专利名称：：筛选抗体表达细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术的抗体生成领域。本发明的一个目的是设计一种筛选抗体生成细胞的方法以及对细胞系稳定性进行评估的方法。筛选相对于非抗体生成细胞的抗体生成细胞，特别是筛选一种高效抗体生成细胞系在任何生物过程的研发过程均是非常重要的第一步。对于由动物细胞生成蛋白质，这些传统上筛选出的细胞系已经经过多轮有限稀释克隆以及随后的产品分析所分离出来。这种传统过程非常耗时而且比较昂贵。为了提高克隆的理论可信度需要进行两轮克隆。克隆对于避免由于低生成力变种所导致的高产细胞的过度生长是很重要的，所述低生成力变种通常具有比高产细胞还要高的生长率。总体上，完成传统过程需要超过8个月的时间。而且，实际需要考虑的事项限制了事实上所筛选出的细胞数，这就使得只能凭运气才能检测出低丰度的高产细胞克隆。在研发过程中，对细胞系稳定性进行评价需要进一步的分析克隆，其需要花费6到7个星期的时间。另外，分析克隆涉及对200-300个克隆进行评估，与可以借助流式细胞术对数千个克隆所进行的分析相比，其提供了一个关于非生成群体的大小的更加详细和准确的图象。以前所报道的分泌检测的灵敏度较低，不足以对不同的亚种群进行分辨，从而不能对不同的亚种群进行量化。流式细胞术(FC)使得对大量细胞的生产力进行监测成为可能，并且可以分离出适当的单个细胞。流式细胞术需要用荧光团标记细胞，在流式细胞术中对细胞的荧光进行定量，并且与所需要的特性相关联。然而，在细胞系表面所显示的膜结合抗体的数量与该细胞系的可溶性抗体的分泌率之间的相关性不是很好(Meilhoc等，流式细胞计数测量表面IgG在低血清或无血清培养基中的鼠杂交瘤细胞系合成和分泌单克隆抗体的动力学分析中的应用(ApplicationofflowcytometricmeasurementofsurfaceIgGinkineticanalysisofmonoclonalantibodysynthesisandsecretionbymurinehybridomacell-lineinlowserumandserum-freemedia)，Hybridoma9，67-175)。因此，简单地用检测抗体对所显示的抗体进行染色不能有效地分离出高产的细胞克隆。为了解决该问题，选择了两个本质上完全不同的方法，以直接筛选分泌抗体的高效生成细胞。在第一种方法中，单个细胞及其分泌的抗体被包囊在凝胶滴中。然后对整个凝胶滴进行标记，并通过FC进行分类。该方法的缺点在于，该方法对用户来说不是很友好，即为了确保凝胶滴中只含有单个细胞，只有5％的凝胶滴中包含一个细胞，而所分析的大约95％的凝胶颗粒中不含细胞。另外，包囊/去包囊可以导致一些通常用于重组蛋白质表达的细胞类型的生存能力降低，最显著的是骨髓瘤(meyeloma)NSO细胞。在第二种方法中，通过在细胞表面人工制造出亲合位点或受体，以保留所分泌的受体，然后用FC评估所分泌的抗体数量。Holmes等(J.ofImmunol.methods，230(1999)，141-147)描述了一种在室温下对质膜蛋白进行生物素化的分析方法。生物素促进第一抗生物素蛋白和第二生物素化捕获抗体的结合。所述捕获抗体识别NSO细胞系所分泌的抗体，并将所述抗体固定于细胞表面。将带有被捕获的分泌抗体的细胞与第三个用荧光标记的检测抗体一起培养，用FC进行荧光检测并对低丰度高产出的细胞克隆进行细胞分类。向培养基中加入一种粘性剂例如胶质以防止克隆之间发生干扰(即生成细胞所产生的分泌抗体扩散和结合到非生成细胞或者低生成细胞)已经公开的方法的主要缺点在于，其对区分高产和低产细胞，以及对低丰度高产细胞的精确分类具有相对较低的灵敏度。采用已公开的方法不可能检测到给定细胞系所分泌的嵌合抗体通过捕获抗体结合到细胞表面。另外，这种捕获抗体必须来自包括胎儿血清在内的哺乳动物细胞培养物，并且通常用牛血清白蛋白进行稳定，并用作商业抗体制品。因此，使用捕获抗体会导致克隆细胞培养物有可能被病毒或BSE污染的风险。本发明的目的是设计出另外一种方法，能有效地从细胞克隆库中检测和筛选出适宜的表达抗体的单个细胞。此目的可以通过独立权利要求1所述的方法达到。附图中显示了本发明的可能实施例图1a分泌抗体的捕获和检测原理的示意图，b捕获抗体和A蛋白的结合能力的比较图2对本发明的分泌检测的样品进行荧光细胞计数(FC)分析。图3对分泌检测的样品进行荧光细胞计数(FC)分析，其中比较了A蛋白和抗人IgG抗体捕获分泌抗体的效果。根据本发明，用于筛选分泌第一抗体的细胞的方法包括以下步骤a)将抗生物素蛋白连接至细胞的细胞表面；b)将细胞与一种生物素化多肽进行培养，所述多肽至少包括一个G蛋白或A蛋白的功能性抗体结合域；c)将细胞与第二抗体进行培养，所述第二抗体用荧光标记，其识别并结合第一抗体的抗原表位，培养后，将未结合的第二抗体冲洗掉；d)筛选出结合有一定量的第二抗体的荧光标记的细胞，荧光分析流式细胞术(FC)是优选且方便的。FC允许随后对荧光标记的细胞进行分类。分泌抗体的生成细胞可以是任何用来分泌抗体的细胞，例如淋巴细胞杂交瘤、骨髓瘤或者CHO细胞。更优选地是，生成细胞是一种骨髓瘤细胞系，最优选地是，它是一种NSO细胞系。因此，抗体可以是任何天然生成的抗体或基因工程抗体或者抗体片段，例如嵌合或单价或双特异性抗体，包括近期公知的骆驼和羊驼的单重链抗体(TrendsBiochem.Scien.(2001)，26，230)。根据本发明，这些抗体优选含有高亲和力细菌G蛋白或A蛋白的结合位点，正如不同类(IgG，IgA，IgE，IgM)免疫球蛋白(Ig)的天然Fc部分的位点。优选地，根据本发明的抗体包含IgG的Fc部分。最优选地是，根据本发明的抗体是IgG或者是包含IgG的至少一个重链。根据本发明的抗生物素蛋白是常规的鸟类抗生物素蛋白(大约67kD)，或者其它任何功能性的、即结合生物素的同源物质，例如来自链霉菌属的链霉抗生物素(60kD)，或任何天然生成的抗生物素的化学或基因工程变种。这些变种的一个例子是Neutravidin(Pierce，Pockford/IL)，该物质为不含糖的去糖基抗生物素蛋白，pI在6-7之间，可以对其进行进一步的改造使其不包含链霉抗生物素的三肽RYD区域，所述区域可以介导细胞表面受体的非特异性结合。优选地是，根据本发明的抗生物素蛋白是鸟类抗生物素蛋白，去糖基化的鸟类抗生物素蛋白，或是一种neutravidine。最佳的是，根据本发明的抗生物素蛋白是neutravidine。这些neutravidine显示具有最大的生物素结合能力，其结合能力大约为14微克生物素/毫克蛋白。抗生物素蛋白能通过例如交联的方法连接到细胞表面。可以使用本领域公知的常见的双功能交联剂，其包含反应基团例如环氧乙烷，乙醛，琥珀酸亚胺或者光反应化合物，例如N-[N-4-叠氮基-四氟苯甲酰基]生物胞素氧基，SAND(磺基琥珀酰亚胺基2-[间叠氮基-邻硝基苯甲酰氨基]-乙基-1，3-二硫代丙酸)。不言而喻的是，或者是与脂质的活性基团(例如磷酸丝氨酸的羟基官能团)，或者更可能的是与膜蛋白表面上的反应基团发生所述交联。在一个优选实施例中，抗生物素蛋白通过带有生物素标记的单功能交联剂，将生物素部分共价地连接到细胞表面，然后非共价地附着到细胞表面上。抗生物素蛋白识别和结合至细胞表面的生物素部分。更优选地是，上述生物素化过程在低于10℃的温度下完成，最佳是在大约4℃或者更低。在此温度下，生物素化的效率随着时间的延长而增加。有利地是，细胞表面的生物素化的反应时间在30-60分钟内。如果抗生物素蛋白通过细胞表面的生物素标记被捕获到细胞表面，更加优选地是这些细胞在含有至少50μg/ml，更优选地是100μg/ml的抗生物素蛋白溶液中进行培养，术语“抗生物素蛋白”是指根据本发明的抗生物素蛋白。抗生物素蛋白分子通常具有4个生物素结合位点。如果用生物素标记对细胞表面进行包被，然后以超出共价连接于细胞表面的生物素标记的量，培养抗生物素蛋白，一个生物素标记将结合一个抗生物素分子，留有三个空着的生物素标记结合位点。进一步优选地是，将共价连接于细胞表面并使抗生物素蛋白非共价地固定在细胞表面上的生物素部分通过间隔基部分连接至细胞表面，所述间隔部分例如直链烷基链，其延伸超过10，更优选地是至少20，最佳的是至少30。根据本发明的方法的下一步骤中，将包含至少一个抗体结合域的生物素化多肽与抗生物素蛋白标记的细胞进行培养，并且结合至连接在细胞表面上的抗生物素蛋白。根据本发明，抗体结合域并不是衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的抗原结合部位或其互补的决定部位。它是一种非免疫球蛋白源的抗体结合多肽。这种多肽可以例如是A蛋白(Surolia，A.等，1982，A蛋白天然的遍在抗体(ProteinANature’sunversal，antibody)，TIBS7，74-76；Langone，J.，1982，金黄色葡萄球菌的A蛋白和相关的免疫球蛋白受体(ProteinAofstaphylococcusaureusandrelatedimmoglobulinreceptors)，Adv.inImmunology，32p156-241)，G蛋白或蛋白L。蛋白L来自于链球菌属，其具有通过k轻链的相互作用而结合的能力，而不对抗体的抗原结合位点产生干扰(Kastern，W.等，1992，L蛋白的结构和重复的免疫球蛋白轻链结合域的鉴定(StructureofproteinLandidentificationofarepeatedimmunoglobulinlight-chainbindingdomain)，J.Biol.chem..267，12820-12825)，因而其可以结合所有种类的Ig，也可以结合单链可变片段(ScFv)和Fab片段。根据本发明，使用包含多肽的上述抗体结合域可以增强分泌检测的灵敏度，能够从低产细胞或非生成细胞中充分地区分出高产细胞克隆。本发明的分泌检测方法也能够简便、快速地评价细胞系的稳定性。在细胞系的开发过程中进行常规的细胞系稳定性评价需要对200-300个克隆进行克隆分析，这需要6到7个星期的时间。与流式细胞术相结合，作为本申请主题的检测方法具有足够的灵敏度，可以对数以千计的低产或非生成细胞的亚群体进行分辨和定量，从而可以在仅仅5小时内给出关于细胞系稳定性的信息。优选地抗体结合域来自A蛋白或G蛋白。葡萄球菌属的A蛋白和链球菌属的G蛋白是众所周知的可特异性结合于抗体Fc段的蛋白质试剂(Boyle，M.，细菌免疫球蛋白结合蛋白(BacterialImmunoglobulin-Bindingproteins)，学术出版社，圣地亚哥1990)。它们在几乎所有动物物种或亚纲的IgG亲和纯化的生物技术中具有广泛的应用。葡萄球菌属的A蛋白与IgGFc片段的结合位点与链球菌属的G蛋白相似，其包括两种情况，例如Deisenhofer等(1981，Biochemistry202361-2370)和Sauer-Eriksson等(1995，Structure3，265-278)表述的人IgG-Fc残基252-254，433-435和311。而且，WO00/7428中描述了一种能结合细菌G蛋白的B1域多肽的分离抗体，其能结合IgG的Fab片段，但是不能结合IgG的Fc片段。使用B1域是本发明另一个优选实施例。通常，根据本发明的抗体结合域被用作分离结合域或者其它多肽部分的融合蛋白。其也可以融合例如A蛋白，G，L的几个抗体结合域，或者是融合经氨基酸取代、缺失、插入而人工制成的功能性变种的几个抗体结合域。也可能采用例如A蛋白、G、L等各自的变种，所述变种带有缺失或被截短。优选地，所述多肽不含有或仅含有1-2个糖基位点，更优选地是它不含有任何糖类。优选地，在本发明中采用含有至少四个抗体结合点的多肽，最佳地是具有42kD分子量的完整的A蛋白。这些完整的A蛋白具有4-5个针对IgGFc片段的强亲合力结合位点。与针对生物素部分的多价抗生物素蛋白一起，所述多肽使所结合的分泌抗体的量显著放大，从而使信号得到放大。多肽的生物素化可以通过以上所描述的细胞表面生物素化的任一方法来获得。另外，也可以将生物素部分结合至酪胺上，然后将其共价连接至多肽上，所述过程是在过氧化氢存在的条件下，由过氧化氢酶所产生的氧自由基催化所形成的。本发明的另一个目的是可以直接采用一种多肽-抗生物素蛋白复合物，其中多肽带有至少一个A蛋白或G蛋白的抗体结合域。多肽和蛋白质部分的交联在生化领域是众所周知的，可以通过很多试剂来完成。(Fasold等，交联蛋白质的双功能试剂(bifunctionalreagentsforthecrosslinkingofproteins)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1971)，10795-801)。例如，通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶联到赖氨酸的氨基上是本领域所公知的。本发明的定义和优选实施例同样适用此目的。优选地，生物素部分通过间隔基连至多肽上，间隔臂的长度至少是15，优选地至少22，最佳是至少30。适宜的间隔臂为例如直链烷基部分。当几种生物素化分子结合到一种抗生物素复合物上时，这种延伸的间隔臂减少了位阻现象。更加优选地是，本发明的包含多肽的抗体结合域至少携带有3个生物素部分，所述生物素部分共价结合于多肽或蛋白质上，更优选地是每个多肽或蛋白质各自有至少6个生物素部分，最佳地是6-10个生物素分子。多肽的这种生物素化程度的大小很容易由多肽中反应基团的数目(例如赖氨酸的氨基，半胱氨酸的巯基)，以及生物素试剂与进行生物素化的多肽的比例来控制。根据本发明的第二检测抗体可以是任何常见的，用荧光标记的抗体或抗体片段，其能特异性地结合所分泌的第一抗体，其细胞克隆的表达通过本发明的方法进行监控。在本发明范围内，“检测抗体”也可以解释为含有第一和第二检测抗体的任何适当的组合，而其中只有后者进行了荧光标记，这在相关技术中是经常采用的，例如ELISA技术。同样地，被第一分泌抗体识别的用荧光标记的抗原也可以用于检测。有利地是，在本发明的步骤b和步骤c之间，在细胞培养基中一段较短的干涉培养期间可以使细胞表面上的人工制得的抗体结合位点全部为分泌的抗体所饱和。优选地，根据本发明的方法，在用生物素化多肽培养细胞的过程中或者最迟在培养之后，将这些细胞在含有增粘剂的培养基中进行培养。通过人为地增加培养物的粘度，从而防止细胞之间发生交叉干扰。这些试剂可以是例如甲基纤维素，PEG，淀粉，藻类多糖，细菌或植物，或胶质。在一个优选实施例中，使用浓度至少为10％(w/w)的胶质。在另一个优选实施例中，根据本发明的方法，在用生物素化多肽培养细胞的过程中或者最迟在培养之后，在用荧光标记的抗原或抗体进行细胞染色之前，将细胞在含有非生物素化A蛋白的培养基中进行培养，或者在含有本发明的另一种非捕获性的、包含多肽的竞争性抗体结合域的培养基中进行培养，其浓度至少为0.5μg/ml，更优选地是浓度至少为4μg/ml，最优选地是浓度至少为8μg/ml。有利地是，上述非捕获性的、竞争性A蛋白或类似物与增粘剂一起结合使用，从而防止细胞之间发生交叉干扰。优选地是，根据本发明的方法，在用荧光标记的抗原或抗体进行细胞染色之前，在使所分泌的抗体结合至已固定在细胞表面上的生物素化多肽之后，在细胞中加入第三封闭抗体，例如其浓度至少为0.5到5μg/ml。所述第三封闭抗体能够结合至生物素化多肽的剩余抗体结合位点上，但是其不能被检测中所使用的、用荧光标记的第二抗原或抗体识别和结合。这种措施有利于进一步消除克隆之间的后期交叉干扰，因而提高了本发明检测的灵敏度和识别力。不言而喻，上述措施可以与其他措施结合使用，例如为了共同增强检测的识别能力和灵敏度，联合使用增粘剂和/或竞争性非生物素化A蛋白及其类似物。实施例在所有实验中，细胞都取自批培养细胞的指数生长阶段，用标准的细胞染色计数技术进行分析，它们的存活能力超过95％。1.对比实验采用由NSO骨髓瘤细胞系衍生的6A1(100)3细胞系。它是一种GS-转染的细胞系(Bebbington，C.等，1992，以谷氨酸合成酶(GS)基因作为可扩增的选择标记的来自骨髓瘤细胞的重组抗体的高水平表达(High-levelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetase(GS)geneasanamplifiableselectablemarker)，Bio/Technology10169-175)，其分泌人类嵌合IgG抗体cB372.3，所述抗体特异性结合于乳腺癌肿瘤抗原TAG73。按照Holmes等人(ibd)所公开的方法对这些细胞进行处理。然而结果令人失望，所述分泌细胞以及未经处理的阴性对照细胞系(NSO细胞系，ECACCNo.85110503)在荧光强度上并没有观察到可重复的、具有显著意义的差别。同样，对非生成性GS转染的骨髓瘤细胞系，以及在细胞外部加入人IgG进行实验，也没有观察到在平均荧光强度上存在有显著差异。2.分泌检测2.1分泌抗体的捕获图1对分泌抗体的捕获和检测原理进行了示意性地描述。分泌嵌合抗体cB72.3的6A1(100)3细胞系再次被筛选作为实验模型。分泌基质的组成如下。用25mL，pH8的PBS对1076A1(100)3细胞系进行冲洗，然后重悬浮于1mL含有1mg/mlNHS-LC-生物素的生理学标准PBS(pH8)溶液中(目录号为21336，琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基酸)正己酸酯；Pierce，罗克福德，IL/U.S.A)。接着在4℃下培养40分钟，用PBS(pH7)冲洗两次，重新悬浮于1mLPBS(pH7)中。加入128ul1mg/ml的neutravidinTM的溶液，在室温下培养细胞15分钟，接着进一步用50mLPBS(pH)洗涤。重悬浮于1mLpH7的PBS中，然后加入非生物素化的A蛋白至终浓度为1μg/mL，在室温下培养5分钟。接着加入52ul1mg/ml生物素化的A蛋白(Pierce，罗克福德，IL/U.S.A.；每个蛋白质携带6-10个生物素标记)溶液，在室温下再培养15分钟。用于培养的生物素化A蛋白的浓度并不是饱和的。独立实验证实，即使生物素化A蛋白的浓度为120μg/mL，结合仍未达到饱和(数据未显示)。接着用适当体积的纯化cB72.3IgG配制阳性对照样品，浓度为6.6μg/mL。用作阴性对照的样品由不含生物素/抗生物素蛋白/捕获A蛋白亲和基质的细胞组成。这些样品像其它样品一样进行处理，即先在分泌基质中进行培养。所有用于分泌检测的样品都进行以下程序细胞重悬于10mL分泌基质中(细胞培养基，如Holmes，P等人在“通过高产量亲合捕获表面展示技术筛选高分泌者的改进的细胞系发展”(Improvedcelllinedevelopmentbyahighthroughputaffinitycapturesurfacedisplaytechniquetoselectforhighsecretors)，J.ofImmunologicalmethods，230(1999)，141-147中所述的富含10％明胶的用于培养NSO6A1(100)-3细胞系的培养基)。该培养基还含有8μg/mL的非生物素化A蛋白(Sigma，UK)，用以捕获从生成细胞扩散出的抗体，从而防止它们结合到非生成细胞上。细胞于4℃在分泌培养基中培养15分钟。2.2荧光标记用最终稀释为1/500的鼠抗人κ轻链FITC复合物(Sigma，UK)检测所结合的分泌抗体。按照2.1进行处理的细胞在25mLPBS(pH7)中洗涤一次，加入320ul1mg/ml的鼠IgG封闭抗体(Sigma，UK)，与细胞混合，并培养5分钟。接着用25mLPBS(pH7)对细胞进行第二次洗涤，并重悬于1mLPBS中。加入5ul1mg/ml鼠抗人κ轻链FITC检测抗体(Sigma，UK)，培养15分钟，在25mLPBS中再次洗涤后，细胞重悬于1mLPBS中，用流式细胞术进行分析。2.3流式细胞术在对细胞进行如上文所述的染色后，采用激发和检测波长为488nm和515nm的CoulterEpicsEliteflow流式细胞仪对细胞进行分析。采用侧向散射光和前向散射光来确定进入的存活细胞群，测量该细胞群的荧光水平(和抗体结合数量)。(A)阴性对照(也就是没有亲和基质)、(B)具有被亲和基质捕获的分泌抗体的细胞、(C)在细胞外部加入被亲和基质捕获的纯化IgG而进行培养的阳性对照细胞都在图2中以细胞计数和荧光强度显示出来。分泌细胞B的平均荧光为19.3，其与阴性对照A相比平均荧光增加了50倍。阳性对照C的平均值为59.5，与阴性对照相比增加了125倍。表1给出了根据图2的平均荧光数值。表13.对比实施例对与细胞表面分泌抗体相结合的生物素化捕获抗体的效力与生物素化A蛋白的效力进行了比较。在比较实验中，除了在培养中使用不含有任何增粘剂的PBS，以替代所有样品的分泌基质，其他严格按照第二部分进行分泌检测，。除了之前描述的标准阴性对照(A)，阳性对照(C)，和cB72.3分泌性细胞(D)指外，用生物素化鼠抗人IgGFc特异性捕获抗体(Sigma，UK)取代生物素化A蛋白制备出另一样品(B)，其浓度为50μg/ml，培养15分钟后固定到细胞表面，该浓度接近于饱和浓度，可以与前面实验中使用的A蛋白的量进行比较。接着，样品(B)与外源加入的人IgG一起进行培养，按照上文所述的对阳性对照进行处理的步骤对样品(B)进行处理。在图3中显示了所有样品的分布，与图2一样，用流式细胞仪进行荧光分析，显示细胞计数和荧光强度(图3A阴性对照，B捕获抗体，C阳性对照，A蛋白，D分泌的cB72.3，A蛋白)。根据图3中的分布，在表2中列出荧光强度的平均数值。人IgG模型产品(样品B)的捕获抗体的使用与阴性对照细胞相比，平均荧光增加5倍。然而，当使用A蛋白(样品C)时，平均荧光增加80倍，因此证明了A蛋白比捕获抗体更加有效。当此技术用于捕获和检测所分泌的cB72.3时，A蛋白也非常有效，与阴性对照相比，平均荧光大约增加55倍。严格按照Holmes等人(ibd)所述而制得的样品与阴性对照相比，没有增加(没有给出数据)。表2比较实验B与C，D的数据，清楚地看出用A蛋白取代捕获抗体使得检测的灵敏度和结合能力显著提高。理论上，与捕获抗体相比，A蛋白应该具有两个多余的结合位点(总数4)，因而允许有双倍的分泌抗体发生结合至A蛋白上(理论上，强度增强2倍)。由于强亲和力结合抗体超出A蛋白的结合亲和力大约一阶，该期望值就构成了一个理论最大值。相反，令人惊奇的是，由于尚未知晓的原因，实际所观察到的A蛋白对捕获抗体的强度增强大约为15-20倍，大大超过了理论预期值。图1b比较了捕获抗体结合外源性加入的IgGFc部分的结合能力，以及A蛋白结合该外源性IgG的结合能力。样品基本按照本节本部分的描述进行制备，所不同的是，用于培养的捕获抗体和A蛋白的量都加倍了，以确保饱和结合。在确定体积的细胞团中加入纯化IgG抗体，以确保培养过程加入准确的预定浓度的外源IgG。权利要求1.筛选分泌第一抗体的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)将抗生物素蛋白连接到细胞的细胞表面；b)将所述细胞与含有至少一个功能性抗体结合域的生物素化多肽一起培养；c)将细胞与第二抗体或抗原一起培养，该第二抗体或抗原是荧光标记的并且识别和结合第一抗体上的抗原表位；d)筛选结合了一定量第二抗体的荧光标记的细胞，优选通过荧光分析流式细胞术进行筛选。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化多肽为G蛋白或A蛋白。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在细胞表面被共价生物素化后，优选在低于10℃进行生物素化后，将抗生物素蛋白结合到细胞表面。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在与生物素化多肽一起进行培养期间或最迟在培养之后，将细胞培养在含有增粘剂的培养基中。5.筛选分泌第一抗体的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)将抗生物素蛋白连接到细胞的细胞表面，其中，抗生物素蛋白结合于含有至少一个功能性抗体结合域的多肽，所述结构域优选来自G蛋白或A蛋白；b)将细胞与第二抗体或抗原一起培养，该第二抗体或抗原是荧光标记的并且识别和结合第一抗体上的抗原表位；c)筛选结合了一定量第二抗体的荧光标记的细胞，优选通过荧光分析流式细胞术进行筛选。全文摘要一种筛选高水平抗体生成细胞的方法，包括将A蛋白或G蛋白附着于细胞表面上的步骤，从而捕获所分泌的可溶性抗体。通过常规的方法对捕获抗体进行荧光染色，然后进行FACS分析，从而筛选出低丰度高产单细胞。文档编号G01N33/53GK1545621SQ02814754公开日2004年11月10日申请日期2002年7月19日优先权日2001年7月27日发明者A·雷切尔,R·辛格,A雷切尔申请人:隆萨集团股份公司