专利名称：一种可增强蛋白质凝胶电泳区带分辨率和信号强度的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白检测技术领域，是一种结合抗相应蛋白质的抗体和显示技术，可增强凝胶电泳分离的蛋白质区带的可见性和信号强度的方法。
背景技术：
对于动物或人源的实体器官制备的匀浆混合物(液)、细胞裂解混合物以及血清等各种样本中所含的蛋白质种类和蛋白质分子相对大小的分析与比较，聚丙烯凝胶电泳(如SDS-PAGE)是目前临床和实验室研究常用的技术。经过聚丙烯凝胶电泳，可以大致将混合物样本中各蛋白质分离开来，再对凝胶辅以考马斯亮蓝染色，可以大致判别所要分离的蛋白质分子的大致位置。然而，聚丙烯凝胶电泳仅仅将一个混合物样本(如实体器官或血清)中的蛋白质加以分离，但不能改变某一目的蛋白的相对含量。如果某一目的蛋白质的丰度很低，所分离蛋白质显色的区带的信号很弱，就给检测与分析带来一定的困难。这在用常规样本处理方法时经常会碰到的问题。

发明内容
本发明提供一种可增强蛋白质凝胶电泳区带分辨率或增强转移蛋白质印迹信号强度的方法。本发明是对现有检测方法的改进。关键的改进之处在于对制备的检测样本液先进行丙酮处理，然后再进行电泳分离与显色，这样所分离得到的蛋白质区带的显色信号明显增强(无论用考马斯亮蓝染色或转移至硝酸纤维素膜再辅以化学发光显色)，使低丰度蛋白质有可能被发现，这就为进一步分析判断提供了方便。本发明方法包括待测蛋白质样本的制备、聚丙烯凝胶电泳的分离以及蛋白质区带的显色，其特征在于所说的待测蛋白质样本是指动物组织匀浆液或细胞培养液、细菌裂解液、动物体液(血浆、血清)经丙酮处理过的蛋白质样本，处理条件为将匀浆液或体液或培养液或裂解液离心取上清，将上清与丙酮以1∶5(v/v)混匀，置-20℃2小时以上或过夜，离心取沉淀，将沉淀溶解于样本缓冲液[60mM Tris.Cl pH6.8，25％甘油，2％十二烷基磺酸钠(SDS)，14.4mM 2-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝]，煮沸5分钟，离心取上清即为蛋白质样本液；所说的聚丙烯凝胶电泳所用的是SDS-PAGE凝胶分离系统，每孔点样量约80μg蛋白质；所说的蛋白质区带显色是指考马斯亮蓝染色或转移的蛋白质区带免疫印迹和化学发光显色。
以实体器官制备的匀浆样本为例，本发明具体检测过程如下1.组织匀浆制备按常规将器官组织如小鼠脾脏、肺脏剪碎，将碎块放入匀浆器，加入4℃组织裂解液进行匀浆处理.组织裂解液为50mM Tris.Cl(pH8.0)，150mM NaCl，0.02％NaN3，0.1％SDS，1％NP-40，1μg/ml抗蛋白酶肽(aprotinin)，100μg/ml PMSF，1％2-巯基乙醇。
2.组织蛋白质的初步提取和丙酮处理将上述匀浆液离心(8000rpm，4℃，离心5分钟)，吸取上清.将上清与丙酮按照1∶5(v/v)混匀。该混合物在-20℃放置至少2小时，以10000rpm离心5分钟，弃上清，得沉淀物。
3.蛋白质的凝胶电泳分离将沉淀物溶于样本缓冲液[60mM Tris.Cl pH6.8，25％甘油，2％十二烷基磺酸钠(SDS)，14.4mM 2-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝]，煮沸5分钟。将煮沸过的样本高速离心，取上清，测定上清中的蛋白质浓度，用SDS-PAGE凝胶系统进行蛋白电泳分离，点样量为每孔约含80μg蛋白质。并将上述未经丙酮处理过的组织匀浆样本在另一块凝胶板上同时进行电泳分离，以作为实验对照。
4.考马斯亮蓝染色将上述凝胶用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250)染色30分钟，染色液含考马斯亮蓝1‰，(w/v)；45％甲醇，(v/v)；10％冰醋酸，(v/v)，再在脱色液中脱色，脱色液的含10％甲醇，10％冰醋酸，(v/v)，直至背景清楚为止。
5.电转移与免疫印迹将凝胶电泳分离的蛋白质按照常规电转移方法转移到硝酸纤维薄膜上(参见分子克隆实验指南)，350mA，50min，转移液配方39mM甘氨酸，48mM Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇。再放入封闭液封闭1.5h，封闭液为含5％脱脂奶粉的TBS-T(pH7.4)缓冲液。再按常规在硝酸纤维素膜上加兔抗小鼠Toll样受体2(TLR-2)，caspase-3和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF-6)抗体，每种抗体的稀释度为1∶800，置4℃2小时，用TBS-T(pH7.4)缓冲液将多余的一抗洗去。再加羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG(稀释度1∶50)，置4℃2小时，用TBS-T(pH7.4)缓冲液将多余的标记抗体洗去。
6.增强化学发光法显示转移的蛋白质区带将上述硝酸纤维素膜在暗室里加上化学发光反应液，再在硝酸纤维素膜上覆盖X-光片，按常规曝光、显影、定影。X-光片晾干后，将显示的蛋白质区带用扫描仪记录结果，再行分析。
对于人源性标本，如外科手术存留的脾、肾、肝、肺等实体器官，检测分析方法同上。
对于血液以及细胞培养的上清样本的处理可先将血清、血浆或细胞培养上清液与丙酮按照体积1∶5混合均匀，其余操作同上。对于工程菌基因表达的蛋白质也参照上述方法处理。
具体实施例方式现结合实施例对本发明作详细描述.
试剂与材料(1)组织裂解液50mM Tris.Cl(pH8.0)，150mM NaCl，0.02％NaN3，0.1％SDS，1％NP-40，1μg/ml抗蛋白酶肽(aprotinin)，100μg/ml PMSF，1％2-巯基乙醇(2)丙酮处理液实验室常用分析纯丙酮，(上海化学试剂供应站)(3)化学发光试剂盒商业订购，Pufei Biotechnology Co.(中国，上海)；X-光胶片富士医用X-光胶片(super-RX，Ref.03G050)(4)兔抗小鼠Toll样受体2(TLR-2)，caspase-3和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF-6)抗体商业订购，Santa Cruz biotechnology(USA)(5)羊抗兔IgG-HRP标记物，和抗小鼠IgG-碱性磷酸酶交联物从华美生物技术公司购买(中国，上海)。
实施例1.检测小鼠脾脏匀浆样本中Caspase-3.
1.制备脾脏匀浆样本。
取小鼠脾脏，在冰水包围的匀浆器中进行匀浆处理。离心取上清。将上清样本分为两部分，一部分用常规方法处理，另一部分用本发明方法处理。
2.样本处理(1)常规方法处理将上述脾脏匀浆上清，进行蛋白质浓度测定(Bradford法检测，下同)，然后将一定浓度的蛋白质与电泳上样缓冲液混合，待用。
(2)本发明方法处理将脾脏匀浆上清，与丙酮按1∶5(v/v)混匀，再置-20℃过夜。离心(离心速度为10000rpm)，弃上清，加入PBS(pH7.4)将沉淀物溶解成蛋白质混悬液。测定该混悬液蛋白质的浓度，然后将一定浓度的蛋白质与电泳上样缓冲液混合，待用。
3.电泳将上述用两种不同方法处理的脾脏匀浆样本液分别加样于两块并列的聚丙烯凝胶板进行电泳分离(直流100V，1.5h)，加样量为每孔大约80μg的蛋白质。
4.显色处理有两种处理方法，一种为将凝胶直接染色，另一种为凝胶通过电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上再显色。
(1)聚丙烯凝胶的直接染色按常规将上述凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色30分钟，再用脱色液脱色，使得背景具有较好的反差。
(2)将电泳带由聚丙烯凝胶转移至硝酸纤维素膜，再进行免疫印迹和对印迹物的化学发光显色。
方法是将凝胶中的蛋白质区带用电转移法转移至硝酸纤维素薄膜，再按照免疫印迹程序，将一抗(兔抗鼠Caspase-3，抗体稀释度为1∶800)和硝酸纤维素膜(以下简称转移膜)放入微型塑料袋中进行免疫杂交反应，4℃，2小时。以TBS-T(pH7.4)洗涤转移膜，将多余的兔抗鼠caspase-3 IgG洗去。然后加入辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG(稀释度为1∶50)，与转移膜进行识别反应(4℃，2小时)，再用TBS-T(pH7.4)洗涤4次，每次3分钟，将多余的辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG彻底洗去后，在转移膜上加化学发光试剂显色。一般地，每平方厘米的转移膜上加化学发光试剂0.125ml，使之均匀地铺在转移膜上。迅速在暗室用食品保鲜薄膜将转移膜包裹，在转移膜的蛋白质面一侧，覆盖上X-光感光胶片进行感光反应。完成感光后，将感光胶片迅速在暗室进行显影和定影，显现转移蛋白质区带。
检测小鼠肺匀浆样本中Caspase-3及脾、肺中的TLR-2或TRAF-6的方法同实施例1。两种处理方法的显色图谱见

图1，蛋白质区带显色密度对比见表1，表2。
表1.本发明方法与常规方法处理肺匀浆蛋白质电泳区带密度对比表

表2.本发明方法与常规方法处理脾匀浆蛋白质电泳区带密度对比表

图1中，凝胶A、B、C分别用caspase-3、Toll样受体2(TLR-2)和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF-6)抗体检测转移在硝酸纤维素膜上的caspase-3、TLR-2、TRAF-6蛋白质区带。泳道1、3是采用本发明方法处理的样本，泳道2、4是采用常规方法处理的样本。其中泳道1、2是肺脏匀浆样本，泳道3、4是脾脏匀浆样本。由图1可见，本发明方法与常规方法处理的样本相比，其蛋白质电泳区带的丰度明显增强。经电转移、免疫印迹及增强化学发光显色后，本发明方法处理的样本的蛋白质电泳区带显然比常规方法处理的样本的蛋白质电泳区带深。
表1为本发明方法与常规方法处理肺匀浆蛋白质电泳区带密度对比表。由表1可见，肺匀浆处理的蛋白样本中，分离的TLR-2比常规样本处理法的信号增强1.73倍；caspase-3信号增强1.60倍；而TRAF-6的蛋白区带的信号增强2.46倍。
表2为本发明方法与常规方法处理脾匀浆蛋白质电泳区带密度对比表。由表2可见，脾脏的样本经过本方法处理后，分离的TLR-2比常规样本处理法的信号增强5.37倍；caspase-3信号增强1.84倍；而TRAF-6的蛋白区带的信号增强1.54倍。
由此可见，本发明的方法能明显增强蛋白质区带显色信号强度。
权利要求
1.一种可增强蛋白质凝胶电泳区带分辨率和信号强度的方法，包括待测蛋白质样本的制备、聚丙烯凝胶电泳的分离以及蛋白质区带的显色，其特征在于所说的待测蛋白质样本是指动物组织匀浆液或细胞培养液、细菌裂解液、动物体液(血浆、血清)经丙酮处理过的蛋白质样本，处理条件为将匀浆液或体液或培养液或裂解液离心取上清，将上清与丙酮以1∶5(v/v)混匀，置-20℃2小时以上或过夜，离心取沉淀，将沉淀溶解于样本缓冲液[60mMTris.Cl pH6.8，25％甘油，2％十二烷基磺酸钠(SDS)，14.4mM 2-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝]，煮沸5分钟，离心取上清即为蛋白质样本液；所说的聚丙烯凝胶电泳所用的是SDS-PAGE凝胶分离系统，每孔点样量约80μg蛋白质；所说的蛋白质区带显色是指考马斯亮蓝染色或转移的蛋白质区带免疫印迹和化学发光显色。
全文摘要
本发明涉及蛋白质检测技术领域，是一种可增强蛋白质凝胶电泳区带分辨率和信号强度的方法。本发明方法包括蛋白质样本制备、聚丙烯凝胶电泳的分离和蛋白质区带的显色，其特征在于对检测的蛋白质样本用丙酮处理后再行电泳分离，这样可明显增强蛋白质显色信号强度，有利于检测样本中低丰度蛋白质的被发现，这就为进一步分析判断提供了方便。
文档编号G01N27/26GK1588032SQ20041006677
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者栾洁, 周炳荣, 戚中田 申请人:中国人民解放军第二军医大学