专利名称：检测白果过敏蛋白的双抗体夹心elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法。
背景技术：
食物过敏是临床上最常见、最重要的过敏性疾患之一。食物过敏反应是世界各地 普遍存在的一个严重问题。许多人在直接或间接接触这些过敏原之后，会因过敏而患上消 化道症状、皮肤粘膜症状和呼吸道症状等，有时甚至产生危及生命的过敏性休克。据资料显 示，世界范围内1 % 3 %的成年人和高达5 % 8 %的儿童被食物过敏所困扰，因此食物过 敏已成为国际社会关注的一个食品安全问题。食品过敏原进入机体后，免疫系统针对这些 过敏原产生特异性IgE和IgG抗体，这些抗体与过敏原颗粒结合形成免疫复合物，引起全身 组织的炎症反应。预防和治疗食品过敏反应性疾病的一项重要前提就是检测患者对何种过 敏原过敏。作为世界白果的主要产出国，我国白果受到各国消费者的青睐。但一直以来，由于 白果的过敏性，在食用上，只能被动地避免这种危害，避免进食生银杏种仁，避免一次性进 食量过多。这种被动的和“估计式”的食用，不仅不能满足人们的消费和食用需求，而且因 加工和检测技术滞后等的原因，给白果食品带来极大的安全隐患。因此，建立一种快速而且 行之有效的白果致敏原检测方法迫在眉睫。

发明内容
本发明提供一种检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法，操作简便，可以快 速、高效地检测食品中含有的白果过敏蛋白。所述检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法包括以下步骤(1)白果蛋白提取取白果lkg，经冻干处理后研磨，加入5 7倍体积石油醚脱脂，用pH 8.5， 0. 15mol/LTris-HCl溶液提取白果蛋白，经冷冻离心后得到蛋白上清液，经过40% -80%饱 和度的硫酸铵沉淀，再次冷冻离心，得到沉淀用0. Olmol/L、pH7. 4磷酸盐缓冲液溶解，并用 所述磷酸盐缓冲液进行透析，透析完全后，冷冻干燥，得到白果蛋白提取物；所述白果蛋白 提取物用上述磷酸盐缓冲液溶解，得到白果蛋白提取物溶液；(2)鼠源过敏原特异性抗体IgE的制备小鼠经lOOmg/mL白果蛋白提取物溶液经口灌胃致敏、200mg/mL白果蛋白提取物 溶液腹腔注射激发，激发后Ih小鼠眼眶取血，分离小鼠抗血清，从小鼠抗血清中分离得到 鼠源过敏原特异性抗体IgE ；(3)白果过敏蛋白的检测将鼠源过敏原特异性抗体IgE固定在载体上；加入待测样本，使其中可能存在的 过敏原与鼠源过敏原特异性抗体IgE结合，形成结合物；再加入酶标记二抗，使其与鼠源过 敏原特异性抗体IgE结合成为复合物；最后显色剂显色，根据颜色变化判定样本中过敏蛋
3白的存在与否及过敏蛋白浓度。步骤(2)中，从小鼠抗血清中分离得到鼠源过敏原特异性抗体IgE的方法为取小 鼠抗血清5mL，加入等量生理盐水，摇勻后，缓慢加入硫酸铵使终浓度为20%，沉降后离心， 除去纤维蛋白，在上清液中继续加入硫酸铵至浓度为50%，沉降后离心，沉淀溶解于IOmL 的生理盐水中，加入硫酸铵至终浓度为33%，沉降后离心，弃上清，以33%饱和度的硫酸按 溶液洗涤沉淀两次，沉淀溶解于IOmL生理盐水中，装入透析袋，在生理盐水中透析过夜，得 到鼠源过敏原抗体。待测样本可以采用上述得到白果蛋白提取物的同样方法进行制备，优选的制备方 法为取待测物lg，用PH 8.5,0. 15mol/L Tris-HCl溶液提取白果蛋白，经冷冻离心后得到 蛋白上清液，经过40% -80%饱和度的硫酸铵沉淀，再次冷冻离心，得到沉淀用0. Olmol/L、 pH7. 4磷酸盐缓冲液溶解，并用所述磷酸盐缓冲液进行透析，透析完全后，冷冻干燥，得到白 果蛋白待测样品；所述白果蛋白待测样品用上述磷酸盐缓冲液溶解，得到待测样本。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)是酶免疫测 定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯 微量反应板表面)，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成 分洗除。由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛 应用。ELISA法现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等 方面的免疫诊断，也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。ELISA法不仅适用于临 床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行 病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一 种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，从而使其 成为最广泛应用的检测方法之一。常用的ELISA法有间接法和双抗体夹心法，前者用于检 测特异抗体，后者用于测定抗原。双抗体夹心ELISA方法的操作步骤如图1所示。本发明提供了一种能够大量筛选白果及其制品中过敏蛋白的方法，具有以下优占.
^ \\\ ·1.该方法灵敏度较高，白果蛋白的最低检出限为1.87yg/mL，对白果过敏蛋白具 有特异性，且精确度较高，批间误差及批内误差均小于10%。2.该方法操作简便，快速，结果准确。3.使用可拆卸式的酶标板时，单个样品或多样品、单项目或多项目可自由检测，并 根据客户需要随时调整项目。4.该方法分析可采用酶标仪分析，可实现自动化，检测数据可信，严谨。5.检测成本较国外专门的分析仪器和试剂低的多，便于推广和使用。


图1是双抗体夹心ELISA方法的操作步骤。
具体实施例方式实施例1取白果1kg，冷冻干燥后，研磨过筛，5倍体积石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油
4醚完全挥发后，以1 20(w/v)的比例加入pH 8.5,0. 15mol/L Tris-HCl溶液进行蛋白 提取，4°C下磁力搅拌24h。12000r/min冷冻离心20min，上清液通过40% -80%饱和度的 (NH4)2SO4 沉淀，12000r/min 离心 IOmin,沉淀用 0. 01mol/L、ρΗ7· 4 磷酸盐缓冲液(PBS)溶 解，并用PBS进行透析。透析完全后将白果蛋白冷冻干燥，得到白果蛋白提取物55g，所述白 果蛋白提取物用上述磷酸盐缓冲液溶解，得到白果蛋白提取物溶液；小鼠经100mg/ml白果蛋白提取物溶液经口灌胃致敏、200mg/ml白果蛋白提取物 溶液腹腔注射激发，激发后Ih小鼠眼眶取血，分离血清。取小鼠抗血清5mL，加入等量生理 盐水，摇勻后，缓慢加入硫酸铵使终浓度为20%，边加边摇勻，充分混合后，置4°C冰箱内沉 降30min。取出后3000rpm离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。在上清液中继续加入硫 酸铵至浓度为50%，边加边摇勻，充分混合后，置4°C冰箱内沉降30min，取出后5000rpm离 心30min，沉淀溶解于IOml的生理盐水中，加入硫酸铵至终浓度为33%，充分混勻后置4°C 冰箱内沉降30min。取出后3000rpm离心20min，弃上清，以33%饱和度的硫酸按溶液洗涤 沉淀两次。沉淀溶解于IOmL生理盐水中，装入透析袋，在生理盐水中透析过夜，得到鼠源过 敏原特异性抗体IgE 4.2ml。以0.01M，pH7.4的PBS包被鼠源过敏原特异性抗体IgE(l 400)，加入酶标板中， 100 μ 1/孔，4°C包被12h，使鼠源过敏原特异性抗体IgE和酶标板孔紧密结合；包被后用洗 涤液(PBST)洗板3次，每孔再加200yL，3%牛血清白蛋白作为封闭液，37°C温浴2h。封闭 结束在酶标板孔内加入白果蛋白提取物溶液(以白果蛋白提取物与PBS缓冲液的质量体积 比为稀释倍数)，100μ 1/孔，37°C条件下温育lh。使白果中可能存在的过敏原与鼠源抗体 特异性结合，形成结合物；接着加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgE(Sigma公司生产)， 100 μ 1/孔，37°C温浴lh。使其与鼠源过敏原特异性抗体IgE结合成为复合物；最后在形 成的复合物中加入显色剂对苯二甲醛溶液，每孔加50μ 1，37°C温浴30min，在辣根过氧化 物酶作用下，显色剂发生颜色变化，加入50μ l，2mol/L的H2SO4终止反应，根据颜色深浅或 OD492值大小判定样品中过敏原的存在及浓度大小，结果判定计算待检测孔与阴性对照孔 的OD492之比(P/N)，当P/N彡2. 1时，为阳性；当P/N < 2. 1，为阴性。表1中结果为阳性 时，白果蛋白提取物溶液的最大稀释倍数为1600，此白果蛋白溶液经凯氏定氮分析，结果表 明白果蛋白浓度为1.87yg/ml。表1双抗体夹心ELISA灵敏度检测
测定指标白果蛋白提取物浮 液的稀释倍数1:2001:4001:8001:16001:3200阳性血清(OD492)0.6380.3990.2580.2010.098阴性血清(OD492)0.0820.0760.0710.0630.059P/N7.7815.2503.6343.1921.66权利要求
一种检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于包括以下步骤(1)白果蛋白提取取白果1kg，经冻干处理后研磨，加入5～7倍体积石油醚脱脂，用pH 8.5，0.15mol/LTris HCl溶液提取白果蛋白，经冷冻离心后得到蛋白上清液，经过40％ 80％饱和度的硫酸铵沉淀，再次冷冻离心，得到沉淀用0.01mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，并用所述磷酸盐缓冲液进行透析，透析完全后，冷冻干燥，得到白果蛋白提取物；所述白果蛋白提取物用上述磷酸盐缓冲液溶解，得到白果蛋白提取物溶液；(2)鼠源过敏原特异性抗体IgE的制备小鼠经100mg/ml白果蛋白提取物溶液经口灌胃致敏、200mg/ml白果蛋白提取物溶液腹腔注射激发，激发后1h小鼠眼眶取血，分离小鼠抗血清，从小鼠抗血清中分离得到鼠源过敏原特异性抗体IgE；(3)白果过敏蛋白的检测将鼠源过敏原特异性抗体IgE固定在载体上；加入待测样本，使其中可能存在的过敏原与鼠源过敏原特异性抗体IgE结合，形成结合物；再加入酶标记二抗，使其与鼠源过敏原特异性抗体IgE结合成为复合物；最后显色剂显色，根据颜色变化判定样本中过敏蛋白的存在与否及过敏蛋白浓度。
2.如权利要求1所述的检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于步骤 (2)中，从小鼠抗血清中分离得到鼠源过敏原特异性抗体IgE的方法为取小鼠抗血清5mL， 加入等量生理盐水，摇勻后，缓慢加入硫酸铵使终浓度为20%，沉降后离心，除去纤维蛋白， 在上清液中继续加入硫酸铵至浓度为50%，沉降后离心，沉淀溶解于IOmL的生理盐水中， 加入硫酸铵至终浓度为33%，沉降后离心，弃上清，以33%饱和度的硫酸按溶液洗涤沉淀 两次，沉淀溶解于IOmL生理盐水中，装入透析袋，在生理盐水中透析过夜，得到鼠源过敏原 抗体。
3.如权利要求1所述的检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于所述 待测样本的制备方法为取待测物lg，用PH 8.5,0. 15mol/L Tris-HCl溶液提取白果蛋白， 经冷冻离心后得到蛋白上清液，经过40% -80%饱和度的硫酸铵沉淀，再次冷冻离心，得到 沉淀用0. Olmol/L、pH7. 4磷酸盐缓冲液溶解，并用所述磷酸盐缓冲液进行透析，透析完全 后，冷冻干燥，得到白果蛋白待测样品；所述白果蛋白待测样品用上述磷酸盐缓冲液溶解， 得到待测样本。
全文摘要
本发明涉及检测白果过敏蛋白的双抗体夹心ELISA方法，包括以下步骤(1)白果蛋白提取取白果1kg，经冻干处理后研磨，加入5～7倍体积石油醚脱脂，用pH 8.5，0.15mol/LTris-HCl溶液提取白果蛋白，经冷冻离心后得到蛋白上清液，经过40％-80％饱和度的硫酸铵沉淀，再次冷冻离心，得到沉淀用0.01mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，并用所述磷酸盐缓冲液进行透析，透析完全后，冷冻干燥，得到白果蛋白提取物；所述白果蛋白提取物用上述磷酸盐缓冲液溶解，得到白果蛋白提取物溶液；(2)鼠源过敏原特异性抗体IgE的制备(3)双抗体夹心ELISA方法检测白果过敏蛋白。本发明能筛选白果及其制品中过敏蛋白。
文档编号G01N1/28GK101936999SQ20101023889
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者吴彩娥, 曹福亮, 李婷婷, 李莹莹, 范龚健 申请人:南京林业大学