专利名称：Gdf15蛋白的抗体的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及⑶F15蛋白的抗体的新用途。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)为一种单正链RNA病毒，属黄病毒科，是经血液传播的急、慢 性肝炎的重要致病因子。HCV感染的慢性率非常高，为50% -85%, HCV慢性感染与肝硬化 及肝细胞癌密切相关，严重危害人民健康。目前全球HCV感染者近2亿，感染率为3. 1 % (Lauer GM,Walker BD. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2001Jul 5 ；345(1) 41-52.)。我国为丙肝高发区之一，我国一般人群的感染率为3. 2%，感染人数约为4200万 (中华医学会，《丙型肝炎防治指南》，2005)。目前还没有针对HCV特异性的疫苗和药物，仍然无法阻断新发的丙肝感染，HCV感 染防治形势日趋严峻。聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)和利巴韦林(Ribavirin)的联合治疗是 目前唯一治疗手段，但是此方法治疗周期长，费用昂贵并且有较强的副作用，因此深入研究 HCV的生物学特征及其致病机理，将对开发有效的保护性疫苗、新型抗HCV药物和治疗方案 等具有极其重要的意义。分化生长因子GDF15(Growth differentiation factor 15， GDF15)， 也称巨噬细胞抑制因子(macrophage inhibitory cytokine-1，MIC-1)、前列腺 衍生因子(prostatederived factor, PDF)、胎盘转化生长因子(placental transformation growthfactor, PTGF-^)禾口胎盘骨形态发生蛋白(placental bone morphogeneticprotein, PLAB)，是肝脏在人体受伤时候分泌的一种蛋白，属于转化生 长因子0超家族(TGF-日)。在基因组中位于19pl3.1-13.2，是由2个外显子和1个 内含子组成的长度为 2746bp 的 DNA(http://AtlasGeneticsOncology. org/Genes/ GDF15ID40701chl9pl3. htm)。GDF-15的前体分子有308个氨基酸残基，包含167个氨 基酸的前肽，在第70个氨基酸处有一个糖基化的位点，2个GDF15的单体蛋白通过二硫 键结合形成双体结构，双体蛋白在RXXR切割位点发生蛋白水解，形成一个由112个氨 基酸残基构成的成熟活性多肽，它的羧基端序列中含有7个进化保守的半胱氨酸残基 (Bauskin AR, Zhang HP, Fairlie WD, He XY, Russell PK, Moore AG, Brown DA, Stanley KK, Breit SN, etal. The propeptide of macrophage inhibitory cytokine (MIC-1), a TGF-betasuperfamily member,acts as a quality control determinant for correctly foldedMIC-1. EMB0. J. 2000 May 15 ；19 (10) -.2212-20. ) 目前该蛋白的确切功能尚无 定论，但研究表明GDF-15存在着多种生物学功能，包括抑制内毒素刺激颗粒细胞释放肿 瘤坏死因子、诱导骨基质小梁形成、促进神经细胞的存活，刺激细胞分化等，且多与促炎 反应、细胞凋亡和抑制生长相关，并认为和多种肿瘤的发生有密切联系，同时研究也发 现 GDF15 是一种新的心脏保护因子(Ago T, Sadoshima J. GDF15, acardioprotective TGF-beta superfamily protein. Circ Res. 2006 Feb 17 ；98 (3) 294-7.；王晓健， 惠汝太.一个新的保护心脏TGF-0超家族成员.中国分子心脏病学杂志，2006(4)242-245.)。在正常人体内，⑶F15的表达具有明显的组织特异性，⑶F15最丰富的表达在 月台盘(Lawton LN，Bonaldo MF，Jelenc PC，et al. Identification of a novel member of the TGF—beta superfamily highly expressedin human placenta.Gene，1997Dec 5 ；203(1) :17-26.)，其他一些组织如结肠、肾脏等较低，在器官损伤的过程中，如肝，肾， 心脏和肺的损伤，它在肝脏的表达可明显升高(Zimmers T，Jin X，Hsiao E，McGrath S， Esquela A， Koniaris L， et al.Growth differentiation factor-15/macrophage inhibitory cytokine一1 inductionafter kidney and lung injury.Shock 2005 Jun ； 23(6) 543-8. ；Hsiao E，KoniarisL，Zimmers-Koniaris T，Sebald S，Huynh T，Lee S，et al. Characterization ofgrowth-differentiation factor 15. a transforming growth factor betasuperfamily member induced following liver injury. Mol Cell Biol 20(10) :3742-51.)，在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌等癌症中，表达量也显著上 调，已经表明测定血清中的GDF15水平，可以用于辅助诊断前列腺癌和胰腺癌。此外，血清 中GDF15的高表达也与淋巴结转移的高发病率、生存期短，易于复发等高度相关。目前多是 针对GDF15与肿瘤和心血管病的相关研究，尚未见病毒性肝炎与GDF15的相关性报道。

发明内容
本发明的目的是提供⑶F15蛋白的抗体的新用途。本发明提供了⑶F15蛋白的抗体的如下三种应用(1)在制备辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂中的应用；(2)在制备辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂盒中的应用；(3)在制备辅助鉴定丙型肝炎患者所处的丙肝进程的试剂或试剂盒中的应用；所 述丙型肝炎进程为慢丙肝、丙肝硬化或肝癌。本发明还保护如下三种产品(1)辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂，包括GDF15蛋白的抗体；(2)辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂盒，包括⑶F15蛋白的抗体；(3)辅助鉴定丙型肝炎患者所处的丙型肝炎进程的试剂或试剂盒，包括GDF15蛋 白的抗体；所述丙型肝炎进程为慢丙肝、丙肝硬化或肝癌。以上三种应用和三种产品中，所述⑶F15蛋白的氨基酸序列可如序列表的序列1 所示。以上三种应用和三种产品中，所述⑶F15蛋白的抗体具体可为如下(a)或(b)(a)从商业途径获得的⑶F15蛋白的抗体；(b)体外培养分泌GDF15蛋白抗体的杂交瘤细胞株得到的单克隆抗体。实验表明机体或细胞感染HCV后，均可使GDF15蛋白的表达上调；用外源性的细 胞因子⑶F15处理感染HCV的Huh7细胞，也可使HCV的表达上调，且随⑶F15量的增加， HCV的量也增高，细胞因子⑶F15的量与HCV呈明显的正相关。本发明通过对194例临床样 本的检测，发现在病毒性肝炎患者，包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染 者，GDF15的表达均上调，在丙肝患者中随病情的发展GDF15的上调也越高，在丙肝肝癌患 者中⑶F15的上调尤其明显，故细胞因子⑶F15在临床上可以作为病毒性肝炎的血清学辅 助诊断标志，判断疾病进程和预后的标志以及病毒性肝炎治疗监测的标志。
基于以上发现，本发明开发了用于辅助鉴定丙型肝炎或乙型肝炎的试剂(或试剂 盒)，以及用于辅助鉴定丙型肝炎患者所处的丙型肝炎进程的试剂(或试剂盒)。本发明的 试剂盒可用于病毒性肝炎(丙型肝炎或乙型肝炎)的血清学诊断，判断疾病进程(慢乙肝、 丙肝硬化、肝癌)和预后以及病毒性肝炎治疗监测，对于丙型肝炎和乙型肝炎的诊断和治 疗具有重大价值。


图1为基因芯片检测细胞内⑶F15 RNA的结果；图中柱形图显示的分别为用HCV 感染Huh7细胞不同天数后GDF15的相对表达水平，其中黑色和灰色分别代表灭活病毒感染 阴性对照组和HCV感染组；可见感染后细胞中⑶F15的表达水平明显升高十几倍。图2为实时荧光定量方法检测细胞内GDF15 RNA的结果；图中柱形图显示的为用 HCV感染Huh7细胞不同天数后收集细胞，Real-time PCR方法检测细胞中的⑶F15的相对 定量，其中黑色和灰色分别代表灭活病毒感染阴性对照组和HCV感染组；可见感染后细胞 中⑶F15的表达水平明显升高。图3为通过酶联免疫实验(ELISA)检测HCV感染后，分泌到细胞外的⑶F15蛋白 水平。图4为不同浓度的外源性⑶F15重组蛋白处理细胞后的HCV病毒核酸水平的变 化；可见随⑶F15处理浓度的增加，病毒基因组RNA的水平也逐渐增高。图5为⑶F15调控机制研究；分别过表达HCV的若干结构蛋白和非结构蛋白后，检 测细胞培养基上清中GDF15蛋白的含量，结果显示对GDF15起上调作用的主要为HCV的结 构基因core、El和E2。图6为通过ELISA方法对健康人群(非HBV、非HCV感染者)、HBV感染人群和HCV 感染人群血清中的⑶F15蛋白水平进行测定的结果，可见乙肝和丙肝患者血清⑶F15蛋白 平均值均显著高于正常人。图7为GDF15蛋白量与丙肝患者疾病进程的关系；可见随病情由慢性丙肝向肝硬 化、肝癌的进展，GDF15的量也越高，GDF15的水平与病情的严重程度密切相关。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。⑶F15抗体包括捕获抗体和检测抗体，均购自R&D Systems公司；捕获抗体的产品 目录号为MAB957 ；检测抗体的产品目录号为BAF940。实施例1、肝炎病毒感染诱导细胞因子⑶F15的发现用临床分离的急性期2a基因亚型的HCV感染Huh7细胞(购买自美国Apath公 司)，分别在不同的时间点收集细胞，进行基因芯片测定(基因芯片购自博奥生物有限公 司暨生物芯片北京国家工程研究中心，产品为35K人类mRNA寡核苷酸探针芯片，具体芯 片操作由博奥生物按照其标准操作流程完成)，结果筛选出HCV感染后的高表达基因之一GDF15，该基因从感染后第2天起即显著升高十几倍。因此可能在HCV的感染调控中起一定 作用，具体结果见图1。实施例2、细胞因子⑶F15表达水平及HCV复制的相互调控作用一、在细胞水平，HCV的感染可以促使⑶F15的表达上调用分离自临床急性期丙肝的HCV病毒感染Huh7细胞，于不同时间点分别收集细胞 及细胞上清；采用实时荧光定量(Real-time PCR)方法检测细胞内⑶F15的mRNA的相对定 量，应用QIAGEN公司的一步法RT-PCR定量试剂盒(货号204154)和ABI公司7900实时 荧光定量PCR仪按照厂商推荐的标准程序进行检测，扩增引物序列如下上游引物5:ACT TGT TAG CCA AAG ACT GCC_3~，下游引物5~-AAC CTT GAGCCC ATT CCA_3~。结果见图 2， 体外HCV感染细胞后可显著诱导⑶F15的转录水平。此外，由于⑶F15属于细胞因子，用ELISA方法检测HCV病毒感染后细胞上清中的 ⑶F15蛋白的水平。结果如图3所示与芯片结果一致，感染HCV后，细胞内的⑶F15mRNA水 平及分泌到细胞外的GDF15蛋白水平均增高。二、在细胞水平，⑶F15处理促进HCV的复制水平用不同浓度有活性的外源性⑶F15重组蛋白(购自美国R&D公司)处理感染HCV 的Huh7细胞，通过实时荧光定量方法检测外源性GDF15对HCV复制水平的调控作用。具体 方案HCV感染Huh7 细胞 24h后分别用 0ng/mL、0. 5ng/mL、l. 5ng/mL、3. Ong/mL浓度的⑶F15 处理细胞，处理24h后收集细胞，实时荧光定量PCR方法进行HCV的绝对定量，引物序列如 下上游引物:5~-GTC TAG CCA TGG CGT TAG TA_3~，下游引物5:CTC CCG GGG CAC TCG CAA GC-3~。结果显示用外源性⑶F15处理细胞的HCV病毒载量高于未用⑶F15处理的细 胞的病毒载量，且随着GDF15浓度的增高，病毒载量也越高，即外源性GDF15的处理可促进 HCV的转录，具体见图4。实施例3、HCV感染刺激⑶F15表达的调控机制用HCV的3个结构蛋白基因和5个非结构蛋白基因分别转染Huh7细胞，48h后收集 上清，ELISA方法检测⑶F15的蛋白水平，与空载体阴性对照相比，结构蛋白core、El和E2 能够显著诱导⑶F15表达上调，而非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS3/4A及NS5B并未诱导⑶F15 表达水平升高，结果见图5。HCV的结构基因core、El和E2使⑶F15上调，证明细胞因子 ⑶F15对HCV的调控作用可能与⑶F15和HCV的结构蛋白结合有关。实施例4、应用⑶F15的抗体检测健康人及丙型肝炎、乙型肝炎患者血清⑶F15水 平在病人知情同意的前提下，收集临床血清样本190例，其中健康体检血清53份， HBV感染血清77份，HCV感染血清60份。用ELISA方法检测各个血清样本中⑶F15蛋白的含量，步骤如下1、将捕获抗体溶于PBS中，配成浓度为2 u g/mL的溶液(包被液)，包被至96孔酶 标板中，每孔lOOiiL，封口后，4°C过夜。2、弃去包被液，用含0. 05%的Tween 20的PBS洗三次，尽量甩干。3、用含BSA的PBS于室温封闭1小时。重复步骤2。4、将⑶F15的标准品进行系列倍比稀释成如下浓度5. 0ng/mL、2. 5ng/mL、 1. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0. 312ng/mL、0. 156ng/mL、0. 078ng/mL、0ng/mL，同时各取 100 P L临床样品血清加至96孔酶标板，每孔100 u L，封口后，室温孵育2小时，弃去液体后，重复步
马聚2 o5、每孔加入100 u L生物素标记的浓度为50ng/mL的检测抗体，封口后，室温孵育 2小时，弃去液体后，重复步骤2。6、每孔加入100 u L亲和素连接的HRP，封口室温避光20分钟，弃去液体后，重复步
马聚2 o7、每孔加入lOOiiL底物显色，封口室温避光20分钟后，加50iiL 2N的H2S04终止 反应。450nm波长下读板，测定各孔0D值，根据标准品浓度计算各临床样品的GDF15蛋白含
Mo检测结果见表1。表1190份血清样本中⑶F15蛋白含量 在正常体检者血清中GDF15的平均含量为0. 30ng/mL，在HBV感染者中⑶F15的平 均含量为1. 31ng/mL，在HCV感染者中⑶F15的平均含量最高，为4. 39ng/mL，见图6。在HBV 感染患者中，约87%的患者血清GDF15蛋白含量高于正常人平均值；在HCV感染患者中，约 65%的患者血清⑶F15蛋白含量高于正常人平均值。结果表明病毒性肝炎患者(包括乙 肝和丙肝患者)血清中的⑶F15的水平要明显高于正常健康人，因此可将⑶F15作为病毒 性肝炎的血清学诊断候选标志。实施例5、应用⑶F15的抗体检测不同疾病严重程度的丙型肝炎患者在病人知情同意的前提下，收集HCV感染血清56份，其中慢丙肝患者43名，丙肝 硬化患者10名，肝癌患者3名。用ELISA方法检测各个血清样本中GDF15蛋白的含量，方法同实施例4。检测结果见表2。表260份血清样本中GDF15蛋白含量 不同疾病严重程度的患者的GDF15蛋白的含量取平均值，见图7。结果表明，在HCV 的感染中，随病情的恶化，血清GDF15的表达增高，在丙肝肝癌患者血清中的含量则显著增 高，与疾病的严重程度呈现正相关关系。以上结果表明，在临床上，⑶F15可以作为病毒性 肝炎的血清学诊断标志，判断疾病进程及预后的标志，并可为丙肝的疫苗及药物开发开辟 一条新的途径，在临床应用中具有较高的价值。
权利要求
GDF15蛋白的抗体在制备辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂中的应用。
2.GDF15蛋白的抗体在制备辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂盒中的应用。
3.GDF15蛋白的抗体在制备辅助鉴定丙型肝炎患者所处的丙肝进程的试剂或试剂盒中 的应用；所述丙型肝炎进程为慢丙肝、丙肝硬化或肝癌。
4.如权利要求1至3中任一所述的应用，其特征在于所述GDF15蛋白的氨基酸序列 如序列表的序列1所示。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述GDF15蛋白的抗体为如下(a)或(b)(a)从商业途径获得的⑶F15蛋白的抗体；(b)体外培养分泌GDF15蛋白抗体的杂交瘤细胞株得到的单克隆抗体。
6.一种辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂，包括GDF15蛋白的抗体。
7.一种辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂盒，包括GDF15蛋白的抗体。
8.一种辅助鉴定丙型肝炎患者所处的丙型肝炎进程的试剂或试剂盒，包括GDF15蛋白 的抗体；所述丙型肝炎进程为慢丙肝、丙肝硬化或肝癌。
9.如权利要求6至8中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述GDF15蛋白的氨 基酸序列如序列表的序列1所示。
10.如权利要求9所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述GDF15蛋白的抗体为如下 (a)或(b)(a)从商业途径获得的⑶F15蛋白的抗体；(b)体外培养分泌GDF15蛋白抗体的杂交瘤细胞株得到的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了GDF15蛋白的抗体的新用途。本发明提供了GDF15蛋白的抗体的如下三种应用(1)在制备辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂中的应用；(2)在制备辅助鉴定丙型肝炎患者或乙型肝炎患者的试剂盒中的应用；(3)在制备辅助鉴定丙型肝炎患者所处的丙肝进程的试剂盒中的应用；所述丙型肝炎进程为慢丙肝、丙肝硬化或肝癌。基于以上三种应用，可以将GDF15蛋白的抗体制备三种试剂盒。本发明的试剂盒可用于病毒性肝炎(丙型肝炎或乙型肝炎)的血清学诊断，判断疾病进程(慢乙肝、丙肝硬化、肝癌)和预后以及病毒性肝炎治疗监测，对于丙型肝炎和乙型肝炎的诊断和治疗具有重大价值。
文档编号G01N33/576GK101852804SQ201010136378
公开日2010年10月6日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者刘秀英, 司有辉, 杨威 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所