专利名称：：一种应用代谢组学技术定量评价药物毒性的方法
技术领域：
：本发明涉及药物毒性定量评价的新方法，具体涉及采用气相色谱方法定量检测人、动物或细胞中内源性小分子化合物、采用多变量数据处理方法计算数学模型、计算给药组与对照组相对距离作为药物毒性定量评价的方法。
背景技术：
：长期以来，在药理研究中，许多药物的毒性依靠定性而非定量、主观而非客观、粗略而非准确、片面而非全面的标准进行评价，这些方法的具体不足主要体现在1.^iMIMM^毒性评价虽然采用了一些方便、有效的评价指标，如转氨酶、白血球数目等，但还有许多毒性缺乏明确量化指标，以现有的方法难以实施精确检测和评价。例如药物对组织或器官如肝脏、肾脏的毒性、疼痛程度、过敏反应、排斥反应的强弱、致幻、眩晕等对神经系统的兴奋、抑制的程度等。2.主观件因缺乏客观定量指标,许多毒件的评价R能采取主观的、外在的、人为的观察方法进行定性评价，如组织切片、成像技术、各种电镜检查、细胞染色，或依靠经验判断或主观感觉进行分级量化，使得药物毒性评判存在很大的主观性和不确定性。3.许多指标存在一定的片面性，只是反映了个别生化功能、器官/组织的状态，缺乏整体的、系统的评价标准。如转氨酶、肌酸酐、血沉等指标。4.表面件许多指标R反映了表象(如血压、抽搐、流涎、瞳孔大小等)，没有反映机体内在本质的改变。5.Jtt^毒性评价的指标不够灵敏，往往需要大剂量、长时间给药才能观察到相关毒性指标。6.性一些评价方法对机体伤害大或费用昂贵，如活检、介入、造影、断层扫描等，缺少损伤性小、经济方便的方法。总之，现有的许多毒性评价的方法局限性较大，缺乏定量标准、缺乏客观性、全面性、针对性，不利于对药物毒性进行定量、客观和准确评价，成为严重制约药理/毒理学研究的巨大障碍。迫切需要寻找和创立新的药物毒性评价方法。机体内源性小分子物质组是生命活动的基础，机体的功能状态必然反映在体内代谢组(内源性小分子化合物总称)上。研究表明，在中毒状态下，生物体的代谢和其中很多小分子化合物水平出现明显异常。毒性越强，对生物体各项功能的影响也越大，机体的各项功能状态/体内小分子水平也越偏离正常状态，在代谢组学上的表现就是用药组远离正常组；而毒性越弱，对生物体各项功能的影响也越小，机体的各项功能状态/体内小分子水平也较少程度上偏离正常状态，在代谢组学上的表现就是用药组与正常组有少量偏离。而在毒性随时间的变化过程中，随着机体的各项功能逐渐恢复，体内小分子和代谢水平也逐渐得到恢复，在代谢组学上的表现就是逐渐靠近正常组。因此采用代谢组学方法可定量评价药物的毒性。利用合适的代谢组学检测工具，可以一次检测生物样本中数百甚至上千个分子量小于1000的各类小分子化合物。以GC/TOFMS测定为例，对很多化合物检测灵敏度高达IO-12Hiol(绝对检测限)，相对灵敏度达10-9mol/mL。这些化合物包括几乎所有氨基酸、糖醇类化合物、脂肪酸类、脂类、小分子有机酸类、核苷和嘌呤化合物、氨类化合物、神经递质等等，它们既是生命活动必需的原料，也是机体代谢产物/中间体，还是机体生长、发育、生物信号传导和代谢循环的重要物质基础。与生命活动中起着极为重要作用的糖代谢、脂代谢、三羧酸循环、尿素循环、氨基酸循环等密切相关。因此，检测的体内小分子的变化既可以系统综合地体现药物毒性作用的结果，还可以根据给药前后样品移动距离定量评价药物毒性。迄今为止，还没有利用代谢组学数据建立数学模型、计算给药组与对照组相对距离对药物毒性进行定量评价的报道
发明内容本发明所要解决的技术问题是利用代谢组学方法，全面、定量测定生物样本中内源性小分子，得到的数据采用多变量数据处理方法建立数学模型，计算给药组与对照组的相对距离，以此定量数值作为药物毒性评价的指标，解决药物毒性缺乏准确定量评价方法的问题。为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，步骤包括样品采集和处理采集临床病人、模型动物、组织/细胞的各类生物样本，通常为血液、尿、体外培养的细胞或培养液；样品经过有机溶剂进行液_液提取，有机溶剂包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈；或经过蛋白沉淀，蛋白沉淀的方法包括加入有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)、各种酸碱盐沉淀、加热沉淀、过滤/超滤、固相萃取等方法单独或者综合的方式进行处理；样品可不进行干燥，或先干燥再利用各类含有机溶剂和水相(单独或者综合，含盐或者不含盐)的溶媒溶解；样品不进行衍生化或者利用试剂进行衍生化处理。样品分析和数据处理采用基于质谱测定与色谱联用的技术方法或核磁共振技术的测定方法对上述样品进行检测，这些方法可以是液相色谱_质谱、气相色谱_质谱、毛细管电泳色谱_质谱、核磁共振等；经过数据处理后得到色谱图中各个峰的定量数据，这个数据可以是峰面积或峰高，或由峰面积或峰高计算得到的定量数据。本发明的一个突出优点是上述检测方法能检测体内大量小分子化合物，并以此为基础全面评价药物作用效果/或机体的健康状态。当药物毒性作用强时，整个代谢谱偏离正常较大，而药物毒性较弱时，整个代谢谱偏离正常较小。图1给出了正常SD大鼠和给予雷公藤内酯醇后GC/T0F-MS测定血清样本的总离子流色谱图，从色谱图中可以发现给药后样品与对照组有明显差异。但这种目测观察的方法只能作一个粗略、主观的判断，无法实现定量评价。数学模型建立和相对距离值的计算上述数据采用各种多变量数据处理软件，可以为SPSS、Matlab,SIMCA-P等，选择偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法(0PLS)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)、主成分分析(PCA)、非线性映射(Nonlinemapping,NLM)、聚类分析(HCA)等方法建立数学模型，获取模型参数和样品在多维数学模型中的空间坐标；计算给药组样品与对照组相对距离。这里的多维空间可以是1、2、3维，也可以是4、5、6甚至更多维空间。上述对照组可以是给药前自身对照，也可以是未给药的模型组平行对照，还可以是未给药的正常组对照。上述空间相对距离可以先取各组样品的坐标平均值，再计算得到，也可以先计算各个样品之间距离，再取平均值得到。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法_判别分析(PLS-DA)等投影分析的方法的突出优点是能方便、直观地观察各个样品在多维空间模型中的相对位置，图2显示高剂量雷公藤内酯醇(2.4mg/kg)给药引起SD大鼠代谢谱出现明显异常，特别是给药后1、3天，至第5、7天有恢复趋势；而低剂量雷公藤内酯醇(0.6mg/kg)给药引起SD大鼠代谢谱在第一天出现异常，随后(3、5、7天)较快趋向正常，体现出明显的剂量和时间相关性。与上述总离子流图一样，这样目视观察的方法虽然被大量用于毒性的定性评判，但其主要问题是无法量化，且结果判断带有主观性。本发明的有益效果机体内源性小分子物质组是生命活动的基础，机体的功能状态必然反映在体内代谢组(内源性小分子化合物总称)上。研究表明，在中毒状态下，生物体的代谢和其中很多小分子化合物水平出现明显异常。毒性越强，用药组偏离正常组越大；而毒性越弱，偏离正常组越小。因此采用代谢组学方法可定量评价药物的毒性。1.利用代谢组学研究结果可以定量反映了药物毒性，增强了客观性和准确性，避免了一些药物毒性指标只凭人为、主观、和定性评价的问题。2.利用代谢组学研究结果可以全面综合地反映药物毒性，避免了一些药物毒性指标只反映局部药物毒性的问题。3.代谢组学的量化指标适用面广，可适用于各类毒性的定量评价。4.代谢组学的药物毒性评价方法采用血浆、尿等样本，成本低、对机体伤害小。5.代谢组学的评价方法较常规方法更灵敏，可以节省药物用量、减少对动物的伤害和死亡数，有利于降低研究成本和保护动物。图1GC/T0F-MS测定正常SD大鼠和给予雷公藤内酯醇后大鼠血清样本的总离子流色谱图。可以看出给药后SD大鼠血清总离子流色谱图出现明显变化。A正常SD大鼠血清总离子流色谱图；B给药大鼠血清总离子流色谱图。从色谱图中可以发现给药后样品与对照组有明显差异。但这种目测观察的方法只能作一个粗略、主观的判断，无法实现定量评价。图中标注色谱峰1-31为色谱图中鉴定的部分化合物，具体为1，乳酸；2，丙氨酸；3，3_羟基丁酸；4，尿素；5，缬氨酸；6，磷酸；7，亮氨酸；8，甘氨酸；9，丝氨酸；10，苏氨酸；11，氨基丙二酸；12，焦谷氨酸；13，半胱氨酸；14，鸟氨酸；15，谷氨酸；16，苯丙氨酸；17，甲基肉蔻酸；18，谷氨酰胺；19，[13C2]-肉蔻酸(内标)；20，柠檬酸；21，葡萄糖；22，棕榈酸；23，尿酸；24，肌醇；25，亚油酸；26，油酸；27，色氨酸；28，硬脂酸；29,6-磷酸葡萄糖；30,1-磷酸肌醇；31，胆固醇.图2雷公藤内酯醇给药后引起SD大鼠代谢谱出现不同程度的变化。高剂量雷公藤内酯醇(2.4mg/kg)给药引起SD大鼠代谢谱出现明显异常，特别是给药后1、3天，至第5、7天有恢复趋势；低剂量雷公藤内酯醇(0.6mg/kg)给药引起SD大鼠代谢谱在第一天出现异常，随后(3、5、7天)较快趋向正常。与上述总离子流图一样，这样目视观察的方法虽然被大量用于毒性的定性评判，但其主要问题是无法量化，且结果判断带有主观性。L低剂量；H:高剂量；0、1、3、5、7给药前或给药后1、3、5、7天。具体实施例方式本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。实施实例雷公藤内酯醇对SD大鼠毒性作用的代谢组学研究1.实验方案、样品采集8周龄SpragueDawley(SD)大鼠适应性饲养两周，分组后分别按高、低(2.4和0.6mg/kg)剂量单次灌胃给药，采集给药前(0天)、给药后1、3、5、7天的血液(采血前大鼠禁食12小时)，血液在37°C水浴静置lh，3500rpm离心后收集上层血清，_80°C保存。同时采集肝、肾组织并切片，一部分用于代谢组学的测定；另一部分血清和组织切片用于临床生化及组织病理学检查。结果高剂量雷公藤内酯醇给药后肝脏组织切片可见肝细胞核固缩、嗜酸性染色增强，临床生化检查发现谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高、白细胞数增加，提示明显毒性；而低剂量雷公藤内酯醇未见明显毒性，表1。2.样品处理冷冻血清在37°C水浴解冻20min，涡旋振荡后，取50μ1加入200μ1含有稳定同位素13C的内标肉寇酸的甲醇溶液(12.5μg/ml)，涡旋振荡3min，4°C冰箱静置1小时，19600g和4°C离心lOmin，取100μ1上清液于GC小瓶中，减压挥干。向GC小瓶中加入30μ1甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，涡旋振荡3min，室温下静置16h进行肟化。加入30μ1三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA(含1%TMCS作为催化剂)，涡旋振荡lmin，室温静置Ih进行衍生化反应，最后再加入30μ1外标甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30μg/ml)，混合后进行GC-T0F/MS检测。3.GC/T0F-MS测定仪器气相色谱-飞行时间质谱(GC/T0F-MS)检测系统(GC=Angilent6890N气相色谱仪，配备Angilent7683B自动进样器和G2614A型100位样品进样盘；TOF-MS=PegasusIII，Leco,USA)。色谱条件色谱柱是DB-5石英毛细管柱(IOmXO.18mmi.d.，J&ffScientific,USA)，进样量1μ1，采用不分流进样模式；载气氦气；恒流速度lml/min；程序升温模式70°C保持2.Omin，然后以35°C/min线性勻速线性升温至305°C，保持2.Omin。质谱条件进样口温度250°C；清洗时间和流速lmin，20ml/min；传输管温度2500C；离子源温度200°C；离子源电压和电流_70eV，3.OmA；MS采用全扫描方式进行数据采集，MS采用全扫描方式进行数据采集；扫描范围m/z50-800；扫描速度20Spectra/S；检测电压为-1690v。测定结果在上述检测条件下可获得样品的GC/T0F-MS总离子流色谱图(图1)。利用仪器自带的软件(ChromaTOF2.00)可提取各个测定样品色谱图中每个色谱峰峰面积，组成一个由峰面积组成的数据矩阵，该数据矩阵包括高剂量雷公藤内酯醇给药组(1、3、5、7天)和低剂量雷公藤内酯醇给药组(1、3、5、7天)及给药前组共60个样品(为第一列)和195个色谱峰(为第一行)，保存在excel文件中。4.数学模型建立和相对距离值的计算将上述数据调入多元数据分析软件SIMCAP-IKUmetricsAB，Umea,瑞典)中，利用数据内在关系投影-偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)计算数学模型，确定模型的主成分数目为2，该数学模型即为一个2维空间模型，每个样品都是此空间中的一个点，其位置由χ和y坐标参数所决定。由上述模型可以得到各个样品在此模型的平面坐标中的分布图，图2。提取每个样品在模型中的空间坐标参数，按照下列公式(1)计算每组样品横坐标(χ)和综坐标(y)的平均值；按公式(2)计算每个/组样品给药前后变化距离，该距离值即表示了雷公藤内酯醇对大鼠体内代谢组的影响程度，即毒性强弱。公式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>Xi,Yi分别为给药组第i天横坐标和纵坐标平均值。其中Xil6为16号样品横坐标值；Yil6为16号样品纵坐标值。公式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>Si为给药后i天与给药前距离；\、Y0分别为给药前X、Y坐标值。按照上述公式可以分别计算出给药前后样品距离和组间距离，结果见表2。由表2结果可以看出，高剂量组1天、3天距离值最大，说明毒性最明显，至5、7天逐渐减弱，并靠近给药前组；而低剂量组只是在给药后1天出现较大偏离，其后迅速靠近对照组。从上述结果还可以看出毒性的剂量和时间依赖性。由于常规毒性指标没有发现低剂量下出现异常变化，而代谢组学的相对距离法，因此代谢组学方法和相对距离方法可能比常规方法更为灵敏，并能定量地表示药物对整个代谢组调节的强弱，即全面、定量反映药物毒性大小。表ISD大鼠给予雷公藤内酯醇前后生化检查结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*P<0.05,**P<0.01,***P<0.OOlvs给药前对照.ALT，谷丙转氨酶；AST，谷草转氨酶；NE，中性白细胞；WBC，白细胞.表2各组样品在数学模型中的平均坐标和雷公藤内酯醇给药后与对照组的相对距离<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一种应用代谢组学技术进行毒性定量评价的方法所依赖的是仪器测定所得到的代谢组学数据，其特征包括以下几个方面a)采用血清作为样本进行检测；b)采用甲醇沉淀蛋白的方法对血清中小分子进行提取；c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法对样本进行衍生化；d)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)进行样本分析；e)应用SIMCAP-11软件和偏最小二乘一判别分析(PLS-DA)建立数学模型；f)从多维空间数学模型中提取参数，计算用药组和对照组之间相对距离。2.除权利要求1中血清作为生物样本外，生物样本还可来源于人、动物、细胞、菌类、组织切片等，具体包括全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、泪液、汗液、组织勻浆、细胞或细胞培养液/基、细菌和细菌培养液/基。3.权利要求2中上述生物样本至少其中一组为用药后采集生物样本(给药组)，一组为对照组；对照组可以是给药前自身对照，也可以是未给药的模型组平行对照，还可以是未给药的正常组对照。4.除权利要求1中的动物除大鼠外，还可以为蟾蜍、青蛙、鱼、小鼠、豚鼠、狗、兔、、猴鸡、猪、羊、牛；细胞可以为各种来源的病理性、遗传改变型或正常细胞；细菌可以为各类有报导的遗传改变型、转基因型或正常细菌。5.除权利要求1中采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)进行样本分析外，还包括其它任何基于质谱测定技术、核磁共振测定技术和其它代谢组学测定技术的分析方法。6.权利要求1中所得到的数据可以是绝对定量数据，也可以半定量数据，如峰面积、峰高，或由此采用数学方法计算得到的数据。7.除权利要求1中应用SIMCAP-Il软件和偏最小二乘一判别分析(PLS-DA)建立数学模型的方法外，还包括其它代谢组学数据处理软件，如SPSS、Matlab、SIMCA-P等各类版本；包括选择除偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)外的其它方法，如正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)、主成分分析(PCA)、非线性映射(N0nlinemapping，NLM)、聚类分析(HCA)等方法建立的数学模型。8.权利要求1中的数学模型可以为任意维空间模型，这里的多维空间可以是1、2、3维，也可以是4、5、6甚至更多维空间。9.权利要求1中用药组和对照组之间相对距离可以有两种计算方式，先取各组样品的坐标平均值，再计算得到；在有自身对照样品时，也可先计算每个样品给药前后变化距离，再取平均值得到。10.权利要求9中药物毒性表示可以采用药组和对照组之间相对距离，也可以是相对距离的函数计算值，如常有对数值、自然对数值、平方值、平方根值等任何数学计算方式所得结果。全文摘要本发明公开了“一种应用代谢组学技术定量评价药物毒性的方法”。其特征在于利用基于质谱、核磁共振等测定技术的代谢组学方法全面、定量测定生物样本中小分子化合物，再采用多变量数据处理方法建立多维空间数学模型，计算给药组与对照组的相对距离，以此作为药物毒性评价的定量指标，解决药物毒性评价缺乏定量评价指标的难题。与常规毒性评价的方法相比，该方法适应面广、灵敏、取样简便、对机体无伤害，可更全面、综合地体现了毒性作用，可以为新药研发和药理研究中的毒性评价提供一种全面、可靠的定量评价方法。文档编号G01N30/72GK101813680SQ20101014184公开日2010年8月25日申请日期2010年4月8日优先权日2010年4月8日发明者严蓓,刘林生,张颖,曹蓓,李梦婕,查伟斌,王广基,王新文,石建,赵春艳,邵凤,郑天,阿基业,顾胜华,黄青,龚平申请人:中国药科大学