专利名称：癌症预后分析的制作方法
癌症预后分析本发明涉及患有癌症的个体预后的方法，从而鉴定具有较大的患有未确诊的癌症风险的个体和/或鉴定处于发生癌症风险的个体。癌症通常是促炎癌症，如肺·癌、结肠直肠癌、小肠癌、食道癌或胰腺(LCBOP)癌。对于作为分析患者的各种单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathies)的途径，申请人研究游离轻链已有多年。这样的游离轻链在诊断中的应用在书籍“Serum FreeLight Chain Analysis, Fifth Edition (2008) A. R. Bradwell et al. , ISBN 0704427028，，中
有详细综述。抗体包括重链和轻链。它们通常具有双重对称性并且包含两个相同的重链和两个相同的轻链，各自包含可变区和恒定区结构域。每个轻链/重链对的可变区结构域组合形成抗原结合部位，使得两个链都有助于抗体分子的抗原结合特异性。轻链具有两种类型K和X，并且任何给定的抗体都是由任一轻链产生，但从不由两种轻链一起产生。人体中产生的K分子大约为\分子的两倍，但这在一些哺乳动物中不同。轻链通常与重链连接。然而，在个体的血清或尿中可检测到一些未连接的“游离轻链”。游离轻链可通过产生抗游离轻链表面的抗体来特异地鉴定，所述游离轻链表面通常因轻链与重链的结合而被隐藏。在游离轻链(FLC)中此表面被暴露，使得其可以通过免疫学检测。用于检测K或\游离轻链的可商购试剂盒包括例如 The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdom 生产的“Freelite ”。申请人先前已确定，确定游离k /游离\量的比例有助于患者的单克丙种球蛋白病的诊断。其已被用作辅助例如完整免疫球蛋白型多发性骨髓瘤(MM)、轻链MM、非分泌MM、AL淀粉样变性病、轻链沉淀疾病(light chain deposition disease)、潜伏性MM(smouldering MM)、浆细胞瘤和MGUS (未确定临床意义的单克隆丙种球蛋白病)的诊断。还已将FLC的检测用作例如辅助其他B-细胞恶液质(B-cell dyscrasia)的诊断,且用作通常用于诊断单克隆丙种球蛋白病的尿Bence Jones蛋白分析的可选方案。常规地，可测定入或K轻链中的一种的增加和因此的异常比例。例如，多发性骨髓瘤由恶性浆细胞的单克隆增殖导致，从而引起产生单一类型免疫球蛋白的单一类型细胞的增加。这导致在个体中所观察到的X或K游离轻链的量增加。此浓度增加可以被测定，并且通常测定游离K与游离\的比例，并与正常范围相比较。这有助于诊断单克隆疾病。此外，游离轻链分析还可以用于患者疾病的随后治疗。例如在治疗AL淀粉样变性病后，可以进行患者的预后。Katzman 等(Clin. Chem. (2002) ;48 (9) : 1437-1944)讨论了在单克隆丙种球蛋白病的诊断中游离K和游离X免疫球蛋白的血清参考区间和诊断范围。通过免疫分析研究了年龄为21-90岁的个体，并与通过免疫固定获得的结果相比较，以优化用于检测患有B-细胞恶液质的个体中单克隆游离轻链(FLC)的免疫分析。记录K和X FLC的量和K/X比例，从而允许测定用于B-细胞恶液质检测的参考区间。申请人:目前已经确定了分析FLC特别是总FLC可以用于判断患有癌症的个体预后、鉴定具有较大的患有未诊断的癌症的风险的个体和/或鉴定处于发生癌症的风险的个体的方法。他们已经发现，FLC浓度与此类癌症个体的死亡风险在统计上显著有关，并且指示存在这类癌症。来自明显健康个体的血清中的FLC的浓度，在某种程度上受个体的肾过滤和排泄FLC的能力的影响。在FLC清除受限的个体中，在血清中发现的FLC的水平增加。因此，时下认为FLC是肾功能的良好标志物。因为单体FLC K分子(25kDa)的大小，不同于二聚入分子(50kDa)，因此它们一起是比例如肌酸酐(113kDa)更好的肾小球过滤的标志物。然而，与肌酸酐相比，FLC产生是由于许多疾病的结果，因此血清FLC通常不孤立地用作肾功能标志物。然而，B细胞增殖/活性的标志物非常重要，且因为B细胞负责产生FLC，因此这在临床是有用的。FLC产生是B细胞上调的早期指标。因此，其可以补充CRP的用途，CRP是T细胞接介导的炎症应答的标志物。高FLC浓度是慢性肾病或炎性病症或B细胞恶液质的良好标志。因此，异常FLC 分析结果是普遍需要几种联合检验的多种病症的标志物。当FLC分析结果正常时，其相反一面表示良好的肾功能，没有炎性疾病状况和无B细胞恶液质证据。申请人:研究了患有各种程度肾损害患者的血清样品。通过与FLC浓度相比，研究了患者死亡的原因。未观察到癌症与肾功能的关联，但是FLC水平，特别是总FLC水平，据观察与癌症死亡风险明显相关。据观察，可能性为P〈0. 033。本发明提供判断患有癌症的个体的预后、鉴定具有较大的患有未诊断的癌症的风险的个体和/或鉴定处于较大的发生癌症的风险的个体的方法，所述方法包括检测来自所述个体的样品中游离轻链(FLC)的量，其中较高的FLC的量，与由于癌症导致的存活降低和/或个体患有未诊断的癌症的风险增加和/或发生癌症的风险增加有关。本发明的另一方面提供判断患有癌症个体的预后的方法，包括检测来自所述个体的样品中FLC的量，其中较高的FLC的量与由于癌症导致的存活降低有关。通常,个体以前并未诊断为患有癌症。癌症通常是促炎癌症，如肺癌、结肠直肠癌、小肠癌、食道癌或胰腺(LCBOP)癌。FLC可以是K或X FLC0然而，优选测量总FLC浓度，因为单独检测k FLC或\ FLC可能错失例如异常高水平的患者单克隆产生的一种或另一种FLC。总游离轻链表示样品中游离K加游离\轻链的总量。优选地，个体不必具有B细胞相关疾病的症状。所述症状可以包括复发感染、骨痛和疲劳。这类B细胞相关疾病优选不是骨髓瘤(如完整免疫球蛋白型骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤)、MGUS、AL淀粉样变性病、巨球蛋白血症(Waldenstrom’ smacroglobulinaemia)、霍奇金淋巴瘤、滤泡中心细胞型淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、夕卜套细胞淋巴瘤、前B细胞白血病、或急性淋巴细胞白血病。此外，个体的骨髓功能通常并未降低。个体通常不具有通常在许多这类疾病中所发现的异常K : XFLC比例。术语〃总游离轻链"，表示来自个体的样品中K和\游离轻链的量。样品通常是来自个体血清的样品。然而，也可以潜在地使用全血、血浆、尿或其他组织或液体样品。通常，FLC,如总FLC，通过免疫分析如ELISA分析或利用荧光标记珠如Luminex 珠测定。
夹心分析(Sandwich assay)例如使用抗体检测特异性抗原。所述分析所用的一种或多种抗体，可以用能将底物转化为可检测的分析物的酶标记。这类酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和本领域已知的其他酶。可选地，可以使用其他可检测标签或标记，代替酶，或与酶一起使用。这些标签或标记包括放射性同位素、本领域已知的各种有色和荧光标记，包括突光素、Alexa fluor、Oregon Green、B0DIPY、若丹明红(rhodamine red)、Cascade Blue、Marina Blue、Pacific Blue、Cascade Yellow、金；和诸如生物素(可从例如Invitrogen Ltd, United Kingdom获得)的缀合物。也可以使用染料溶胶、化学发光标记、金属溶胶或有色乳胶。这些标记中的一种或多种都可以用于根据本文所述的各种发明的ELISA分析或可选地用于其他分析，本文所述的标记的抗体或试剂盒。夹心型分析的构建自身在本领域中是公知的。例如，将对FLC具有特异性的"捕获抗体〃固定于基质上。可以通过本领域公知的方法，将〃捕获抗体〃固定于基质上。样品中的FLC被〃捕获抗体〃结合，这使得FLC通过〃捕获抗体〃与基质结合。将未结合的免疫球蛋白洗涤掉。
在ELISA或夹心中，结合免疫球蛋白的存在可以通过使用标记的“检测抗体”来确定，所述“检测抗体”相对于结合抗体而言特异于所关注FLC的不同部分。流式细胞术可用于检测所关注的FLC的结合。对于例如细胞分选而言，此技术是公知的。然而，其也可以被用于检测标记的颗粒例如珠，以及用于测量它们的大小。大量的教科书中描述了流式细胞术，例如Practical Flow Cytometry,第三版(1994)，H.Shapiro, Alan R. Liss, New York 和 Flow Cytometry, First Principles (第二版)2001，A.L.Given, Wiley Liss。诸如FLC特异性抗体等结合抗体之一，与诸如聚苯乙烯或乳胶珠等珠结合。将珠与样品以及第二种检测抗体混合。检测抗体优选地用可检测的标记来标记，其与样品中待检测的FLC结合。当存在待分析的FLC时，这产生标记的珠。也可使用对于本文所述的其他分析物具有特异性的其他抗体，以允许检测这些分析物。随后可以通过流式细胞术检测标记的珠。对于例如抗游离入抗体和抗游离K抗体，可以使用不同的标记，例如不同的荧光标记。在此分析中或本文所述的其他分析中，也可以使用对于本文所述的其他分析物例如癌症特异性抗原具有特异性的其他抗体，以允许检测这些分析物。这允许同时测定结合的各类型的FLC的量或允许确定其他分析物的存在。可选地，或额外地，对于不同抗体，例如对于不同标志物特异性抗体，可以使用不同大小的珠。流式细胞术可以辨别不同大小的珠，并且因此可以迅速地确定样品中各FLC或其他分析物的量。可选的方法使用与例如荧光标记的珠例如可商购获得的Luminex 珠结合的抗体。不同的珠与不同的抗体一起使用。不同的珠用不同的荧光团混合物标记，由此允许通过突光波长测定不同的分析物。Luminex珠可从Luminex Corporation, Austin, Texas, UnitedStates ofAmerica 获得。优选地，所用的分析是池度测定法(nephelometric method)或比池法(turbidimetric method)。用于检测入-FLC或k-FLC的池度测定分析和比池分析通常在本领域中是公知的，但对于总FLC分析却并非如此。对于分析而言，它们具有最佳的灵敏度水平。可以分别测定X FLC和K FLC浓度，或单次分析总FLC。这样的分析通常包含60:40比例的抗-K FLC抗体和抗-入FLC抗体，但是其他比例，如50:50也可以使用。也可以产生针对于游离入和游离K轻链的混合物的抗体。可以将FLC的量，如总FLC的量与标准的预定值相比较，以确定总量是高于正常FLC范围值还是低于正常FLC范围。
如下文所详细讨论的，申请人已发现，较高的血清FLC浓度与患有促炎癌症的患者存活降低的可能性的显著增加有关。与例如具有较低血清FLC水平的人相比，更是如此。每单位GFR的FLC水平>1. 7mg/L,与癌症死亡风险增加有关。水平高于第90百分位数(每单位GFR的FLC为6. 12mg/L)的患者的风险非常显著地增加(P〈0. 005)。历史上，已经产生了用于分别测量K和XFLC的试剂盒，从而允许计算比例。它们已经被常规地用于已表现出疾病症状的个体中。优选地,分析能够测定样品中约lmg/L-100mg/L或lmg/L_80mg/L的FLC,例如总FLC0预期其检测绝大多数个体中的血清FLC浓度，而不需要以不同的稀释度重新分析样品。优选地，所述方法包括使用免疫分析，例如通过使用抗游离K轻链和抗游离入轻链抗体或其片段的混合物来检测样品中总游离轻链的量。这样的抗体可以为50:50比例的抗K :抗X抗体。结合至FLC的抗体或片段可以通过使用经标记的抗体或片段直接检测，或使用标记的抗所述抗游离X的抗体或抗所述抗游离K抗体的抗体间接检测。抗体可以为多克隆的或单克隆的。可以使用多克隆抗体，由于它们是针对相同链的不同部分而产生的，所以其能够检测相同类型轻链之间的一些变化。多克隆抗体的产生描述于例如W097/17372中。优选地，确定的并发现对于显示整体存活可能性增加而言显著的血清FLC例如总FLC的量为低于50mg/L。〈47. 4mg/L的水平显示P〈0. 001。校正的FLC水平大于每单位GFR(肾小球过滤速率)I. 7mg/L的FLC个体的存活显著更短。水平高于第90百分位数(每单位GFR的FLC为6. 12mg/L)的患者的风险显著增加(P〈0. 005)。还提供了用于FLC，例如用于本发明的方法的分析试剂盒。所述试剂盒可以检测样品中总FLC的量。它们可以与使用本发明方法的使用说明一起提供。分析试剂盒还用于本发明的方法中，其包含一种或多种抗FLC抗体，和一种或多种抗癌症抗原抗体。对于许多癌症而言，作为标志物的抗原通常是已知的。可以提供这类标志物的抗体，以进一步鉴定癌症。分析试剂盒可适于检测样品中低于25mg/L、最优选低于20mg/L或约10mg/L、低于5mg/L或4mg/L的总游离轻链(FLC)的量。校准材料所测量的范围通常为l-100mg/L。分析试剂盒可以为例如浊度测定分析试剂盒。优选地，试剂盒为包含一种或多种抗FLC的抗体的免疫分析试剂盒。通常，试剂盒包含抗K和抗X FLC抗体的混合物。通常，使用50:50抗游离K和抗游离\抗体的混合物。试剂盒可适于检测样品中l-100mg/L或优选地l-80mg/L量的总游离轻链。也可以使用能够结合FLC的抗体片段，例如(Fab)2或Fab抗体的片段。
可以例如使用上述的标记将抗体或片段标记。可以提供标记的抗免疫球蛋白结合抗体或其片段，以检测结合至FLC的抗游离\或抗游离K。试剂盒可以包含校准流体，以允许在所示范围校准分析。校准流体优选地包含预定浓度的FLC,例如100mg/L至I mg/L,低于25mg/ml，低于20mg/ml，低于10mg/ml，低于5mg/L或低至lmg/L。通过优化抗体的量和“阻滞”涂布在乳胶颗粒上的蛋白且例如通过优化补充试剂的浓度例如聚乙二醇(PEG)浓度，也可使所述试剂盒适用。试剂盒可以包含例如FLC的多种标准对照。标准对照可以用于证实待产生的FLC或其他成分的浓度的标准曲线。这样的标准对照确认先前校准的标准曲线对于所使用的试剂和条件是有效的。它们通常与来自个体的样品的分析基本上同时使用。标准可以包含一种或多种低于20mg/L的用于FLC的标准，更优选地低于15mg/L，低于约10mg/L或低于5mg/L，以允许所述分析能够检测较低浓度的游离轻链。分析试剂盒可以为浊度测定试剂盒或比浊试剂盒。其可以为ELISA、流式细胞术、 荧光、化学发光或珠类分析或浸溃条(dipstick)。这样的分析通常是本领域已知的。分析试剂盒还可以包括用于本发明方法的使用说明。使用说明可以包括对于被认为是正常值的总游离轻链的浓度的指示，低于所述值或实际上高于所述值表明个体存活可能性增加或降低或存在癌症的可能性增加的指示。这样的浓度可以如上所定义。参考以下附图
，将仅通过实施例的方式描述本发明。图I显示基于其总FLC浓度而被分为五分位数(quintiles)的研究群体的存活可能性。五分位数水平为 <33. 3,33. 4-47. 3,47. 4-76. 8,67. 9-106. 3 以及 >106. 5mg/L。图2是使用分离的、可商购获得的抗游离K和抗游离\分析试剂盒获得的总FLC浓度之间的比较，与使用组合的抗、和抗K游离轻链抗体的总FLC分析试剂盒相比较。肿瘤预后置量癌症导致的死亡仍然是死亡的常见原因。早期诊断和治疗可以显著改善患者结果，从而使得持续研发准确的筛选检验非常重要。几种癌症具有促炎属性，因此假设升高的血清、免疫球蛋白游离轻链，可能是存在或不断发展这些肿瘤之一的有用标志物。所考虑的具体癌症是具有明显炎性关联的癌症(肺、结肠直肠、小肠、食道、胰腺、LCB0P)。方法收集患有各种程度的肾损害的1300名患者的血清样品(〃基线〃)，并且随后随访高达63个月。更详细而言,从伯明翰大学医院(University Hospital Birmingham)的肾门诊部招募患者。患者的肾脏问题包括蛋白尿、血尿、慢性肾病(所有阶段)、晚期肾衰竭(血液透析和腹膜透析)以及肾移植受体。所做的检验和评估包括血清肌酸酐和估算的肾小球过滤速率(eGFR)。按如下，计算每单位GFR的校正的FLC水平使总血清FLC浓度(mg/L)除以估算的肾小球过滤速率，估算的肾小球过滤速率通过以ml/min/1. 73m2表示的Cockcroft-Gault方程(REF)计算。因此产生独立于肾功能的患者的血清总FLC水平，以每单位GFR mg/L表
/Jn o参考文献(Ref)
Cockcroft DW, Gault MH:Prediction of creatinine clearance from serumcreatinine. Nephron 16:31-41，1976尿白蛋白/肌酸酐比例这些是本领域的标准检验。血清FLC 浓度，K 和入两者(Freelite, The Binding Site, Birmingham, UK) 通过添加K FLC和\ FLC的值，计算总血清FLC浓度。随访随访患者的死亡时间和死亡原因。
结果患者存活的Kaplan Meier分析证明，FLC水平较高的患者的存活降低(P〈0. 001)，参阅图I。存活率显示于图I中。
_Percentile Group of total FLCs (range mg/L)__
I 2 3 4 5 Ji if*__(<33.3) (33.4-47.3) (47.4-67.8) (67.9-106.3) (>106.5) _
I 死亡否266262256228 1811193
是 11 10 23 48 87185
总计277278279_276 268 1378(表中Percentile Group of total FLCs (range mg/L):总 FLC 的百分位数组(范围 mg/L))当独立于肾功能评估血清总FLC时，酶单位GFR的FLOl. 7mg/L,与存活显著降低有关(P〈0. 0001)
IPercentile Group of total FLCs corrected for GFR
I(range mg/L per unit GFR)
I1 2 3 4 5 自计_I(<0-S) (0.5-0.9) (0.9-1.7) (1.7-3.6) {>3.6)__
死亡否 I 255256245219^83 1158
是 I910204681 166
_总计 I264266265265264 1324(表中Percentile Group of total FLCs corrected for GFR(range mg/L perunit GFR):根据GFR校正的总FLC的百分位数组(范围mg/L每单位GFR))校正的FLC水平高于中值(每单位GFR，I. 7mg/L)的存活显著更短。
当调查死亡原因时，在具有较高的总FLC浓度的患者中，继发于癌症后的死亡几
率显著较高。
权利要求
1.用于判断患有癌症的个体的预后、鉴定具有较大的患有未诊断的癌症的风险的个体和/或鉴定处于较大的发生癌症的风险的个体的方法，所述方法包括检测来自所述个体的样品中游离轻链(FLC)的量，其中较高的FLC的量，与由于癌症导致的存活降低和/或所述个体患有未诊断的癌症的风险增加和/或发生癌症的风险增加有关。
2.权利要求I的方法，其中所述癌症是促炎癌症，并且优选是肺癌、结肠直肠癌、小肠癌、食道癌或胰腺(LCBOP)癌。
3.权利要求I或2的方法，其中所述游离轻链的量是所述样品中总游离轻链的量。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中测定来自所述个体的血清样品中的所述FLC。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中利用抗游离轻链抗体，通过免疫分析测定所述总 FLC。
6.权利要求5的方法，其中所述抗体是抗游离K轻链和抗游离λ轻链抗体的混合物。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述方法包括通过浊度测定法或比浊法检测所述FLC的量。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述个体之前并未诊断为患有癌症和/或并不具有B细胞相关疾病的症状。
9.用于权利要求1-8中任一项的方法中的分析试剂盒，还包含用于所述方法中的使用说明。
10.权利要求9的分析试剂盒，还包含正常值，针对所述正常值，利用所述分析试剂盒所获得的FLC浓度表示个体的存活增加。
11.用于权利要求1-8中任一项的方法中的分析试剂盒，或权利要求9或10的分析试剂盒，包含一种或多种抗FLC抗体和一种或多种抗癌症抗原抗体。
全文摘要
本发明提供判断患有癌症个体预后、鉴定具有较大的患有未诊断的癌症的风险的个体和/或鉴定处于较大的发生癌症的风险的个体的方法，所述方法包括，检测来自所述个体的样品中游离轻链(FLC)的量，其中较高的FLC的量与由于癌症导致的存活降低和/或个体患有未诊断的癌症的风险增加和/或发生癌症的风险增加有关。
文档编号G01N33/574GK102859361SQ201180008402
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月4日 优先权日2010年2月5日
发明者A·布拉德韦尔, G·米德 申请人:结合点集团有限公司