专利名称：改良的检测潜在丙型肝炎的分析方法,其用途和相应的诊断试剂盒的制作方法
改良的检测潜在丙型肝炎的分析方法，其用途和相应的诊断试剂盒发明领域本发明属于丙型肝炎病毒(HCV)的鉴别和检测技术领域。更具体而言，本发明提供了用于检测所述病毒C的一种改良的分析方法及其相应 的诊断试剂盒，其在鉴别和检测所谓的“潜在HCV感染”中特别有用，该感染不能使用当前 的标准分析方法在血清或血浆样品中检测到。现有技术状态HCV是动物病毒黄病毒科肝炎病毒属的成员。HCV基因组(下文中称为HCV-RNA) 由约9. 4千碱基(1Λ)长的正极性单链RNA分子构成。据推测，HCV复制通过与病毒基因组 RNA分子互补的负链RNA链的合成进行，所述负链RNA链随后作为合成新的基因组RNA分子 的模板。尽管肝脏是HCV感染的主要靶器官，该病毒可潜在的感染人体内任何类型的细胞、 组织或器官。当前，已具有通过检测血清或血浆样品中针对HCV抗原的抗体(下文中称为 抗-HCV)或HCV-RNA无障碍诊断患者的HCV感染的技术。然而，最近描述了一类HCV感染，其特征在于其是“血清学沉默的”，其中感染的患 者在抗-HCV或HCV-RNA商用检测试剂盒的血清或血浆检测中不产生阳性结果(下文中称 为潜在的感染)。此类患者的通常情况是肝功能检测中长时间的异常结果，即异常高水平的肝酶。 在这些患者中评价了所有或大部分的已知肝病原因，基于分析、临床或流行病学数据，其均 被排除在外，例如，乙型肝炎病毒感染(患者对血清乙型肝炎表面抗原和HBV-DNA阴性)、 HCV (患者对血清抗-HCV和HCV-RNA阴性)、慢性自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、吉尔伯特氏 综合征、胆汁性肝硬化，以及伴随肝损伤的风险因素，如饮酒、吸毒、服药、输液、文身、体穿 孔、胡乱性行为等的自身免疫、代谢和遗传病症。我们因此研究了当前分析方法不能解释的肝功能改变的人群，其原因可能是某种 形式的丙型肝炎病毒的潜在感染。由于该感染不能通过当前方法快速、有效和安全的诊断， 此类感染具有两个非常重要的后果-首先，从患者自身的角度，这些患者与可以使用当前的分析方法在血清或血浆中 检测疾病的患者相比总体而言是不利的，因为对于后者专科医生可研究其具体症状并向其 提供最合适的治疗。-其次，从携带者和专科医生均缺乏所述疾病知识导致所述疾病的流行和传播 的角度。因此，感染所述潜在形式的丙型肝炎病毒的患者在其外周血的单核细胞中携带 HCV-RNA，而非血清中，这是血液和器官捐献、血液透析等要考虑的问题，因为他们可能在不 怀疑该因素的情况下被感染。另一方面，疾病知识将使专科医生能告知患者基础的安全措 施，以防止其日常生活中的不期望感染。在该技术领域内，由于结果的可靠性，研究人员使用免疫测定作为常规的实验室 检验。酶联免疫测定(EIA)是尤其通常使用的检验，因为它是一种简单、重现性的客观方法，能在短时间内处理大量的体液样品，利于在不太复杂的实验室进行。当前已有用于检测血液中抗-HCV的商用免疫测定。这些EIA检测针对HCV的结 构(核心和外壳)和非结构(NS)蛋白的抗体。另一方面，商用EIA检测血液中抗-HCV的 灵敏度根据固相上涂覆的是哪种HCV抗原，它们是单独的或融合的蛋白或肽片段而不同。检测人血清或血浆中抗-HCV的商用EIA包括下列活性成分-涂覆HCV抗原混合物的固相(例如微量培养板孔)核心和/或E2/NS1和/或 NS3和/或NS4和/或NS5。大多数市面上的EIA包括至少一种NS3和NS4核心抗原。-反应的阴性和阳性对照，-样品稀释剂，-洗涤溶液，-缀合物稀释剂，-缀合物，-底物缓冲液和/或底物溶液，-终止溶液。用于检测抗-HCV的商用EIA方法作用的技术领域是“经典”的HCV感染。这些EIA 称为EIA筛选，被用于筛选可能与HCV接触的个体群体样品，其在经典HCV感染的患者中显 示行之有效的或99%或以上的特异性和接近于100%的分析灵敏度。商用EIA方法的特异性在免疫活性群体受试者中下降，例如志愿献血者、保健专 业人员、监狱职工或军事人员。类似的，其灵敏度在免疫受损的个体中较低[信息来自亚 特兰大疾病预防和控制中心，USA，根据其出版物发病率和死亡率每周报道2003 ；52 (No. RR-3) :1-13]。尽管免疫测定技术已经具有非常完善的方案，任何本领域的专家都应当了解，各 种特异性抗原或抗体的特异性测定需要一定的研究工作，以找到适合每种情况的工作条件 和试剂。我们提供了一系列的使用EIA方法测定抗-HCV的出版物作为之前的参考文献。(I)Kuo G，等· Science 1989 ；244 :362-364.(2) Alter HJ，等· Lancet 1989 ；2 :1006-1008.(3) van der Poel CL，等.Vox Sang 1992 ；62 :208-212.(4) Kleinman S，等· Transfusion 1992 ；32 :805-813.(5) Okamoto H, φ . Hepatology 1992 ；15 :180-186.(6) Sailberg M，等· J Clin Microbiol 1992 ；30 :1989-1994.(7) SSllberg M，等.Immunol Lett 1992 ；33 :27-33.(8) Bresters D，等· J Med Virol 1992 ；37 :187-191.(9) Sato A，等· J Med Virol 1994 ；44 :88-91.(10) SSllberg M，等.J Med Virol 1994 ；43 :62-68.(Il)Mondelli MU，等.J Clin Microbiol 1994 ；32 :2523-2527.(12) Chen M,等· Gastroenterology 1999 ； 116 135—143.(13) Toyoda H，等.Am J Gastroenterol 1999 ；94 :2230-2236.(14)Laperche S，等.J Clin Microbiol 2005；43 :3877-383.(15)Netski DM，等.Clin Infect Dis 2005 ；41 :667-675.
(16)Muerhoff AS，等· J Med Virol 2008 ；80 :411-418.具体而言，该列表的出版物(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)和(16)涉及经典HCV感 染的不同临床情况下核心抗原在抗-HCV测定中的应用。在这些出版物中可以发现，不同大 小的核心蛋白或肽被用于检测抗核心HCV抗体。作为一个实例，参考文献(5)描述了允许使用EIA检测抗HCV的合成的核心肽 (5-23)的用途。出版物(6)和(7)和其他相关的出版物对HCV核心蛋白的抗原区域(包括氨基酸 1到190)进行了分析，以使用在“经典”的HCV感染中允许表征免疫应答的合成肽鉴定免疫 显性区。具体而言1)鉴定了包含核心蛋白氨基端的1-17个氨基酸的肽；幻定位了氨基酸 序列9-16中的主要抗原区域；3)在83%的具有使用商用EIA试剂盒可检测的抗-HCV的患 者血清中使用核心肽通过EIA检测到抗-HCV IgG抗体。另一方面，参考文献(16)和其他相关出版物描述了基因型Ia的合成核心蛋白肽 和HCV抗原在检测抗-HCV中的用途。使用具有氨基酸序列1-18、10-24、11-28、1-30、10-43 等的HCV核心肽产生了不同的EIA抗-HCV检测百分比。作为一个实例，在HCV基因型1经 典感染的患者血清中(商用EIA阳性抗HCV结果)，各种肽的抗-HCV检测的百分比为核心 1-18为78% ；核心IO-M为89% ；核心1H8为85% ；核心1-30为93% ；核心10-43为 100%。该出版物未提供在对商用EIA抗-HCV阴性的受试者中抗-核心抗体检测的数据。提出本发明的研究小组在近年来已使用免疫测定法测定血液(血清或血浆)和人 细胞培养物上清液中的HCV。他们使用免疫测定对血清或血浆样品和细胞培养物上清液样 品中的HCV进行分析测定，其结果描述于下列参考文献中(I)Quiroga JA, ^ . Hepatology 1991 ；14 :38-43.(2) Quiroga JA，等.Clin Diag Lab Immunol 1994 ；1 :545-551.(3) Quiroga JA，等.J Infect Dis 1996 ； 173 :300-305.(4) Mart in J，等· Cytokine 1998 ；10 :635-644.(5)Quiroga JA，等· J Clin Microbiol 2006 ；44 :4559-4560.尽管商用EIA可检测“经典” HCV感染的抗-HCV，它们对于“潜在”的疾病种类无 能为力(即其产生阴性的结果)。商用EIA在检测痕量抗-HCV方面不够灵敏。它们不能正 确工作的原因在于涂覆固相的抗原混合物可能干扰和防止痕量抗-HCV的检测。为解决这些问题，我们尝试了某些修饰或备选的应用。因此，我们使用MONOLISA HCVAg-Ab ULTRA 分析(Bio-RadLaboratories， Marnes-la-Coquette, France)测定了诊断为潜在HCV感染的患者血清样品中抗-HCV的 存在(商用 EIA 为阴性抗-HCV 结果=Ortho HCV 3. OELISA, Ortho 诊断系统，Raritan, NJ, USA ；禾口 INN0TEST HCV Ab IV，Innogeneticsjante，比利时)。MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA分析仅能在1名HCV潜在感染的患者血清中检测到抗-VHC的存在[Quiroga JA，等.J Clin Microbiol2006 ；44 :4559-4560]。该数据显示该抗-HCV检测的备选不起作用。由上文可知，需要快速、安全和有效的方法以测定疑似感染受试者中潜在HCV感 染的存在。用于鉴定潜在HCV感染的金标准方法是从肝脏组织的活组织检查检测HCV-RNA。在这方面，西班牙专利号200303050描述了检测肝脏组织中HCV-RNA的基于原位杂交的分析方法，并由此鉴定潜在的HCV感染，其不能使用标准分析方法在血清或血浆样 品中检测到。然而，活体组织检查是侵入性方法，由于患者的风险不能经常使用。因此，需要简 单和灵敏的方法以从血液样品中诊断潜在的HCV感染。研究人员加强了免疫测定方法的测定参数的搜索(例如，制备反应基质的方法， 免疫化学反应前样品的预处理，缀合物抗血清的类型和强度，免疫化学反应发生需要的时 间等等)以诊断可能的潜在HCV感染。发明描述如标题所述，本发明涉及改良的用于检测潜在丙型肝炎的分析方法，该分析方法 的应用及其相应的诊断试剂盒。具体而言，其涉及筛选免疫测定试验。上文的一个优选的实施方案是选自ELISA、 放射免疫测定或荧光、化学发光或生物发光免疫测定的免疫测定。所述用于检测潜在的丙型肝炎的筛选免疫测定使用来自外周血或器官的血清或 血浆样品，或分离细胞分泌或产生的流体，或组织或细胞分泌物，或来自器官的血液或流 体。本发明一个优选的实施方案由用于检测潜在的丙型肝炎的筛选免疫测定组成，其 使用相应于具有SEQ. ID. NO 1的序列的HCV核心蛋白肽。一个特定的实施方案除使用SEQ. ID. NO 1外还使用相应于SEQ. ID. NO 2的附加 序列。一个特定的实施方案除使用SEQ. ID. NO 1外还使用相应于SEQ. ID. NO 3的附加 序列。一个特定的实施方案除使用SEQ. ID. NO 1外还使用两种附加序列SEQ. ID. NO 2 和 SEQ. ID. NO :3ο本发明优选的免疫测定是使用下列表示的肽作为抗原的ELISA :SEQ. ID. NO :1，两 条序歹丨J SEQ. ID. NO :1 禾口 SEQ. ID. NO 2 的组合，两条序列 SEQ. ID. NO :1 禾口 SEQ. ID. NO 3 的组 合，以及三条序歹Ij SEQ. ID. NO :1、SEQ. ID. NO :2 和 SEQ. ID. NO :3 的组合。另一方面，在研究人员进行的其他分析中观察到具有除SEQ. ID. NO :1所示外的20 个氨基酸序列的核心蛋白的其他肽同样显示抗原功能性。然而，抗-HCV检测的灵敏度要低 于使用本发明优选实施方案中的15个氨基酸的肽。根据本发明的一个优选的实施方案，筛选免疫测定使用具有序列标签SEQ. ID. NO 2的肽作为抗原，通过EIA在100%的经典HCV基因型1、3和4感染患者(使用商用EIA试 验抗-HCV阳性结果)的血清中检测到抗-HCV IgG核心。该新的应用还在15%具有潜在 HCV感染的患者血清中检测到抗-HCV IgG核心。根据本发明的一个优选的实施方案，筛选免疫测定使用具有序列标签SEQ. ID. NO 3的肽作为抗原，通过EIA在75%的经典HCV基因型1、3和4感染患者(使用商用EIA试 验抗-HCV阳性结果)的血清中检测到抗-HCV IgG核心。该新的应用还在25%具有潜在 HCV感染的患者血清中检测到抗-HCV IgG核心。因此，本发明使用具有序列标签SEQ. ID. NO :1、SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3的 肽的实施方案通过EIA在100%的经典HCV基因型1、3或4感染患者(使用商用EIA试验抗-HCV阳性结果)的血清中检测到抗-HCV IgG核心。该新的应用还在50%具有潜在HCV 基因型1感染的患者(即使用商用EIA试验为阴性抗-HCV结果)血清中检测到抗-HCV IgG 核心。因此可以认为本发明的分析方法增加了现有EIA试验的灵敏度，改善了血清诊断学， 可用于追踪潜在HCV感染。本发明的另一个优选的实施方案使用具有序列标签SEQ. ID. NO 1的肽和至少另 一种具有序列标签SEQ. ID. NO :2和/或SEQ. ID. NO 3的序列的肽作为筛选免疫测定的抗原。使用具有序列标签SEQ. ID. NO=I的序列的所述更优选的实施方案通过EIA在 98%的经典HCV基因型1感染患者(使用商用EIA试验抗-HCV阳性结果)的血清中检测 到抗-HCV IgG核心。该新的应用还在40%具有潜在HCV感染的患者(即使用商用EIA试 验为阴性抗-HCV结果)血清中检测到抗-HCV IgG核心。我们因此可以认为本发明的分析 方法增加了现有EIA试验的灵敏度，改善了血清诊断学，可用于追踪潜在HCV感染。因此，在具有潜在HCV感染的潜在风险的其他人群中，在27 %的具有潜在HCV感染 的患者的亲属和35%具有经典HCV感染患者的亲属(其使用商用EIA试验具有阴性抗-HCV 结果)的血清中检测到抗-HCV IgG核心。即，与商用抗-HCV筛选方法相比，抗-HCV IgG 核心的测定使得可以确定对HCV的暴露，以及其在HCV-感染患者亲属中的传播。另一方面，尽管未描述除基因型Ib以外的潜在HCV感染基因型，本发明的方法能 够在具有经典HCV基因型1 (lb或la)感染，以及基因型1以外的基因型感染的患者血清或 血浆内检测抗-HCV IgG核心抗体。具有序列标签SEQ. ID. NO 1的序列相对于其他较长的 序列具有某些优点当缺失所述肽氨基酸序列位置4和20时，基因型2b、3、4和6的某些紧 接着前和后的可变位点也被排除在外(参见

图1)，因此SEQ. ID. NO :1在不同的HCV基因型 1到6中是保守的(参见图1中的一致线条)。当使用SEQ. ID. NO 1作为HCV试剂(如实 施例2中描述)时，抗-HCV IgG核心检测的基因型依赖性被消除(如出版物参考文献16 的作者所述，尤其是由于位置4)。另一方面，在进行的其他实验中我们观察到具有核心蛋白胺端6-10个氨基酸的 序列的较短肽显示抗原功能性。然而，抗-HCV检测的灵敏度要低于使用本发明优选实施方 案中的15个氨基酸的肽。因此本发明的另一个实施方案使用具有来自具有序列标签SEQ. ID. NO=I的肽的 NH端至少6个相关氨基酸的肽作为筛选免疫测定的抗原。根据现有技术状态中发现的选择，所述免疫测定可使用同位素或非同位素示踪剂 标记的抗血清。在后者中，本发明的一个优选的实施方案包括使用荧光基团、发色团、酶或 任何其他能产生适于免疫测定试验的缀合物的分子。一个甚至更优选的实施方案使用与辣 根过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体(抗-IgG-HRP)。本发明还有如下目的用于实施所述检测潜在的丙型肝炎的分析方法的诊断试剂 盒。具体而言，所述试剂盒包含进行筛选免疫测定的必需成分，例如反应基质、试剂、HCV、终 止剂、样品稀释剂、洗涤溶液、缀合物溶液和用于进行免疫化学反应的试剂。具体而言，可使用该试剂盒进行的筛选免疫测定选自ELISA、放射免疫测定，荧光、 化学发光或生物发光免疫测定。所述试剂盒中包含的用于检测潜在丙型肝炎的筛选免疫测定使用来自外周血或来自器官的血清或血浆样品，或分离细胞分泌或产生的流体，或组织或细胞分泌物，或来自 器官的血液或流体。该诊断试剂盒的一个优选的实施方案使用具有相应于SEQ. ID. NO 1序列的肽。一个附加的特定的实施方案除使用SEQ. ID. NO 1外还使用相应于SEQ. ID. NO 2 的附加序列。该诊断试剂盒的一个特定的附加的实施方案除使用SEQ. ID. NO 1外还使用相应 于SEQ. ID. NO 3的附加序列。该诊断试剂盒的一个附加的特定的实施方案除使用SEQ. ID. NO 1外还使用相应 于SEQ. ID. NO 2禾口 SEQ. ID. NO 3的两种附加序列。基于免疫测定的本发明的分析方法可总结于下列附图中方法图解制备试剂和反应基质 样品预处理抗原-抗体免疫化学反应洗涤反应检测 洗涤反应进行 反应测定由于本发明中的分析方法特别用于检测潜在感染的抗-HCV，必须针对该特定的情 况优化一般性方法的不同阶段以达到本发明改良的分析方法的目的。固相免疫测定的免疫化学反应基于反应基质或支持物进行反应，其可以是分成单 个样品小池或孔的微量培养板、试管、球、带或其组合，为有机材料，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯基、聚碳酸酯、纤维素等等。所述方法的靶分子是丙型肝炎病毒结构核心蛋白的特异性抗-HCV抗体。含有这 些靶分子的样品可以是血清或血浆样品。这些样品取自这样的患者，所述患者的血清或血 浆中使用现有商用方法未检测到抗-HCV或HCV-RNA抗体，但具有持续的血中肝酶异常值。
样品通常从患者提取的血液中获得。以下实施例用于诠释但不以任何方式限制本发明的方法。附图简述图1显示了 HCV核心氨基酸序列位置1到120的比对。6条主要序列的一致序 列用一致线条标出；相应于SEQ. ID. NO 1的区域为阴影，相应于序列SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3的区域为下划线。所示序列的GenBank登录号为AF009606，亚型Ia ；AF165064, 亚型 Ib ；AB047639,亚型 2a ；AY232749,亚型 2b ；D17763,亚型 3a ；Y11604,亚型 4a ；Y13184, 亚型 5a ；Y12083，亚型 6a。实施例实施例1.获取样品.血清或血浆样品通过以下方式获得使用适当的装置取IOml静脉血，将血液置于 设计为获取血清的底部为凝胶的Vacutainer 型玻璃管(Beckton-Dikinson，Plymouth, UK)中，或置于含有抗凝血剂(170IU肝素锂)的上述管中用以获取血浆。血液随后在环境温 度下(介于 20 禾口 25°C )在 1. OR Heraeus Megafuge 离心机(Heraeus，Osterode，Germany) 内于1，200xg离心20分钟。分离含有血清或血浆的上层，将约Iml加入带帽的聚苯乙烯管 中，适于使用前在-20 V下储存血清或血浆。实施例2.获取HCV试剂.在本发明的方法中使用的试剂HCV是具有序列SEQ. ID. NO 1的合成十五肽，包含 HCV核心蛋白N末端氨基酸5-19 (下文中称为核心肽5-19)。核心肽5_19由Genekript公 司合成(Scotch Plains, NJ, USA)。高效液相色谱和质谱分析表明，冻干的核心肽5_19含 有7mg纯度93. 8%的蛋白。将冻干的核心肽5-19溶于超纯H20中(Milli-Q ；Millipore, Molsheim, France)，使浓度为lmg/ml ；将其在带帽的无菌Iml聚丙烯管中分成220 μ 1等 分，储存在_20°C的温度下直至使用。实施例3.反应基质(固相)的制备.固相由下列组成平底，无菌96孔EIA聚苯乙烯微量滴定板，无盖(Costar， Cambridge,MA,USA)。为制备反应基质，将一份实施例2中所述的核心肽5_19融化至4°C。 通过混合110 μ 1重构的核心肽5-19与预冷至4°C的pH9. 6的10. 89ml 0. IM的碳酸钠缓 冲溶液，制备浓度为10 μ g/ml的试剂溶液。每孔放置100 μ 1所述10 μ g/ml核心肽5-19 溶液，在4°C下无搅拌在S-1000-2冰箱(Azkoyen, Madrid, Spain)中孵育18小时。孵育 结束时使用200 μ 1洗涤溶液清洗每孔2次，所述洗涤溶液通过在ρΗ7. 4的0. IM磷酸钠缓 冲液中加入0. 05%聚氧乙烯420)-单月桂山梨坦(Tween-20 /Sigma Chemical Co., St. Louis,MO,USA)制备。当完成最后一次洗涤后，将培养板倒置在吸水纸上除去过量的洗 涤溶液。随后加入150 μ 1阻断剂，所述阻断剂由ρΗ7. 4下的0. IM磷酸钠和磷酸钾缓冲溶 液制备，补充有 10%的胎牛血清(SeraLaboratories International Ltd. ，West Sussex, UK)。通过在56°C加热30分钟灭活，然后向其中加入0. 05% Tween-20 ,整体在37°C下， 在Heraeus 1-42培养箱中孵育60分钟。在孵育结束时将培养板倒置除去过量的阻断剂。 用200 μ 1洗涤溶液清洗每孔2次。当完成最后一次洗涤后，将培养板倒置在吸水纸上除去 过量的洗涤溶液。本阶段结束时反应基质已适于孵育样品。
实施例3的变体1.第一种选择在于使用SEQ. ID. NO :1、SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3单独制备反应 基质(本申请的实施例3)进行同时测定。使得“ 100 μ 1 10 μ g/ml的核心肽5_19溶液放置在各孔中，在4°C孵育18小时......”；或“100 μ 1 10 μ g/ml的核心肽21-40溶液放置在各孔中，在4°C孵育18小时......”；或“100 μ 1 10 μ g/ml的核心肽101-120溶液放置在各孔中，在4°C孵育18小时......”。培养板孔可仅用一种肽涂覆，或使用两种肽，每种涂覆半数孔，或使用三种肽，每种涂覆三分之一孔。方法的剩余部分相同。实施例3的变体2.第二种选择在于通过组合具有序列标签SEQ. ID. NO :1、SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO :3的肽制备反应基质(本申请的实施例3)以实施本发明。使得将ΙΟΟμΙ具有相应 于 SEQ. ID. NO :1 禾口 SEQ. ID. NO 2 的序列的两种肽的混合溶液，SEQ. ID. NO :1 禾口 SEQ. ID. NO 3的混合溶液，或SEQ. ID. NO :1、SEQ. ID. NO :2和SEQ. ID. NO :3的混合溶液置于培养板孔中， 即，例如“将100 μ ομ g/ml的核心肽5-19和10 μ g/ml的核心肽101-120溶液的混合溶 液放置在各孔中，在4°C孵育18小时......”等。方法的剩余部分相同。实施例4.样品的预处理.将血清或血浆样品从-20°C融化至环境温度(介于20和25°C )，预处理前重复旋 转试管以勻浆内含物。该预处理是本发明方法的重要阶段，也是大多数商用EIA试验方案 中未说明的步骤。其在于目的为吸附样品成分以除去可能掩盖痕量的抗-HCV的非特异性 抗原-抗体结合的孵育。将50 μ 1血清或血浆样品放置在1. 5ml聚丙烯微型管中(Sarsted， Numbrecht, Germany)力口入 450 μ 1 ρΗ7. 4 的补充有 10% 胎牛血清(Sera Laboratories International Ltd.)和 0· 05% Tween-20 (Sigma)的 0. IM 的磷酸钠和磷酸钾缓冲溶 液。混合物在 Thermomixer 5436 培养箱(Eppendorf，Hamburg, Germany)中于 37°C孵育 1 小时。实施例4-2.用于阻断的样品预处理.将血清或血浆样品从-20°C融化至环境温度(介于20和25°C )，预处理前重复旋 转试管以勻浆内含物。该样品预处理的变体阐明了本发明方法抗-HCV检测的特异性。其 在于目的为使用非特异性抗体-抗原肽结合掩盖样品中特异性抗-HCV抗体，以通过实施 例5中所述的免疫化学反应掩盖样品中特异性抗-HCV抗体并因此阻断其与HCV试剂的结 合的孵育。将50 μ 1血清或血浆样品置于1. 5ml聚丙烯微型管中(Sarsted，Numbrecht, Germany)，力口入 450 μ 1 ρΗ7· 4 的补充有 10% 胎牛血清(Sera Laboratories International Ltd.)和0. 05% Tween-20 (Sigma)的0. IM的磷酸钠和磷酸钾缓冲溶液，其不含(“非阻 断”)或含有(“阻断”)足够量(介于10和1000 μ g/ml)的实施例2中所述HCV试剂(具 有序列SEQ. ID. NO 1的合成十五肽)。在同样条件下使用另一种与SEQ. ID. NO :1所述序列 无关的HCV核心蛋白肽试剂(氨基酸21-40，具有图1中所示序列)作为对照。混合物在 Thermomixer 5436 培养箱(Eppendorf，Hamburg, Germany)中于 37°C孵育 1 小时。实施例5 抗原-抗体的免疫化学反应.将根据先前的实施例预处理的样品(100μ 1)加入到反应基质孔中；用透明层 ("Plate Sealer" ,Perkin Elmer-ffallac,Turku,Finland) S^n^Heraeus 1-42 培养箱中于37°C孵育1小时。当孵育完成后，撤去透明层，用200 μ 1洗涤溶液清洗每孔5次。当完成最后一次洗涤后，将培养板倒置在吸水纸上除去过量的洗涤溶液。实施例6.缀合抗血清的制备.本发明方法中使用的缀合抗血清是通过免疫接种分离自正常人血清的IgG 从兔中获得的多克隆抗-人免疫球蛋白G(IgG)抗血清与辣根过氧化物酶的缀合物 (抗-IgG-HRP ；DakoCytomation A/S, Glostrup, Denmark)。缀合的抗血清以 0. 05mmol/l Tris-HClU5mmol/l NaN3、浓度为lmg/mL的pH7. 2缓冲溶液中的流体形式提供。将其储存 在4°C下直到使用。为制备所述缀合的抗血清溶液，将11 μ 1抗-IgG-HRP和Ilml阻断剂溶 液(如实施例3中所述)混合，获得1 1000的用于该类型EIA优化的稀释液(Harlow D & Lane D. Antibodies :A laboratorymanual. Cold Spring Harbor Laboratory,New York ； 1988 :pp592)。向每个反应孔中加入100 μ 1缀合的抗血清溶液以检测抗原-抗体免疫化学 反应；用透明层(〃 Plate Sealer"，Perkin Elmer-Wallac)覆盖培养板，在Heraeus 1-42 培养箱中于37°C孵育1小时。当孵育完成后，撤去透明层，用200 μ 1洗涤溶液清洗每孔5 次。当完成最后一次洗涤后，将培养板倒置在吸水纸上除去过量的洗涤溶液。实施例7.用于检测反应的显饩剂.本发明的方法使用2，2'-连氮双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐作为显 色溶液(ABTS ；Pierce, Rockford，IL, USA)。ABTS是辣根过氧化物酶的显色底物，当氧化时 能产生绿色产物。ABTS以随时可用的液体溶液形式提供(不需要后续制备)，储存在4°C 下直到使用。ABTS溶液必须在使用前使至室温(介于20和25°C )。在微量培养板孔中加 入ABTS底物(100 μ 1/孔)，在黑暗中(例如整个培养板用铝箔片覆盖)用Atom85搅拌子 (Atom, Barcelona, Spain)轻柔搅拌孵育30分钟。任选的，可使用的η-十二烷基硫酸 钠作为反应终止溶液(Calbiochem-Biosciences Inc. ,La Jolla,CA,USA) (100 μ 1/well)。 在Whittaker Microplate Reader 2001 (Anthos Labtec Instruments,Salzburg,Austria) 中在405nm波长下测定反应，参考波长为620nm。绿色的强度依赖于分析样品中抗-HCV存 在的量。标准化患者中试验的实施例实施例8.具有潜在HCV感染的患者确定截止值根据实施例1中所述方法从诊断为HCV感染患者获取样品，随后分析样品，使用 ELISA根据本发明的方法检测抗-HCV的存在。为此，使用实施例2的试剂根据实施例3所 述制备反应基质。样品(本例中为血清)按实施例4中所述预处理，按实施例5进行免疫 化学反应，根据上述实施例6和7中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存在。该检测使用3 名健康人员(阴性对照)和1名商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患者(阳性对照)的 样品作为对照双重进行，所述样品按实施例1、4和5中获取和处理。测定反应时获得以下 结果-阴性对照405/620nm处的吸光度平均值为0.047,0. 055和0. 050吸收单位；3名 阴性对照405/620处的吸光度平均值为0. 051吸收单位。计算的标准偏差为0. 004。-阳性对照405/620nm处的平均值为0.789吸收单位。-阴性和阳性结果间的截止值按以下确定(试验截止值):3个阴性对照平均值加 5倍平均值标准偏差。
-本实验的截止值为在405/620nm处的0.071吸收单位。1号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型IHCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，检测到肝脏病变(具有炎症活性 的肝硬化)。-来自1号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为0.166和0.172单位；来自 1号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为0. 169单位。来自1号患者样品的平均 值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。2号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型lb HCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，检测到肝脏病变(具有2级纤 维化的门静脉周围慢性肝炎)。-来自2号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为0.102和0. 107单位；来自1 号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为0. 105单位。2号患者样品的平均值大于 试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。实施例8-2.具有潜在HCV感染的患者抗-HCV检测的特异性根据实施例1中所述方法从诊断为HCV感染患者获取样品，随后分析样品，使用 ELISA根据本发明的方法检测抗-HCV的存在。为此，使用实施例2的试剂根据实施例3所 述制备反应基质。样品(本例中为血清)按实施例4-2中所述预处理，按实施例5进行免 疫化学反应，根据上述实施例6和7中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存在。该检测使用 3名健康人员(阴性对照)和1名商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患者(阳性对照)的 样品作为对照双重进行，所述样品按实施例1、4和5中获取和处理。测定反应时获得以下 结果-阴性对照405/620nm处的吸光度平均值为0.054,0. 069和0. 063吸收单位；3名 阴性对照405/620处的吸光度平均值为0. 061吸收单位。计算的标准偏差为0. 006。-阳性对照405/620nm处的平均值为1.391吸收单位。-阴性和阳性结果间的截止值按以下计算(试验截止值):3个阴性对照平均值加 5倍平均值标准偏差。-本实验的截止值为在405/620nm处的0.091吸收单位。若阻断抗-HCV检测，反应被认为是特异性的。即，在相应于SEQ. ID. NO 1的HCV试 剂存在下通过样品预处理测定的吸光度值至少比无HCV试剂存在下进行的预处理低50%。 此外，若在实施例4-2中描述的对照试剂存在下预处理样品时不阻断抗-HCV检测；测量的 吸光度值与无HCV试剂预处理测量平均值相比下降低于10%时，反应也认为是特异性的。 抗-HCV检测阻断百分比根据下式计算% 阻断=100- IOOx(含有HCV试剂样品的吸光度)-(含有HCV试剂阴性对照的吸光度) (不含有HCV试剂样品的吸光度)-(不含有HCV试剂阴性对照的吸光 度)3号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型IHCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，检测到肝脏病变(具有炎症活性 的肝硬化)。。-经没用HCV试剂的样品预处理的来自3号患者的血清在405/620nm处的平均值 为0.125吸收单位。来自3号患者的样品的平均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结 果分析的血清含有抗-HCV抗体。-经用100μ gHCV试剂(核心肽5-19)的样品预处理的来自3号患者的血清在 405/620nm处的平均值为0. 072吸收单位。通过应用上述公式我们得到抗-HCV反应82% 的阻断，因此认为结果是未阻断的所述抗HCV反应被认为是特异性的。-经用100μ g对照HCV试剂(核心肽21-40)的样品预处理的来自3号患者的血 清在405/620nm处的平均值为0. 156吸收单位。通过应用上述公式我们得到抗-HCV反应 0%的阻断，因此认为结果是未阻断的所述抗HCV反应被认为是特异性的。4号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型lb HCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，检测到肝脏中的反应性变化(最 小病变)。-经没用HCV试剂的样品预处理的来自4号患者的血清在405/620nm处的平均值 为0. 150吸收单位。来自4号患者的样品的平均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结 果分析的血清含有抗-HCV抗体。-经用100μ g HCV试剂(核心肽5-19)的样品预处理的来自4号患者的血清在 405/620nm处的平均值为0. 060吸收单位。通过应用上述公式我们得到抗-HCV反应97% 的阻断，因此认为结果是未阻断的所述抗HCV反应被认为是特异性的。-经用100μ g对照HCV试剂(核心肽21-40)的样品预处理的来自4号患者的血 清在405/620nm处的平均值为0. 174吸收单位。通过应用上述公式我们得到抗-HCV反应 0%的阻断，因此认为结果是未阻断的所述抗HCV反应被认为是特异性的。5号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。诊断为经典的HCV感染(商用方 法在血清中可检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证实基因型lb HCV-RNA和肝脏 病变的存在(具有1级肝纤维化的慢性活动性肝炎)。-经没用HCV试剂的样品预处理的来自5号患者的血清在405/620nm处的平均值 为1.391吸收单位。来自5号患者的样品的平均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结 果分析的血清含有抗-HCV抗体。
-经用100μ gHCV试剂(核心肽5-19)的样品预处理的来自5号患者的血清在 405/620nm处的平均值为0. 146吸收单位。通过应用上述公式我们得到抗-HCV反应93% 的阻断，因此认为结果是未阻断的所述抗HCV反应被认为是特异性的。-经用100μ g对照HCV试剂(核心肽21-40)的样品预处理的来自5号患者的血 清在405/620nm处的平均值为1. 424吸收单位。通过应用上述公式我们得到抗-HCV反应 0%的阻断，因此认为结果是未阻断的所述抗HCV反应被认为是特异性的。抗-HCV滴定这可以测定要分析的样品中抗-HCV抗体的量。该测定与临床、组织病理学、病毒 学或其他特征和潜在或经典的HCV感染的进展，以及抗病毒治疗后的随访有关。根据实施 例1中所述方法从诊断为HCV感染患者获取样品，随后分析样品，使用ELISA根据本发明的 方法检测抗-HCV的存在。为此，使用实施例2的试剂根据实施例3所述制备反应基质。样 品(本例中为血清)按实施例4中所述预处理，预处理的样品稀释至1 10，以两倍系列 稀释，即1 20、1 40,1 80等；按实施例5进行免疫化学反应，根据上述实施例6和7 中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存在。该检测使用3名健康人员(阴性对照)和1名 商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患者(阳性对照)的样品作为对照双重进行，所述样品 按实施例1、4和5中获取和处理。测定反应时获得以下结果6号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型lb HCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，观察到具有肝脏最小炎症变化 的脂肪变性。当测定反应时获得下列405/620nm处吸收单位的平均结果## 1 10 1 20 1 40 1 80 1 160 1 320 1 640 1 1280 1 25601 5120阴性 c. 0. 080 0. 074 0. 066 0. 063 0. 061 0.054 0.049 0.048 0. 0470. 045截止值0. 087 0. 077 0. 068 0. 066 0. 064 0. 057 0. 050 0. 050 0. 0490. 0476 号患者 0. 396 0. 263 0. 151 0. 086 0. 069 0.056 0.046 0.040 0.0350.035结果POSPOS POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG(P0S 阳性结果；NEG 阴性结果)分析的血清含有抗-HCV抗体的浓度为1 160。7号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。诊断为经典的HCV感染(商用方 法在血清中可检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证实基因型la HCV-RNA和肝脏 病变的存在(具有间隔纤维化的门静脉周围肝炎)。当测定反应时获得下列405/620nm处 吸收单位的平均结果稀释1 10 1 20 1 4D 1 80 1 160 1 320 1 64D 1 1280 1 25601 5120阴性 c. 0.080 0.074 0.066 0.063 0.061 0. 054 0.049 0.048 0.0470.045截止值0. 087 0. 077 0. 068 0. 066 0. 064 0. 057 0. 050 0. 050 0. 0490. 0477 号患者 1.517 1.302 1.078 0.757 0.559 0.348 0.216 0.151 0. 0630. 045结果POS POS POS POS POS POS POS POS POS NEG(P0S 阳性结果；NEG 阴性结果)
分析的血清含有抗-HCV抗体的浓度为1 2560。抗-HCV同种型这可以知道要分析的样品中存在的抗-HCV抗体免疫球蛋白(IG)类型和同种型 (类型=IgA, IgG, IgM ；IgG同种型=IgGU IgG2等)。该测定与临床、组织病理学、病毒学或 其他特征和潜在或经典的HCV感染的进展，以及抗病毒治疗后的随访有关。根据实施例1中 所述方法从诊断为HCV感染患者获取样品，随后分析样品，使用ELISA根据本发明的方法检 测抗-HCV的存在。为此，使用实施例2的试剂根据实施例3所述制备反应基质。样品(本 例中为血清)按实施例4中所述预处理，按实施例5进行免疫化学反应，根据上述实施例6 和7中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存在。该检测使用3名健康人员(阴性对照)和 1名商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患者(阳性对照)的样品作为对照双重进行，所述 样品按实施例1、4和5中获取和处理。实施例6中的试剂(抗-IgG-HRP)用同种类型(例 如抗-IgM-HRP)或同种型(例如抗-IgGl-HRP)的特异性试剂替换，作为要检测的抗体。测 定反应时获得以下结果8号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型lb HCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，观察到最小肝脏病变。当测定 反应时获得下列405/620nm处吸收单位的平均结果Ig类型/同种型=IgGIgGlIgG3试剂抗-IgG-HRP抗-IgGl-HRP抗-IgG3-HRP稀释1 10001 10001 10000阴性C.0. 0650. 0340. 030截止值0. 0890. 0470. 0428号患者 0. 3250. 0690. 029结果POSPOSNEG(P0S 阳性结果；NEG 阴性结果)分析的血清含有IgG型和IgGl同种型的抗-HCV抗体。9号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。诊断为经典的HCV感染(商用方 法在血清中可检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证实基因型lb HCV-RNA和肝脏 病变的存在(具有1级肝纤维化的慢性活动性肝炎)。当测定反应时获得下列405/620nm 处吸收单位的平均结果Ig类型/同种型=IgGIgGlIgG3试剂抗-IgG-HRP抗-IgGl-HRP抗-IgG3-HRP稀释1 10001 10001 10000阴性C.0. 0550. 0340. 030截止值0. 0890. 0470. 0429号患者 2.0041. 4360. 198结果POSPOSPOS
(P0S 阳性结果；NEG 阴性结果)分析的血清含有IgG型和IgGl和IgG3同种型的抗-HCV抗体。 _9] 種· 9.脑· HCV塵白切■鹏敲ft孕血龍馳患、胃确定截止值根据实施例1中所述方法从潜在HCV感染的正接受血液透析的患者获取样品，随 后分析样品，使用ELISA根据本发明的方法检测抗-HCV的存在。为此，使用实施例2的试 剂根据实施例3所述制备反应基质。样品(本例中为血浆)按实施例4中所述预处理，按 实施例5进行免疫化学反应，根据上述实施例6和7中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存 在。该检测使用3名健康人员(阴性对照)和1名商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患 者(阳性对照)的样品作为对照双重进行，所述样品按实施例1、4和5中获取和处理。测 定反应时获得以下结果-阴性对照405/620nm处的吸光度平均值为0.057,0. 063和0. 068吸收单位；3名 阴性对照405/620处的吸光度平均值为0. 062吸收单位。计算的标准偏差为0. 0057。-阳性对照405/620nm处的平均值为0.715吸收单位。-阴性和阳性结果间的截止值按以下计算(试验截止值):3次阴性对照平均值加 5倍平均值标准偏差。-本实验的截止值为在405/620nm处的0.091吸收单位。10号患者(优先权申请中的3号患者)—名患者(男性)由于其慢性肾脏疾病接受血液透析超过12个月，他按时接受分 析控制，显示肝酶的异常值。-来自3号患者的血浆在405/620nm处的吸光度值为0.163和0. 143单位；来自 3号患者的样品在405/620nm处的吸光度平均值为0. 153单位。来自3号患者样品的平均 值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血浆含有抗-HCV抗体。11号患者(优先权申请中的4号患者)一名患者(男性)由于其慢性肾脏疾病(CKD)接受血液透析超过12个月，由于其 CKD相关的贫血而接受输血。他在实验室检查中表现出肝酶的异常值。-来自4号患者的血浆在405/620nm处的吸光度值为0.092和0. 094单位；来自 4号患者的样品在405/620nm处的吸光度平均值为0. 093单位。来自4号患者样品的平均 值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血浆含有抗-HCV抗体。实施例10 具有潜在HCV感染的潜在风险的其他人群确定截止值根据实施例1中所述方法从具有潜在HCV感染潜在风险的人群(即具有潜在HCV 感染患者的亲属)获取样品，随后分析样品，使用ELISA根据本发明的方法检测抗-HCV的 存在。为此，使用实施例2的试剂根据实施例3所述制备反应基质。样品(本例中为血清) 按实施例4中所述预处理，按实施例5进行免疫化学反应，根据上述实施例6和7中的方法 使用ELISA检测抗-HCV的存在。该检测使用3名健康人员(阴性对照)和1名商用ELISA 显示抗-HCV阳性结果的患者(阳性对照)的样品作为对照双重进行，所述样品按实施例1、 4和5中获取和处理。测定反应时获得以下结果-阴性对照405/620nm处的吸光度平均值为0.046,0. 050和0. 047吸收单位；3名阴性对照405/620处的吸光度平均值为0. 048吸收单位。计算的标准偏差为0. 0025。-阳性对照405/620nm处的平均值为1.466吸收单位。-阴性和阳性结果间的截止值按以下计算(试验截止值):3个阴性对照平均值加 5倍平均值标准偏差。-本实验的截止值为在405/620nm处的0.060吸收单位。12号患者(优先权申请中的5号患者)诊断为基因型Ib潜在HCV感染和轻微慢性小叶性肝炎的患者(男性)亲属(姐 姐)，其由于医学检查和实验室试验被纳入本研究。-来自5号患者的血清样品在405/620nm处的吸光度值为0.169和0. 173单位；5 号样品在405/620nm处的吸光度平均值为0. 171单位。来自5号患者样品的平均值大于试 验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。13号患者(优先权申请中的6号患者)诊断为基因型1潜在HCV感染患者(男性)的亲属(配偶)，其由于医学检查和实 验室试验被纳入本研究。-来自6号患者的血清样品在405/620nm处的吸光度值为0.111和0. 112单位；6 号样品在405/620nm处的吸光度平均值为0. 112单位。来自6号患者样品的平均值大于试 验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。^MM 10-2 有潜在HCV感染的潜在风险他丄群14号患者诊断为经典HCV感染(使用商用方法在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)导致的 肝硬化患者(女性)的亲属(女儿)，其由于医学检查和分析试验被纳入本研究。其肝酶值 正常，未给出关于经典HCV感染的结论性结果(未测定抗-HCV，使用商用方法在血清中未检 测到HCV-RNA)。她被诊断为抗-HCV携带者。肝脏活体组织检查显示轻微的脂肪变性和基 因型IHCV-RNA的存在，因此诊断为HCV感染。-来自14-1号患者的血清样品在405/620nm处的吸光度值为0.117和0. 117单 位；14-1号样品在405/620nm处的吸光度平均值为0. 117单位。来自14_1号患者样品的 平均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。随后的血清样品重复进行抗-HCV测定，使用商用方法给出阴性结果。-来自14-2号患者的血清样品在405/620nm处的吸光度值为0.099和0. 099单 位；14-2号样品在405/620nm处的吸光度平均值为0. 099单位。来自14_2号患者样品的 平均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。她被诊断 为具有潜在的HCV感染。实施例11.具有除1以外基因型HCV感染的患者确定截止值根据实施例1中所述方法从诊断为HCV感染的患者获取样品，随后分析样品，使用 ELISA根据本发明的方法检测抗-HCV的存在。为此，使用实施例2的试剂根据实施例3所 述制备反应基质。样品(本例中为血清)按实施例4中所述预处理，按实施例5进行免疫 化学反应，根据上述实施例6和7中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存在。该检测使用3 名健康人员(阴性对照)和1名商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患者(阳性对照)的样品作为对照双重进行，所述样品按实施例1、4和5中获取和处理。测定反应时获得以下 结果-阴性对照405/620nm处的吸光度平均值为0.070,0. 069和0. 074吸收单位；3名 阴性对照405/620处的吸光度平均值为0. 071吸收单位。计算的标准偏差为0. 004。-阳性对照405/620nm处的平均值为1.534吸收单位。-阴性和阳性结果间的截止值按以下计算(试验截止值):3个阴性对照平均值加 5倍平均值标准偏差。-本实验的截止值为在405/620nm处的0.091吸收单位。15号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。诊断为经典的HCV感染(商用方 法在血清中可检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证实基因型3a HCV-RNA和肝脏 病变的存在(无肝纤维化的慢性活动性肝炎)。-来自15号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为1.539和1. 510单位；来自 15号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为1. 525单位。来自15号患者样品的平 均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。16号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。诊断为经典的HCV感染(商用方 法在血清中可检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证实基因型4HCV-RNA和肝脏病 变的存在(具有1级肝纤维化的慢性活动性肝炎)。-来自16号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为1.046和1. 073单位；来自 16号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为1. 060单位。来自16号患者样品的平 均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。实施例12.使用含有相应于SEQ. ID. NO. :3的序列的肽作为抗原的免疫测定。确定截止值根据实施例1中所述方法从诊断为HCV感染的患者获取样品，随后分析样品，使用 ELISA根据本发明的方法检测抗-HCV的存在。为此，使用相应于SEQ. ID. NO. :3的试剂根据 实施例3所述制备反应基质。样品(本例中为血清)按实施例4中所述预处理，按实施例 5进行免疫化学反应，根据上述实施例6和7中的方法使用ELISA检测抗-HCV的存在。该 检测使用3名健康人员(阴性对照)和1名商用ELISA显示抗-HCV阳性结果的患者(阳 性对照)的样品作为对照双重进行，所述样品按实施例1、4和5中获取和处理。测定反应 时获得以下结果-阴性对照405/620nm处的吸光度平均值为0.051,0. 059和0. 058吸收单位；3名 阴性对照405/620处的吸光度平均值为0. 056吸收单位。计算的标准偏差为0. 004。-阳性对照405/620nm处的平均值为0.813吸收单位。-阴性和阳性结果间的截止值按以下计算(试验截止值):3个阴性对照平均值加 5倍平均值标准偏差。-本实验的截止值为在405/620nm处的0.076吸收单位。17号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型lb HCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，检测到肝脏中的反应性变化(最 小病变)。当使用实施例2中描述的试剂测定抗-核心HCV IgG抗体时，17号患者的血清 给出了阴性的结果。-来自17号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为0.084和0. 092单位；来自 17号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为0. 088单位。来自17号患者样品的平 均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。18号患者该患者(男性)由于肝酶异常值被纳入本研究。排除了已知的肝脏疾病原因，包 括经典的HCV感染(商用方法未在血清中检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证 实基因型lb HCV-RNA的存在，由此诊断为潜在的HCV感染，检测到肝脏病变(具有4级肝 纤维化的慢性活动性肝炎)。当使用实施例2中描述的试剂测定抗-核心HCV IgG抗体时， 18号患者的血清给出了阴性的结果。-来自18号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为0.531和0. 486单位；来自 18号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为0. 509单位。来自18号患者样品的平 均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。19号患者该患者(女性)由于肝酶异常值被纳入本研究。诊断为经典的HCV感染(商用方 法在血清中可检测到抗-HCV和HCV-RNA)。肝脏活组织检查证实基因型3a HCV-RNA和肝脏 病变的存在(具有1级肝纤维化的慢性活动性肝炎)。-来自19号患者的血清在405/620nm处的吸光度值为0.929和1. 000单位；来自 19号患者的血清在405/620nm处的吸光度平均值为0. 965单位。来自19号患者样品的平 均值大于试验截止值，因此被认为是阳性结果分析的血清含有抗-HCV抗体。
权利要求
1.用于检测潜在丙型肝炎的方法，其特征在于它包括使用SEQ.ID. NO :1表示的HCV核 心蛋白肽作为抗原进行筛选免疫测定。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述筛选免疫测定除使用SEQ.ID. NO :1表示的肽以 外还使用一种或两种由序列SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3表示的肽。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述筛选免疫测定选自ELISA、放射免疫测定、 荧光免疫测定、化学发光免疫测定和生物发光免疫测定。
4.权利要求1或2之一的方法，其特征在于所述样品是来自外周血或来自器官的血清 或血浆样品，来自分离的细胞产生或分泌的流体，或来自组织或器官的分泌物，或来自来自 器官的血液或流体。
5.前述权利要求1-4任一项的方法，其特征在于它为ELISA。
6.权利要求5的方法，其特征在于所述肽具有SEQ.ID. NO 1表示的序列。
7.权利要求1-5任一项的方法，其特征在于它是使用SEQ.ID. NO :1表示的肽作为抗原 的 ELISA。
8.权利要求1-7之一的方法，其特征在于所述筛选免疫测定使用同位素示踪剂标记的抗血清。
9.权利要求1-8之一的方法，其特征在于所述筛选免疫测定使用与非同位素示踪剂缀 合的人抗-IgG抗血清。
10.权利要求9的方法，其特征在于所述非同位素标记选自荧光基团、发色团、酶或任 何其他产生适于免疫测定的分子的分子。
11.权利要求10的方法，其特征在于所述非同位素标记物是酶辣根过氧化物酶、 抗-IgG-HRP。
12.前述权利要求1-5任一项的方法，其特征在于其为使用由SEQ.ID. NO. :1表示的肽 作为抗原的ELISA，并且因为其使用人抗-IgG抗血清和辣根过氧化物酶，抗-IgG-HRP。
13.用于检测潜在丙型肝炎感染的试剂盒，其特征在于其包含对样品进行筛选免疫测 定的必需成分，所述筛选免疫测定使用由SEQ. ID. NO. 1表示的HCV核心蛋白肽作为抗原。
14.权利要求13的试剂盒，其特征在于所述筛选免疫测定除使用SEQ.ID. NO :1表示的 肽以外还使用一种或两种由序列SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3表示的肽。
15.权利要求13或14的试剂盒，其特征在于所述样品是来自外周血或来自器官的血清 或血浆样品，来自分离的细胞产生或分泌的流体，或来自组织或器官的分泌物，或来自来自 器官的血液或流体。
16.权利要求13或14的试剂盒，其特征在于所述筛选免疫测定选自ELISA、放射免疫 测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定和生物发光免疫测定。
17.权利要求13或14任一项的方法，其特征在于其是使用具有SEQ.ID. NO 1表示的 序列的肽作为抗原的ELISA。
18.权利要求13或14之一的方法，其特征在于所述免疫测定为使用由SEQ.ID. NO. :1 表示的肽作为抗原，以及人抗-IgG抗血清和辣根过氧化物酶，抗-IgG-HRP，的ELISA。
全文摘要
本发明涉及用于检测潜在的丙型肝炎的改良的分析方法，其用途和相应的诊断试剂盒，该分析方法基于免疫测定技术，已确定了检测潜在丙型肝炎最适合的操作条件。本发明还涉及作为该方法补充的诊断试剂盒。本发明适用于药物、生物医学研究，属于分析技术领域。
文档编号G01N33/576GK102046649SQ200980113948
公开日2011年5月4日 申请日期2009年1月16日 优先权日2008年2月21日
发明者F·J·巴托洛梅内布雷达, I·卡斯蒂略阿吉拉尔, J·A·基罗加埃斯特维斯, V·卡雷尼奥加西亚 申请人:肝炎病毒研究基金会