专利名称：一种恩拉霉素完全抗原的合成方法
技术领域：
一种恩拉霉素完全抗原的合成方法，本发明属于有机化学及免疫化学技术领域， 本发明合成的恩拉霉素完全抗原用于制备特异性识别化学兽药恩拉霉素的抗体和研制高 效快速检测恩拉霉素微含量的免疫速测试剂盒。
背景技术：
抗生素发明以来，不仅在人类疾病的治疗和预防方面效果显著，同时在畜牧业饲 料添加剂方面也发挥着巨大的作用。抗生素对动物的促生长作用是在20世纪40年代后期 由Stocktadt等人发现，以后相继发现四环素类、大环内酯类、β -内酚胺类等抗生素加入 饲料中，都有促进生长、增重、增产、提高饲料报酬作用。1950年美国FDA正式批准允许在饲 料中添加抗生素。抗生素对于畜禽的生长和提高生产性能的作用是肯定的，而且很稳定，许 多国家的畜禽业都长期应用抗生素添加剂。实践证明，合理地使用抗生素添加剂能促进畜 禽生长，提高饲料转化率。同时也有报告显示，不允许在饲料中添加抗生素或其他抗菌促生 长剂的国家，会造成畜牧业生产成本增加，盈利减少，同时也有可能引发诸如生态环境及国 家之间的贸易战等问题。但为了避免由于抗生素的滥用引起耐药菌株大量繁殖或使药物在 畜产品中的残留量增大，对畜禽生长及人体健康造成直接危害，应用畜禽专用的抗生素饲 料添加剂已迫在眉睫。只有对其进行全面的认识并合理的应用，提高其应用水平，才能充分 发挥其有利作用又能避免对人类健康造成危害。恩拉霉素，英文名称=Enramycin ；中文名又称恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持 久霉素，其主要成分是恩拉霉素A =C107H138N26O31C12 R = CH3和恩拉霉素B :C1(18H14(1N26031C12 R = C2H50H。本品是由日本武田药品研究所于1966年由土壤中分离出来的放线菌 (Streptomyces fungicidiousNO. B5477)经发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和上二种 氨基酸结合而成的多肽类(Polypepide)抗生素，并因其强大的杀菌作用而被称之为 Enduracidin0该药品于1973年正式在日本获得批准为抗生素饲料添加剂，应用至今；于 1993年该药在中国登记注册，并开始应用，由于该药品具有不被肠道降解吸收可保持原有 抗菌活性，临床试验时与现有抗生素或抗菌药间无交叉耐药性等优点，现今应用已经相当 广泛，尤其是在鸡和猪的饲养中，应用形式主要为预混剂 8%)，2007年使用量已达 上千吨。作为饲料添加剂恩拉霉素有如下优点1.临床应用研究方面，与其他抗生素添加剂相比，用量少的情况下饲料系数更低， 生长速度更快，并能改善畜牧业的商品性能。2.药效学研究方面，恩拉霉素对主要的革兰氏阳性菌都具有强大的杀菌作用。恩 拉霉素对乙肝病毒(HBV)抗原有较强的抑制作用，对乙肝e抗原(HBeAg)也有较好的抑制 效果.因此对HBVDNA及抗原都有较好的抑制作用。恩拉霉素与临床上现有的抗生素或抗 菌药之间不存在交叉耐药性。敏感菌几乎不对恩拉霉素产生耐药性，在实验条件下，耐药性 的产生也非常缓慢，即使出现，耐药性也不稳定，而且极易丢失。
3.药物残留研究方面，恩拉霉素内服极不易被吸收，药物主要通过粪便排出体外。4.毒理学研究方面，恩拉霉素毒性很低；急性毒性实验表明，恩拉霉素在口服、皮 下或肌肉注射给药时实际无毒。5.恩拉霉素的盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的稳定性。恩拉霉素在饲料中具有 很高的稳定性，在室温条件下长期储藏很少降解，在制成颗粒料过程中也非常稳定，与饲料 混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗 菌活性。随着人们生活水平的提高以及对滥用抗生素的防范意识的提高，逐渐关注日益广 泛应用的恩拉霉素在残留量方面的危害，尤其对动物源性食品中的残留量，为此各国均在 进出口贸易中对其添加剂的成分和含量均有严格限定。目前，酶联免疫法(ELISA)基于抗原抗体反应和酶化学反应，具有灵敏、快速、简 便、特异性好、样品需求少，对昂贵仪器以及专业操作人员的依赖程度较低等优点，非常适 于现场监控和样品的批量检测，而且酶联免疫法的操作过程所需试剂大部分为无机化学试 剂，且用量较少，因此该法环境友好型检测方法。但现在国内外尚未有理想的针对恩拉霉素 残留免疫检测方法的报道，仅日本厚生省对该项残留物质有畜、水产性食品有常规检测技 术报道。为了弥补这一空白，有必要设计和制备以恩拉霉素自身为半抗原(仅具有免疫反 应性而不具有免疫原性的小分子化合物)与载体蛋白偶联形成恩拉霉素既具有免疫原性 又具有免疫反应性的完全抗原，在此基础上才能建立相关的酶联免疫检测方法。

发明内容
本发明的目的是提供了一种恩拉霉素完全抗原的合成方法，将该完全抗原用于动 物体恩拉霉素残留量及免疫检测上，具有检测快速、操作简便、成本低的优点。本发明的技术方案一种恩拉霉素完全抗原的合成方法，以恩拉霉素为半抗原，用 戊二醛法将其与牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联，用分光光度法测定偶联物的偶 联比；步骤为(1)恩拉霉素完全人工抗原的合成配制A液称取71. 64g磷酸氢二钠(Na2HP04 · 2H20)，用重蒸水配制成IOOOmL溶 液，浓度为0. 2mol/L，置于4°C下保存备用；配制B液称取31. 21g磷酸二氢钠(NaH2PCM)，用重蒸水配成IOOOmL溶液，浓度为 0. 2mol/L，置于4°C下保存备用；配制C液取A液72. OmL,B液28. OmL于250mL三角瓶中，配成pH7. 2的磷酸盐缓 冲溶液(PBS)，置于4°C下保存备用；配制D液用移液管吸取0. 25mL戊二醛液体，将其配成IOOmL溶液，得0. 25%的
戊二醛溶液，置于4°C下保存；配制E液配制含碳酸钠(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二钠(EDTA) lmol/L的碱 性EDTA溶液，置于4°C下保存，以备处理透析袋；称取恩拉霉素20mg盛于IOOmL锥形瓶中，称取牛血清蛋白BSA20mg于5号试管中。 向试管中加入C溶液约3mL，待牛血清蛋白BSA完全溶解后转移到有恩拉霉素的锥形瓶中， 再用C溶液洗涤试管，将牛血清蛋白BSA完全移入锥形瓶，共用C溶液10mL。待恩拉霉素基本溶解后，向锥形瓶中加入1，4_ 二氧六环10mL，混勻。将磁力搅拌器放入反应器后把锥形 瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧瓶置于25°C水浴，开启搅拌器，约5min后，保持搅 拌状态，向反应器内逐滴加入D溶液5mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4h，即得恩拉霉 素完全抗原混合液；透析袋前处理取20cm的透析袋，将其置于E溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷 后用蒸馏水冲洗:3min将其洗净，另取IOOcm长的棉线一根，用其一端将透析袋的一端扎紧， 保证不会漏液，保存在4°C去离子水中备用；透析将恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口转移至透析袋内，且将透析袋封口，悬 于盛有适量蒸馏水的大烧杯中，在4°C冰箱内开始透析，透析72h，每天换水2次，最后使用 冷冻干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到恩拉霉素完全抗原恩拉霉素-牛血清白 蛋白；(2)恩拉霉素完全抗原的鉴定恩拉霉素完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结 果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩 尔吸光系数数ε，再测定恩拉霉素完全抗原的偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然 测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原 理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被 偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光 谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸光系数ε 用pH = 7. 2的PBS溶液配制恩拉霉素系列标准浓度，通过紫外 扫描可知恩拉霉素的最大吸收波长为278nm，在278nm处测吸光值，每个浓度做平行样并计 算摩尔吸光系数ε。偶联物蛋白浓度测定配制系列标准浓度的牛血清蛋白溶液，采用考马斯亮蓝测 定法，将每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将 抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的 相应的蛋白浓度。偶联比测定用pH = 7. 2的PBS溶液配制标准浓度的牛血清蛋白溶液，将偶联产 物完全抗原用pH = 7. 2的PBS溶液稀释至标准浓度，在278nm处测吸光值，以pH = 7. 2的 PBS溶液为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为Al，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率 r 为 Y = [ (A1-A2) / ε ]/(C/67000)。其中ε为摩尔吸光系数(Ι^πιοΓ1)，67000为牛血清蛋白的分子量，C为牛血清蛋 白浓度(μΕ'πιΓ1)。本发明的有益效果本发明成功合成了恩拉霉素的人工抗原，合成步骤简洁，有 效，可完全用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研 究的需要。
具体实施例方式实施例1(1)恩拉霉素完全抗原的制备
配制A液称取71. 64g磷酸氢二钠(Na2HP04 · 2H20)，用重蒸水配制成IOOOmL溶 液，浓度为0. 2mol/L，置于4°C下保存备用；配制B液称取31. 21g磷酸二氢钠(NaH2PCM)，用重蒸水配成IOOOmL溶液，浓度为 0. 2mol/L，置于4°C下保存备用；配制C液取A液72. OmL,B液28. OmL于250mL三角瓶中，配成pH7. 2的磷酸盐缓 冲溶液(PBS)，置于4°C下保存备用；配制D液用移液管吸取0. 25mL戊二醛液体，将其配成IOOmL溶液，得0. 25%的
戊二醛溶液，置于4°C下保存；配制E液配制含碳酸钠(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二钠(EDTA) lmol/L的碱 性EDTA溶液，置于4°C下保存，以备处理透析袋；称取恩拉霉素20mg盛于IOOmL锥形瓶中，称取牛血清蛋白(BSA) 20mg于5号试管 中。向试管中加入C溶液约3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后转移到有恩拉霉素的锥形 瓶中，再用C溶液洗涤试管，将牛血清蛋白(BSA)完全移入锥形瓶，共用C溶液10mL。待恩 拉霉素基本溶解后，向锥形瓶中加入1，4_ 二氧六环10mL，混勻。将磁力搅拌器放入反应器 后把锥形瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧瓶置于25°C水浴，开启搅拌器，约5min 后，保持搅拌状态，向反应器内逐滴加入D溶液5mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4h， 即得恩拉霉素完全抗原混合液；透析袋前处理取20cm的透析袋，将其置于E溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷 后用蒸馏水冲洗:3min将其洗净，另取IOOcm长的棉线一根，用其一端将透析袋的一端扎紧， 保证不会漏液，保存在4°C去离子水中备用；透析将恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口转移至透析袋内，且将透析袋封口，悬 于盛有适量蒸馏水的大烧杯中，在4°C冰箱内开始透析，透析72h，每天换水2次，最后使用 冷冻干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到恩拉霉素完全抗原恩拉霉素-牛血清白 蛋白；(2)恩拉霉素完全抗原的鉴定恩拉霉素完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结 果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩 尔吸光系数数ε，再测定恩拉霉素完全抗原的偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然 测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原 理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被 偶联的两种分子浓度，在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光 谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸光系数ε 用pH = 7. 2的PBS溶液配制恩拉霉素系列标准浓度，通过紫外 扫描可知恩拉霉素的最大吸收波长为278nm，在278nm处测吸光值，每个浓度做平行样并计 算摩尔吸光系数ε。偶联物蛋白浓度测定配制系列标准浓度的牛血清蛋白溶液，采用考马斯亮蓝测 定法，将每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将 抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的 相应的蛋白浓度。
偶联比测定用pH = 7. 2的PBS溶液配制标准浓度的牛血清蛋白溶液，将偶联产 物完全抗原用pH = 7. 2的PBS溶液稀释至标准浓度，在278nm处测吸光值，以pH = 7. 2的 PBS溶液为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为Al，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率 r 为■· Y = [ (A1-A2) / ε ]/(C/67000)。其中ε为摩尔吸光系数(Ι^πιοΓ1)，67000为牛血清蛋白的分子量，C为牛血清蛋 白浓度(μΕ'πιΓ1)。
权利要求
1.恩拉霉素完全人工抗原的合成配制A液称取71. 64g磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 2H20)，用重蒸水配制成IOOOmL溶液，浓 度为0. 2mol/L，置于4°C下保存备用；配制B液称取31. 21g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，用重蒸水配成IOOOmL溶液，浓度为 0. 2mol/L，置于4°C下保存备用；配制C液取A液72. OmL,B液28. OmL于250mL三角瓶中，配成pH7. 2的磷酸盐缓冲溶 液(PBS)，置于4°C下保存备用；配制D液用移液管吸取0. 25mL戊二醛液体，将其配成IOOmL溶液，得0. 25 %的戊二 醛溶液，置于4°C下保存；配制E液配制含碳酸钠(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二钠(EDTA) lmol/L的碱性 EDTA溶液，置于4°C下保存，以备处理透析袋；称取恩拉霉素20mg盛于IOOmL锥形瓶中，称取牛血清蛋白BSA20mg于5号试管中。向 试管中加入C溶液约3mL，待牛血清蛋白BSA完全溶解后转移到有恩拉霉素的锥形瓶中，再 用C溶液洗涤试管，将牛血清蛋白BSA完全移入锥形瓶，共用C溶液10mL。待恩拉霉素基本 溶解后，向锥形瓶中加入1，4_ 二氧六环10mL，混勻。将磁力搅拌器放入反应器后把锥形瓶 放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧瓶置于25°C水浴，开启搅拌器，约5min后，保持搅拌 状态，向反应器内逐滴加入D溶液5mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4h，即得恩拉霉素 完全抗原混合液；透析袋前处理取20cm的透析袋，将其置于E溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷后用 蒸馏水冲洗:3min将其洗净，另取IOOcm长的棉线一根，用其一端将透析袋的一端扎紧，保证 不会漏液，保存在4°C去离子水中备用；透析将恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口转移至透析袋内，且将透析袋封口，悬于盛 有适量蒸馏水的大烧杯中，在4°C冰箱内开始透析，透析72h，每天换水2次，最后使用冷冻 干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到恩拉霉素完全抗原恩拉霉素-牛血清白蛋白；
2.恩拉霉素完全人工抗原的鉴定恩拉霉素完全人工抗原采用分光光度法鉴定其偶 联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计 算摩尔吸光系数数ε，再测定恩拉霉素完全人工抗原的偶联比。
全文摘要
一种恩拉霉素完全抗原的合成方法，属于有机化学及免疫化学技术领域。本发明以恩拉霉素为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了恩拉霉素的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全用于酶免疫分析，为相关的酶免疫分析的检测快速、操作简便、降低成本提供技术基础。
文档编号G01N33/53GK102079786SQ20101055643
公开日2011年6月1日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者严玉宝, 余华, 叶健强, 周岷江, 崔鹏博, 廖党金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李红, 胡娟, 谢晶, 赵素君, 陈世界 申请人:严玉宝, 余华, 叶健强, 周岷江, 崔鹏博, 廖党金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李红, 胡娟, 谢晶, 赵素君, 陈世界