞筛选。

发明内容
根据一个方面，一种微装配成像细胞仪包括经历与细胞的相对运动的感测位置、光源以及聚焦元件。该聚焦元件将来自光源的光聚焦为在感测位置处的多个聚焦照射点，以使得细胞在穿过感测位置时被一个或多个聚焦照射点照射。该细胞仪还包括阵列光传感器和聚光透镜(collection lens)，该聚光透镜将从细胞发出的光聚集并重新聚焦到阵列光传感器上。在一些实施例中，微装配成像细胞仪还包括流道(flow channel),细胞通过该流道被流动流体输送，该流道至少部分地被壁限界，该壁的至少一部分基本上是透明的。相对运动可以至少部分地由细胞的移动产生。相对运动可以至少部分地由细胞仪的一部分的移动产生。在一些实施例中，细胞附于载片，其中，相对运动至少部分地由载片的移动产生。在一些实施例中，从感测位置的一侧执行对细胞的照射，并且从感测位置的同一侧执行对从细胞发出的光的感测。在一些实施例中，从感测位置的一侧执行对细胞的照射，并且从感测位置的不同侧执行从细胞发出的光的感测。聚焦元件可以包括具有球面的微透镜的阵列。聚焦元件可以包括具有非球面的微透镜的阵列。聚焦元件可以包括至少一个衍射元件。光源可以包括激光器。在一些实施例中，阵列光传感器包括像素的阵列并产生表示落在像素上的光的强度和分布的信号，并且该细胞仪还包括至少部分地基于信号来构建细胞的数字图像的处理单元。在一些实施例中，处理单元部分地通过对在不同时间从细胞的不同部分取得的光强度读数进行空间关联来构建细胞的数字图像。在一些实施例中，至少部分地基于细胞穿过感测位置的速度来执行对在不同时间从细胞的不同部分取得的光强度读数的关联。聚焦元件可以包括微透镜的线性阵列。聚焦元件可以包括微透镜的二维阵列。阵列光传感器可以包括像素的线性阵列。阵列光传感器可以包括像素的二维阵列。在一些实施例中，微装配成像细胞仪还包括在感测位置与阵列光传感器之间的至少一个光滤波器。在一些实施例中，阵列光传感器包括选自以下组的至少一个传感器该组包括电荷耦合器件传感器、电子倍增电荷耦合器件传感器、雪崩光电二极管传感器、光电倍增管以及互补金属氧化物半导体传感器。在一些实施例中，多个聚焦照射点形成聚焦照射点的阵列，该阵列相对于细胞的运动和感测位置而歪斜。微装配成像细胞仪还可以包括接近阵列光传感器的光学元件，该光学元件将微装配成像细胞仪配置为基本上共焦。光学元件可以包括微孔(microaperture)的阵列。光学元件可以包括光纤束。在一些实施例中，聚光透镜聚集并重新聚焦从细胞通过荧光发出的光。根据另一方面，一种执行细胞计量术的方法包括使用光源来产生光束；将来自光束的光聚焦为在经历与细胞的相对运动的感测位置处的多个聚焦照射点；以及将从细胞 发出的光聚集并重新聚焦到阵列光传感器上。该方法还包括从阵列光传感器产生表示落在阵列光传感器上的光的强度和分布的信号；以及使用处理单元来至少部分地基于来自阵列光传感器的信号构建细胞的数字图像。该方法还可以包括将信号转换为表示落在阵列光传感器上的光的图案的数值。在一些实施例中，构建细胞的数字图像还包括取得落在阵列光传感器上的光的一系列时序读数；对应于各个聚焦照射点单独地跟踪来自阵列光传感器的光读数；以及至少部分地基于已知的系统几何结构、细胞的行进速度以及取得光读数的频率来对单独的光读数进行空间校准。在一些实施例中，该方法还包括对从细胞发出的光进行滤波，以选择性地阻挡由光源发射的波长的光并选择性地使从细胞通过荧光发出的波长的光通过。在一些实施例中，该方法还包括设置接近阵列光传感器的光学元件，该光学元件将微装配成像细胞仪配置为基本上共焦。根据另一方面，微装配成像细胞仪包括经历与细胞的相对运动的感测位置、光源以及聚焦元件。该聚焦元件将来自光源的光聚焦为在感测位置处的多条聚焦照射线，以使得细胞在穿过感测位置时被一条或多条聚焦照射线照射。微装配成像细胞仪还包括光传感器以及聚光透镜，该聚光透镜将从细胞发出的光聚集并重新聚焦到阵列光传感器上。该光传感器可以包括像素的阵列。根据另一方面，微装配成像细胞仪包括经历与细胞的相对运动的感测位置、光源以及聚焦元件。该聚焦元件将来自光源的光聚焦为在感测位置处的多个聚焦照射点或线，以使得细胞在穿过感测位置时被一个或多个聚焦照射点或线照射。微装配成像细胞仪还包括阵列光传感器；聚光透镜，将从细胞发出的光聚集并重新聚焦到阵列光传感器上；处理单元，分析来自光传感器的信号以对细胞进行归类；以及分选机构，将所归类的细胞引导至至少两个收集通道中的一个。


图I示出了用于执行成像流式细胞计量术的系统的简化图。图2示出了根据本发明的实施例的微装配成像细胞仪的示意斜视图。图3示出了根据本发明的实施例的、图2的微装配成像细胞仪的一部分的正交视图。图4示出了根据本发明的实施例的、图2的示例微装配成像细胞仪示例的一部分的不意顶视图。图5A示出了根据本发明的实施例的、在图2的微装配成像细胞仪的不同感测器位置处所取得的光读数如何根据时间改变。图5B示出了在空间校准后的图5A的轨迹。图6示出了根据图5A和图5B的数据构建的数字图像。图7示出了根据本发明的实施例的微装配共焦成像细胞仪。图8示出了根据其他实施例的微装配共焦成像细胞仪。 图9示出了根据又一些其他实施例的微装配成像细胞仪。图10示出了图9的微装配成像细胞仪中的一些部件的歪斜的效果。图11示出了根据其他实施例的微装配成像细胞仪，其中从感测位置的同一侧照射并感测细胞。图12示出了根据其他实施例的微装配共焦成像流式细胞仪。图13示出了根据本发明的实施例的、图12的系统的正交视图。图14示出了可以由一个细胞穿过图12的系统的感测区域产生的一系列光强度读数。图15示出了根据本发明的实施例的、与分选机构耦接的检测和分析系统。
具体实施例方式图2示出了根据本发明的实施例的微装配成像细胞仪200的示意斜视图。图2不一定是按比例绘制的，并且为了清楚，可以省略或简化一些部分。为了本公开的目的，术语“微装配”意味着使用如下部件、设备以及技术来装配这些部件、设备和技术使得能够对装配公差(assembly tolerance)比可利用传统机械工具和装配技术实现的装配公差小得多的非常小的结构进行装配。例如，各部件可以具有功能特征或大约5至100微米的尺寸，并且可以使用被专门设计成操作装配公差为大约O. I到10微米的小部件的设备来将这些部件装配在一起。微装配技术可以缩短另外相隔较远的光学或机械部件的间距，从而使得能够实现集成和并行。微装配的成像细胞仪200包括流道(flow channel) 201,细胞通过该流道在流动的流体中被输送。流道201被壁202限界，该壁202的至少一部分基本上是透明的。该系统还包括光源203，该光源203产生用于照射细胞101的光束204。光束204优选地为相干光束，因此，光源203便利地为激光器。聚焦元件205接收来自光源203的光并将光聚焦为在流道201内的感测位置207处的多个聚焦照射点206。由于细胞101流过流道201，感测位置207和细胞101经历相对运动。在任一时间，细胞101在穿过感测位置207时可以被一个或多个照射点206照射。在示例系统200中，聚焦元件205包括微透镜205A的二维阵列,但是可以使用其他种类的聚焦元件。例如，聚焦元件205可以为菲涅尔波带片阵列、原始纳米孔阵列的透射或反射全息图、或另一种聚焦元件。每个微透镜205A可以产生照射点206(为了清楚，在图2中仅示出两个照射点206。)感测位置207可以基本上是平坦的，并由聚焦照射点206的轨迹限定。
当细胞101遇到一个聚焦照射点时，光208从细胞101发出。例如，细胞101可以标记有在被来自光束204的聚焦光激励时通过荧光发出光的荧光团。替选地，微装配成像细胞仪200可以使用从细胞101散射的光来执行细胞101的直接成像。从细胞101发出的光208中的至少一部分被聚光透镜209聚集并重新聚焦到阵列光传感器210上。(在图2中用虚线示出了其他光束214，该其他光束214表示当细胞101处于流道201中的不同位置时可以从细胞101发出的光。)诸如滤波器211的一个或多个滤波器可以放置在感测位置207与阵列光传感器210之间。例如，滤波器211可以存在于流道201与透镜209之间、透镜209与阵列光传感器210之间、或者透镜209的元件之间(在透镜209包括多个元件的情况下)。例如，滤波器211可以选择性地阻挡由光源203发射的波长的光，并且选择性地使从细胞101通过荧光发出的波长的光通过，使得到达阵列光传感器210的光基本上全部通过荧光产生。例如，阵列光传感器210可以是数字摄像装置的部件，并且可以包括光敏元件的有序阵列，其中光敏元件可以称为像 素。阵列光传感器210可能在未示出的其他电子设备的控制下产生表示在给定的曝光时间内落在每个像素上的光的强度的信号。从而，这些信号表不在曝光期间落在阵列光传感器210上的光的强度和分布。这些信号可以被传送212至处理单元213以进行存储、分析或显示。可以例如使用模数转换器(未示出)来将信号转换为数字值，该模数转换器可以存在于系统中的任意便利位置。处理单元213可以包括微处理器和其他电子部件，并且可以例如为被专门编程为对来自阵列光传感器210的信号执行各种分析的通用计算机。如将在稍后进行更详细说明的，处理单元213可以收集按时间间隔所取得的来自阵列光传感器210的一系列数字图像，并且可以根据该系列图像构建细胞101的图像。图3示出了如沿着图2中示出的Y方向看到的、示例性微装配成像细胞仪200的一部分的正交视图。微透镜205A接收光束204。微透镜205A可以具有球面(S卩，每个透镜的曲面可以是球面的一部分)，或者为了获得非常小的点大小和高分辨率，微透镜205A可以优选地具有非球面。已知用于构造包括非球面微透镜的微透镜的阵列的技术。例如参见Hongmin Kim, Gibong Jeong, Young-Joo Kim, and Shinill Kang, “Design and Fabricationof Aspheric Microlens Array for Optical Read-OnIy-Memory Card System，，, JapaneseJournal of Applied Physics, Vol. 45，No. 8B, 2006，pp. 6708-6712,其全部公开内容通过引用合并于此。微透镜205A的大小和间距可以为任意可使用的值，但是优选地，微透镜205A的中心可以相隔5到20微米之间。在一个示例性实施例中，每个微透镜205A可以具有大约15微米的直径，并且微透镜205A可以相隔大约15微米来密集地压紧。优选地，使微透镜205A之间的任何间隙都不透光，以使得通过聚焦元件205的任何光通过一个微透镜205A的聚焦表面。从聚焦元件205到感测位置207的距离可以例如为大约10到100微米，并且优选地小于50微米。根据最终所得到的图像的期望像素密度，实施本发明的系统可以包括比所示出的微透镜更多或更少的微透镜。在一些实施例中，可以使用大约200个微透镜。每个微透镜205聚焦光束204的一部分，使得在感测位置处产生多个聚焦照射点206。感测位置207优选地在流道201的中心附近，并且在细胞101穿过流道201时，流道201优选地将细胞101约束成包围感测位置207。虽然系统200可以适于表征各种细胞并且以任何适当的速度工作，但是典型细胞101可以为大约10到20微米宽，并且可以以例如每秒I到50毫米的速度穿过流道201。系统的采样分辨率由获得数字图像的速度以及细胞101穿过流道201的速率来确定。该系统的光学分辨率主要按照聚焦照射点206的大小来设定。非球面微透镜205A能够实现大小为O. 5微米或更小的焦点。从细胞101发出的光208被聚光透镜209聚集并且被重新聚焦到阵列光传感器210上。虽然在图3中将聚光透镜209描绘为简单的双凸透镜，但是可以使用任何适合的透镜配置，包括平凸透镜、凹凸透镜、多元透镜或其他种类的透镜。由于系统的光学分辨率主要按照聚焦照射点206的大小来设定，因此，聚光透镜209的性能可以不是关键的，只要来自各种微透镜205A的光被导向阵列光传感器210的表面上的分立且可辨别的池。处理单元213可以仅仅对来自传感器210的几个相邻像素的读数进行求和以估计从任何特定的聚焦照射点206发出的光208的强度。在图3所示的系统中，聚光透镜209被配置用于进行单位放大，但是这不是要求。聚光透镜209可以被配置为将聚焦照射点206的较大或较小的图像投射到阵列光传感器210上。在一些实施例中，聚光透镜209可以投射与单位放大图像相比放大了 2X到5X的图像。从流道201到阵列光传感器210的距离可以为任何适当 的距离，但可以为例如大约5毫米到15毫米。阵列光传感器210可以是能够单独地读取来自各种微透镜205A的光的强度的任何适当种类的光传感器。例如，阵列光传感器210可以为电荷耦合器件(CCD)传感器。在(XD传感器中,光敏位点(photosensitive site)的阵列被制造在半导体衬底上。这些位点具有如下特性电子以与落在位点上的光的强度成比例的速度累积在该位点中。为了取得图像，位点被明亮化且曝光了特定的曝光时间。在曝光时间过去之后，来自光敏位点的电子被转移到CCD存储寄存器中。于是，每个寄存器中的电子的数量大致上与在曝光期间落在对应光敏位点上的光量成比例。来自存储位点的电荷被转移出装置，并且通常各自转换为电压，例如使用模数转换器又将电压转换为数值。最终所得到的数值的阵列可以称为数字图像。在细胞计量系统200的情况下，数字图像表示在曝光时间内落在阵列光传感器210上的光的图案。也可以在本发明的实施例中使用其他种类的阵列光传感器，尤其是最近被开发用于高敏应用的传感器。例如，阵列光传感器210可以包括互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)传感器、雪崩光电二极管(APD)传感器、光电倍增管(PMT)、或者APD或PMT的阵列。也可以使用多个传感器。例如，每个微透镜205A可以使用一个离散传感器。如果存在滤波器211，则滤波器211可以例如为通过选择性地涂覆透明衬底而形成的二向色滤光器，以使得仅特定的一个或多个波长带的光容易地通过滤波器211，而其他波长的光基本上被滤波器211阻挡。在使用细胞计量系统200来测量从细胞101通过荧光发出的光时，滤波器211尤其有用。滤波器211可以被配置为基本上阻挡光束204中所包含的波长的光，而使细胞101中的荧光团发出荧光的波长带的光基本上通过。由于微透镜205A的间距可与细胞101的大小相比较，所以聚焦元件205可以相对于细胞101与感测位置207之间的运动而歪斜，以确保细胞101在经过感测位置207时被聚焦照射点206很好地覆盖。图4示出了如从图2中所示的Z方向看到的、阵列光传感器210的表面的示意顶视图，其中细胞101和聚焦照射点206重叠以示出使聚焦照射点206的阵列相对于流道201歪斜的效果。如可以在图4的示例中看到的，即使聚焦照射点206相对于彼此间隔相对宽(对应于微透镜205A的间距)，细胞101也将在穿过流道201时遇到九个不同的聚焦照射点。这九个点将描绘跨越细胞101的间隔较近的路径A-I，使得细胞101在其穿过期间被很好地覆盖。为了构建细胞101的数字图像，系统200取得落在阵列光传感器210上的光的一系列时序读数。阵列光传感器210上与各个聚焦照射点206对应的位置被识别并被单独地跟踪。图5A示出了在细胞101穿过流道201时在与路径A-I对应的传感器位置处的光读数会如何根据时间改变。如可以看到的，细胞101首先沿着路径G遭遇照射，并且逐渐地在后续时间沿着其他路径遭遇照射，其中，路径F为接收光的最后路径。由于已知系统几何结构和细胞101的行进速度，并且已知取得读数的频率，因此沿着路径A-G所取得的光强度轨迹可以被空间校准以形成细胞101的数字图像。图5B中示出了空间校准轨迹。然后，可以将空间校准数据组合成细胞101的数字图像，如图6所示，其中，较高的光强度相比于较低的光强度以较浅的灰色阴影来示出。当然，根据其他实施例的细胞仪可以使用不同数量的聚焦照射点206，并且可以产生分辨率比图6所示的分辨率更高的图像。 在该示例中，从细胞101上的特定位置通过荧光发出的较多的光产生较高光强度信号，从而细胞的带有较多荧光团的部分在图6中被示为较浅。如果期望，该关系可以反转，使得细胞101的发出较多光的部分在最终所得到的数字图像中被示为较深。如果系统200用于以包含在光束204中的光波长直接成像(没有利用荧光)，那么细胞101可以被认为将阴影投影在阵列光传感器210上，从而细胞101的较密集部分会产生到达阵列光传感器210的较少光。在一些实施例中，微装配成像细胞仪可以包括在阵列光传感器210附近的光学元件，该光学元件将系统配置为基本上共焦。图7示出了根据本发明的实施例的微装配共焦成像流式细胞仪700。系统700的几个部件与上面讨论的系统200的几个部件相似，并且被赋予与系统200中的这几个部件相同的附图标记。通过在阵列光传感器210附近添加光纤束701，系统700被配置为基本上共焦。优选地，除允许光进入的狭窄部分之外，光纤束701中的各光纤的顶端702被配置为不透光或反光。例如，光纤中的部分可以涂覆有铝或金，其被镀了 100纳米到200纳米厚。然后，光纤将允许进入的光导向阵列光传感器210。因此，光纤的端部702以类似于孔板的方式起作用，以优先允许从感测位置207发出的光进入并优先阻止从其他轴向位置发出的光进入。例如，从在感测位置207处的照射点206发出并通过透镜209成像的光跟随诸如光线锥706的光线束，并且在其到达一条光纤701的顶面时被紧密聚焦，从而通过光纤而允许进入。从在感测位置207下方的位置发出的光可以按照类似于光线锥703的光线锥发散，以被透镜209会聚成例如光线锥705的光线锥。光线锥705在其到达光纤701时未会聚成紧密点，因此，被光纤端部的不透光部分阻止大部分进入。类似地，从感测位置207上面发出的光将在其到达光纤207时会聚并且重新发散，因此，也被光纤701阻止大部分进入。因此，系统700优先使从感测位置207发出的光通过并且优先阻挡从其他轴向位置发出的一些光。图8示出了根据本发明的其他实施例的微装配共焦成像流式细胞仪800。系统800的几个部件与上面讨论的系统200的几个部件相似，并且被赋予与系统200中的这几个部件相同的附图标记。另外，另一个光学部件即孔板801被设置在阵列光传感器210的表面附近。除了孔802的阵列之外，孔板801基本上不透光。每个孔802对应于一个微透镜205A，并且被校准以允许从对应的聚焦照射点206发出的光通过。光学元件801将系统800配置为基本上共焦。也就是说，孔802具有阻挡来自轴向位置的光而不是感测位置中的光的效果。例如，光线束803从正好在感测位置207下方的位置804发出。最终所得到的光被聚光透镜209重新聚焦成另一个光线束805，该光线束805比源自感测位置207的光线锥806更慢地会聚。因此，光线束805被一个孔802部分地阻挡，由阴影区域807来表示。由于系统800优先使从感测位置207发出的光通过并且优先阻挡从其他轴向位置发出的一些光，所以该系统可以相比于未被配置为基本上共焦的系统产生更高对比度或分辨率的图像。理想地，孔板801放置在透镜209的焦点位置处，以使得孔802能够非常小并且有效地区分从感测位置207发出的光和从轴向位置而不是感测位置207处发出的光。于是，源自一个聚焦照射点206的每个射线束在其到达阵列光传感器210时可以略微发散，并且处理单元可以通过对来自阵列光传感器210的几个像素的读数进行求和来估计每个光线束的强度。
图9示出了根据其他实施例的微装配共焦成像流式细胞仪900。在该实施例中，替代微透镜的二维阵列，使用了微透镜205A的线性阵列901。优选地，微透镜阵列901相对于流道201歪斜。相应地，线性阵列光传感器902被设置，并且也优选地相对于流道201歪斜，且与微透镜阵列901校准。线性阵列光传感器902可以包括任何适当种类的传感器，包 括CXD传感器、EMCXD传感器、APD、PMT、CMOS传感器或另一种传感器。图10示出了虽然由微透镜阵列901提供的聚焦照射点206可以间隔相对宽，但是歪斜的布置确保了穿过流道201的细胞101在其穿过期间将被很好地覆盖并且相对密集地成像。系统900对细胞101的数字图像的构建与以上参照图4-6所述的构建类似。系统900还可以包括将系统900配置为基本上共焦的一个或多个光学元件，并且可以感测从细胞101通过荧光发出的光，或者可以执行直接成像。图11示出了根据其他实施例的微装配共焦成像流式细胞仪1100。尽管上述系统200从感测位置207的相对侧照射并感测细胞，但是微装配成像细胞仪1100从感测位置207的同一侧照射并感测细胞。在系统1100中，光束204被聚焦元件205聚焦为多个聚焦照射点206。聚焦元件205被示出为透镜的阵列,但是可以为任何适合的聚焦元件。波长选择反射镜1101将光重新导向流道201，以使得聚焦照射点在感测位置207处。例如，反射镜1101可以为被配置成使从光束204入射到其上的所有光基本上反射的分色镜。光208从细胞101发出，并且发出的光208中的至少一部分被聚光透镜209聚集并被重新聚焦。系统1100可以特别适合于使用通过荧光发出的光来使细胞成像，这是因为波长选择反射镜1101可以被配置为使细胞101通过荧光发射光的波长带内的所有光基本上通过。可选的附加滤波器211可以进一步调节聚焦在阵列光传感器210上的聚集光208。阵列光传感器210可以为二维阵列或线性阵列，并且可以包含任何适当种类的光传感器，包括CCD传感器、EMCXD传感器、APD、PMT、CMOS传感器或另一种传感器。系统1100可以包括将系统配置为基本上共焦的光学元件，例如具有孔802的孔板801或者光纤束。使用系统1100来构建细胞101的数字图像以与以上关于系统200描述并在图4-6中示出的方式类似的方式进行。图12示出了根据其他实施例的微装配共焦成像流式细胞仪1200。系统1200的几个部件与上述系统200中的几个部件相似，并且被赋予与系统200中的这几个部件相同的附图标记。诸如细胞101的细胞穿过被壁200限界的流道201。光源203产生光束204。光源203可以例如为激光器。聚焦元件1201接收来自光源203的光并且使该光聚焦。与系统200的聚焦元件205相比，聚焦元件1201为将来自光束204的光聚焦为多条线(诸如，在感测位置207处或附近照射细胞的照射线1202)的柱面透镜1201A的阵列或另一种光学部件。从细胞通过散射或荧光发出的光被聚光透镜209聚集并被重新聚焦在孔板1203处。孔板1203包括被校准以接收来自照射线1202的聚焦光的一系列窄缝隙1204。因此，该系统是共焦的，这是由于该系统趋于抑制从远离感测位置207的Z轴位置发出的光。通过孔板1203的光到达光传感器210。(为了清楚，已从图12中略去可选的滤波器。)光传感器210产生表示落在传感器上的光的强度的信号，并且这些信号可以被传送212至处理单元213以进行存储、分析或显示。虽然示出了系统1200产生相互足够近的照射线1201以使得几条线可以同时落在单个细胞上，但是这不是要求，实际上，优选的是聚焦元件1201产生间隔比细胞的期望大小更大的照射线。由于细胞在流道201中通常彼此间隔较宽，具有间隔较宽的照射线1202可以导致在任何一次仅从一条照射线和到达传感器210的一个细胞产生光。在该布置中， 传感器210可以被简化，并且甚至可以为测量光强度但不包括像素阵列的简单的光电二极管、光电倍增管或其他种类的传感器。图13示出了根据本发明的实施例的系统1200的正交视图。如可以看到的，缝隙1204将系统配置为共焦，例如，阻止源于偏离感测位置207的位置的光线束1302的部分1301进入。图13还示出了根据本发明的实施例的系统1200的另一方面。流道201相对于感测位置207倾斜。在图13中，该倾斜用角度Θ示出，为了清楚说明，该角度Θ与实际应用相比可能被放大。流道201相对于感测位置207的倾斜与系统1200的共焦方面结合产生以池1303为例的、落在传感器210上的光的每个长方形池，其基本上源自相对于细胞101唯一的Z轴位置。图14示出了可以由一个细胞101穿过系统1200的感测区域207而产生的一系列光强度读数。这些读数是按时序取得的，所以每个读数均表示在特定时间从细胞101发出的光的强度，其对应于细胞101的特定的X轴位置，并且也对应细胞内的特定X轴位置。例如，可以足够频繁地取得读数以使得在读数之间细胞101行进O. 25到O. 5微米。由于流道201倾斜，所以每个读数还对应于细胞内的特定的Z轴位置。图14可以表示从细胞101通过荧光发出的光的测量结果，这是因为在细胞101位于照射线之间的时间内，记录了非常低的照射水平。在图14的假设示例中，在细胞101的细胞核穿过一条照射线1201时获得最高强度读数。即使传感器210是没有像素的单个传感器，所组合的读数也能给出与细胞101的结构有关的信息，至少在X-Z横截面上。如果传感器210确实包括各像素的阵列，那么也可得到与细胞的Y方向结构有关的一些结构信息。在使用多色荧光成像的一些成像应用中，期望针对每种荧光色提供单独的检测器。虽然在系统1200中仅示出了六个柱面透镜1201A，但是本领域内的技术人员将认识到可以使用其他数量。例如，可以产生多达20到100条照射线。在一个示例性实施例中，可以使用大约40个柱面透镜，每个柱面透镜均具有大约25微米的半径(50微米的宽度)，从而感测区域207在X方向上为大约2毫米长。如果流道201具有大约50微米的高度，那么流道201相对于感测位置207的优选倾斜约为Θ =50/2000=0. 025弧度。根据流道的高度以及所使用的微透镜的数量和大小，其他适当的倾斜角是可能的。本领域内的技术人员将认识到还可以构造如下系统该系统使用类似于聚焦元件1201的聚焦元件来在感测位置207处形成照射线，并且还从同一侧照射并感测细胞，这与在图9所示的系统900中实现照射和感测的方式类似。根据本发明的其他实施例，可以使用由处理单元213执行的分析的结果来对细胞进行分选。例如，处理单元213可以分析由传感器210或902产生的信号以确定特定细胞是否为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞可以通过细胞大小、细胞核大小以及核质比的具体测量结果来表征，使用根据本发明的实施例的系统可检测以上全部。检测和分析系统可以与分选机构结合以隔离满足特定检测标准的特定细胞。图15中示出了这样的系统，使用系统1200作为示例检测装置。基于对特定细胞的分析，处理单元213能够对细胞进行归类并且将信号发送1501到分选单元1502，该分选单元1502将每个细胞导向用于收集的两个通道1503、1504之一。例如,分选单兀1502可以包括用于对各细胞的路径重导向的压电或光学力元件。 虽然本发明的实施例已被示为扫描被限制在线性管中的细胞，但是本领域内的技术人员将认识到，本发明的实施例可以用在使用各种细胞传递技术中的任一种的系统中，其中细胞传递技术包括电泳、压力驱动流、光镊、电动平移台等。细胞可以作为有效载荷用油乳剂、用电润湿致动液滴、或者通过利用磁珠标记协助的磁输送来传送。可以通过承载细胞的载片的机械移动、通过细胞仪的部件在细胞保持静止时的移动、或者通过在细胞和细胞仪部件以不同速度或在不同方向上移动时的相对运动，提供细胞与感测位置之间的相对运动。权利要求不受所使用的细胞传递方法限制。在所附权利要求中，术语“一个(a或an)”是指“一个或多个”。当介绍对步骤或元件的叙述时，术语“包括(comprise)”及其变形(诸如，“包括(comprise和comprising)”)是指添加另外的步骤或元件是可选的并且不被排除在外。为了清楚和理解的目的，现在已经详细地描述了本发明。但是，本领域的技术人员应理解，可以在所附权利要求的范围内实行一定的变化和修改。
权利要求
1.一种微装配成像细胞仪，包括 感测位置，经历与细胞的相对运动； 光源； 聚焦元件，所述聚焦元件将来自所述光源的光聚焦为在所述感测位置处的多个聚焦照射点，以使得所述细胞在穿过所述感测位置时被一个或多个所述聚焦照射点照射； 阵列光传感器；以及 聚光透镜，将从所述细胞发出的光聚集并重新聚焦到所述阵列光传感器上。
2.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，还包括流道，所述细胞通过所述流道被流动流体输送，所述流道至少部分地被壁限界，所述壁的至少一部分基本上是透明的。
3.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述相对运动至少部分地由所述细胞的移动产生。
4.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述相对运动至少部分地由所述细胞仪的一部分的移动产生。
5.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述细胞附于载片，并且所述相对运动至少部分地由所述载片的移动产生。
6.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，从所述感测位置的一侧执行对所述细胞的照射，并且从所述感测位置的同一侧执行对从所述细胞发出的光的感测。
7.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，从所述感测位置的一侧执行对所述细胞的照射，并且从所述感测位置的不同侧执行对从所述细胞发出的光的感测。
8.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述聚焦元件包括具有球面的微透镜的阵列。
9.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述聚焦元件包括具有非球面的微透镜的阵列。
10.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述聚焦元件包括至少一个衍射元件。
11.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述光源包括激光器。
12.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述阵列光传感器包括像素的阵列并产生表示落在所述像素上的光的强度和分布的信号，所述细胞仪还包括至少部分地基于所述信号来构建所述细胞的数字图像的处理单元。
13.根据权利要求12所述的微装配成像细胞仪，其中，所述处理单元部分地通过对在不同时间从所述细胞的不同部分取得的光强度读数进行空间关联来构建所述细胞的数字图像。
14.根据权利要求13所述的微装配成像细胞仪，其中，至少部分地基于所述细胞穿过所述感测位置的速度来执行对在不同时间从所述细胞的不同部分取得的光强度读数的关联。
15.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述聚焦元件包括微透镜的线性阵列。
16.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述聚焦元件包括微透镜的二维阵列。
17.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述阵列光传感器包括像素的线性阵列。
18.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述阵列光传感器包括像素的二维阵列。
19.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，还包括在所述感测位置与所述阵列光传感器之间的至少一个光学滤波器。
20.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述阵列光传感器包括选自以下组的至少一个传感器该组包括电荷耦合器件传感器、电子倍增电荷耦合器件传感器、雪崩光电二极管传感器、光电倍增管以及互补金属氧化物半导体传感器。
21.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述多个聚焦照射点形成聚焦照射点的阵列，所述阵列相对于所述细胞和所述感测位置的运动而歪斜。
22.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，还包括接近所述阵列光传感器的光学元件，所述光学元件将所述微装配成像细胞仪配置为基本上共焦。
23.根据权利要求22所述的微装配成像细胞仪，其中，所述光学元件包括微孔的阵列。
24.根据权利要求22所述的微装配成像细胞仪，其中，所述光学元件包括光纤束。
25.根据权利要求I所述的微装配成像细胞仪，其中，所述聚光透镜聚集并重新聚焦从所述细胞通过荧光发出的光。
26.一种执行细胞计量术的方法，所述方法包括 使用光源来产生光束； 将来自所述光束的光聚焦为在经历与细胞的相对运动的感测位置处的多个聚焦照射占. 将从所述细胞发出的光聚集并重新聚焦到阵列光传感器上； 从所述阵列光传感器产生表不落在所述阵列光传感器上的光的强度和分布的信号；以及 使用处理单元来至少部分地基于来自所述阵列光传感器的信号构建所述细胞的数字图像。
27.根据权利要求26所述的方法，还包括将所述信号转换为表示落在所述阵列光传感器上的光的图案的数值。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，构建所述细胞的数字图像还包括 取得落在所述阵列光传感器上的光的一系列时序读数； 对应于各个所述聚焦照射点单独地跟踪来自所述阵列光传感器的光读数；以及至少部分地基于已知的系统几何结构、所述细胞的行进速度以及取得所述光读数的频率来对单独的所述光读数进行空间校准。
29.根据权利要求26所述的方法，还包括对从所述细胞发出的光进行滤波，以选择性地阻挡由所述光源发射的波长的光并选择地使从所述细胞通过荧光发出的波长的光通过。
30.根据权利要求26所述的方法，还包括设置接近所述阵列光传感器的光学元件，所述光学元件将所述微装配成像细胞仪配置为基本上共焦。
31.一种微装配成像细胞仪，包括 感测位置，经历与细胞的相对运动；光源； 聚焦元件，所述聚焦元件将来自所述光源的光聚焦为在所述感测位置处的多条聚焦照射线，以使得所述细胞在穿过所述感测位置时被一条或多条所述聚焦照射线照射； 光传感器；以及 聚光透镜，将从所述细胞发出的光聚集并重新聚焦到阵列光传感器上。
32.根据权利要求31所述的微装配成像细胞仪，其中，所述光传感器包括像素的阵列。
33.一种微装配成像细胞仪，包括 感测位置，经历与细胞的相对运动； 光源； 聚焦元件，所述聚焦元件将来自所述光源的光聚焦为在所述感测位置处的多个聚焦照射点或线，以使得所述细胞在穿过所述感测位置时被一个或多个所述聚焦照射点或线照射； 阵列光传感器； 聚光透镜，将从所述细胞发出的光聚集并重新聚焦到所述阵列光传感器上； 处理单元，分析来自所述光传感器的信号以对细胞进行归类；以及 分选机构，将所归类的细胞导向至少两个收集通道之一。
全文摘要
微装配成像细胞仪包括经历与细胞的相对运动的感测位置。来自光源的光被聚焦元件聚焦为在感测位置处的多个聚焦照射点或线，从而在细胞穿过感测位置时照射细胞。聚光透镜聚集从细胞发出的光并将所聚集的光重新聚焦到阵列光传感器上。聚焦元件可以包括具有球面或非球面的微透镜的阵列。系统可以包括处理单元，该处理单元至少部分地基于由阵列光传感器产生的信号来构建细胞的数字图像，其中信号表示落在阵列光传感器上的光的强度和分布。该系统可以使用从细胞通过荧光发出的光来表征细胞。
文档编号G01N15/14GK102906557SQ201180013809
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者衡欣 申请人:伯乐实验室有限公司