专利名称：H9亚型禽流感病毒的快速检测方法
技术领域：
本发明公开了一种鉴定病毒，特别是鉴定禽流感H9亚型病毒的检测方法。
背景技术：
禽流感(Avian influenza, AI)是由A型流感病毒引起的家禽及野生禽 类感染或疾病的综合征，其病原禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)属 正粘病毒科，A型流感病毒属。根据AIV表面糖蛋白血凝素(HA)和神经 氨酸酶(NA)的抗原关系可分为不同的亚型，依据AIV对禽类致病性的不 同，又可将AIV分为高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Mildly pathogenic avian influenza virus, MP AIV)。
H9亚型AIV属于MPAIV，最早报道于1966年。20世纪90年代初，该 亚型病毒在野鸟和家禽中的分离率还相对较低，没有造成大面积的流行。但 自20世纪90年代后期以来，家禽(特别是鸡)的H9亚型AIV感染在亚洲 和世界其它地区频繁报道。该病不仅给养禽业造成了重大的经济损失，也给 人类公共卫生构成潜在的威胁，急需加强H9亚型禽流感防治新技术研究工 作。
在H9亚型禽流感疫情防控工作中，现场诊断主要依靠发病史、临床症 状、病理变化和流行病学调査综合判定，这给广大兽医工作人员带来了超负 荷的工作，耗时费力费钱。现场诊断工作中急需快速准确的筛检诊断方法， 以利于现场疫情的确认。因此，禽流感疫情现场快速确认，对于釆取果断有 效的扑灭和防控措施十分关键。在实验室确诊工作中，世界动物卫生组织 (OIE)规定的经典方法是病毒的分离、鉴定和血清学分型试验，这种方法 报告结果时间长，工作量大。而目前普遍采用的聚合酶链反应(PCR)技术 需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程繁琐的缺点。而荧光实
时定量聚合酶链反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问 题，并简化了操作过程，但需要更复杂的定量测定仪器，因此不适于现场快 速检测，同时由于检测成本较高，也加大了推广应用的难度。环介导等温扩 增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)技术具有特异性强、灵 敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设定4种引物， 利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。另外，由于实行的是等温扩增， 反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且是操作方法更简单， 适于现场快速检测。但目前还未见有应用LAMP检测H9亚型禽流感病毒的 方法。

发明内容
本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否为H9亚型禽流 感病毒的快速检测方法。
本发明采用Trizol kit提取样本基因RNA，然后进行RT-LAMP扩增病毒 基质蛋白基因的特定区域，最后加入显色液鉴定，如果颜色变为绿色，则待 检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，则待检样品不是H9N2 亚型禽流感病毒。
其中，
采 用 上 游 内 引 物 (FIP ) 为 GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGCAGTTACTCAACTGGTGCGC ;
下游 内 引 物 ( BIP ) 为
TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTCGCCATCTGTCTGTGAGA; 上游外引物(F3)为ACATTCCATGGAGCAAAGGA; 下游外引物(B3)为TGCCTGATTAGTGGGTTGGT。
在现有的关于LAMP技术的公开文献中，没有将LAMP用于H9亚型禽 流感病毒检测的报道。本发明通过使用特异性引物，利用LAMP技术扩增耙 基因的特定区域，从分子水平对H9亚型禽流感病毒进行快速检测。本发明
较经典方法的病毒分离、鉴定和血清学分型试验方法以及目前普遍采用的 PCR方法快速、准确。
具体实施例方式
一、 引物的设计
根据GenBank库中已发表的H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序 列设计特异性引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
上 游 内 引 物( FIP ) 为
GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGCAGTTACTCAACTGGTGCGC
下游 内 引 物 ( BIP ) 为
TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTCGCCATCTGTCTGTGAGA 上游外引物(F3)为ACATTCCATGGAGCAAAGGA 下游外引物(B3)为TGCCTGATTAGTGGGTTGGT
二、 RT-LAMP:
1) 病毒的扩增将禽流感病毒接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中，36-72 小时后收集死亡鸡胚的尿囊液，并检测其血凝价；为了能够定量该体系的灵 敏度，还测定该尿囊液的SPF鸡胚半数致死量(ELD5。=1(T85)。
2) 病毒RNA的提取按照Trizol kit说明书提取禽流感病毒的RNA(注 在RNA沉淀时要加入糖元8-10ug，它能够和RNA共沉淀，用DEPC处理 的水进行溶解)。
具体步骤如下
① 在200 u L被检测液中加入lmLTrizol液后，剧烈摇匀，室温放置5-10 分钟；
② 加入200"L氯仿，剧烈摇匀，室温放置3-5分钟；
③ 12， OOOxg离心15分钟；
吸取上清，加入糖元8-10 u g混匀2分钟后加入异丙醇500li L，混 匀，室温放置10分钟；
12， 000xg离心10分钟，去上清，可见沉淀，用75%乙醇洗涤，缓
慢混匀后静置2分钟；
◎ 7， 500xg离心5分钟，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5分钟后 加入8pL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解。 3) RT-LAMP:
(禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶Catalog存M5101 from promega; Bst DNA 聚合酶(大片段)Catalog#M0275S from New England)
腦A2.0|iL
AMV反转录酶(8U/|iL)l.O(iL
核酸酶抑制剂(40U/iiL)0,25|iL
BstDNA聚合酶(8U/pL)l攀
Bst DNA聚合酶缓冲液2早
甜菜碱(5mol/L)5.0fiL
硫酸镁(100mmol/L)1.5|aL
dNTP (lOmmol/L)l早
上游内引物(FIP) (20|amol/L)2.0)iL
下游内引物(BIP) (20|imol/L)2.0|_iL
上游外引物(F3) (10拜ol/L)0.5pL
下游外引物(B3) (10—/L)0.5
DEPC处理水5.25(iL
总体积25|iL
然后65'C水浴90分钟，同时以DEPC处理水为阴性对照。
三、RT-LAMP扩增产物的鉴定
在反应管中加入14 10% SYBR Greenl显色液(lOOOOx)(荧光染料 SYBR Green I Catalog# S7563 from Invitrogen)(用电泳缓冲液将10000x的荧 光染料SYBR Green I稀释IOOO倍，即为10% SYBR Green I显色液)，混匀， 直接肉眼观察颜色变化，如果颜色变为绿色，说明待检样品为H9N2亚型禽 流感病毒，如果颜色为黄色，说明待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。 <110〉扬州大学
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<160>4
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据119亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计 <400>1
ggtcaccgtt cccattcggt tgcagttact c犯ctggtgc gc
<210>2 <211>41 <212>DNA <213>人工序列
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<223>根据119亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计 <400>2
tggctcttgg cctagtatgt gctcgccatc tgtctgtgag a
<210>3 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉根据H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计 <400>3
acattccatg gagc3肌gga
<210>4 <211>20 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<223>根据119亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计 <400>4
tgcctgatta gtgggttggt
权利要求
1、H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，其特征在于用Trizol kit提取样本基因RNA，然后进行RT-LAMP扩增病毒基质蛋白基因的特定区域，最后加入显色液鉴定，如果颜色变为绿色，则待检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，则待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。
2、 根据权利要求1所述H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，其特征在 于所述的特异性引物上 游 内 引 物 FIP 为 下 游 内 引 物 BIP 为 TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTTTTTCGCCATCTGTCTGTGAGA 上游外弓I物F3为ACATTCCATGGAGCAAAGGA 下游外弓I物B3为TGCCTGATTAGTGGGTTGGT 。
全文摘要
H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，公开了一种鉴定病毒，特别是鉴定禽流感H9亚型病毒的检测方法。采用Trizol kit提取样本基因RNA，然后进行RT-LAMP扩增病毒基质蛋白基因的特定区域，最后加入显色液鉴定，如果颜色变为绿色，则待检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，则待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。本发明较经典方法的病毒分离、鉴定和血清学分型试验方法以及目前普遍采用的PCR方法快速、准确。
文档编号G01N21/77GK101196476SQ200710302589
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者林 孙, 磊 张, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 祥 陈 申请人:扬州大学