专利名称：一种参芪扶正注射液hplc指纹图谱的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，以及由此方法所得到的参芪扶正注射液HPLC标准指纹图谱，属于药物分析技术领域。
背景技术：
参芪扶正注射液是以扶正补气中药党参、黄芪为原料制成的中药大输液，具有益气扶正、提高机体免疫力等作用，主要用于各类肿瘤的辅助治疗，在临床实践中证实其与抗肿瘤药物联合使用时，有减毒增效的作用。同时，也是冠心病、心绞痛、中风患者较理想的治疗药物，具有广阔的临床应用前景。 对中药注射液质量控制方法的深入研究始终是保证其稳定性和临床使用安全性的最重要的问题。在公开的200610098953. I号及200710136382. O的专利申请中均报道了有关参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的报道。这两项专利申请公开中记载的方法的不足之处在于(1)供试品要通过AB-8大孔树脂柱分离纯化或者用水饱和正丁醇萃取4次随后进行浓缩等步骤制备，复杂繁琐，高温浓缩步骤容易引起成分变化，影响方法的重现性。测定有紫外吸收的酚酸类成分与无紫外吸收的皂苷类成分要用同样繁琐的方法分别制备供试品溶液，方法存在耗时长，使用有机溶剂多的缺陷。(2)指纹图谱采用多达5个非线性梯度进行测定，要用同样的条件分别测定有紫外吸收的酚酸类成分与无紫外吸收的皂苷类成分，一次测定的时间长达166分钟，条件复杂、耗时太长、耗流动相多、不易重现。(3)指纹图谱测定方法全程分别紫外208nm、266nm检测和ELSD检测，得到3张图谱，色谱峰信息重叠较多，重复测定，给分析带来不便。(4)指纹图谱所提供的化学信息不够，且所提供的色谱峰归属较少，仅有毛蕊异黄酮-7-0-β-D葡萄糖苷、黄芪甲苷两个均归属于黄芪的成分得到指认，尚无指认归属于党参的色谱峰成分。综上所述，现有公开的参芪扶正注射液指纹图谱专利具有较多缺点。

发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，对参芪扶正注射液HPLC指纹图谱进行研究，提供一种操作简便、快速、重现性好的参芪扶正注射液的HPLC指纹图谱构建方法。该方法采用样品在线前处理、简单的HPLC非线性梯度洗脱，在一个流动相系统利用紫外检测波长切换及DAD -ELSD检测器串联的方式检测，一次进样分析得到一张完整的指纹图谱，即可包涵参芪扶正注射液中各类化学成分的信息。本发明所建立的参芪扶正注射液HPLC指纹图谱能全面地反映参芪扶正注射液的整体质量特征，可依据成品、半成品的指纹图谱变化来追根溯源寻找工艺操作中的问题，该指纹图谱化学成分首次得到99%(已知峰占共有峰峰面积比例)以上的指认，可进一步运用于建立参芪扶正注射液谱效学质量控制新模式的研究，从而全面控制产品的质量。因此，新建立的参芪扶正注射液HPLC指纹图谱方法具有普遍实用性。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现这种参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，可采用以下步骤
取参芪扶正注射液样品经O. 45 μ m微孔滤膜滤过，精密吸取75 μ 1，注入双泵双梯度高效液相色谱仪测定。色谱条件 为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温300C ;以乙腈-水为流动相 ，梯度洗脱，流速为O. 6ml/min ;以紫外检测器与蒸发光散射检测器串联检测，且紫外检测波长由266nm /208nm切换的方式检测；理论塔板数按毛蕊异黄酮-7-0-β -D-葡萄糖苷峰计应不低于3000。取腺嘌呤、5-羟甲基糠醛对照品适量，加水制成每Iml含腺嘌呤、5-羟甲基糠醛各O. Olmg的混合对照品溶液；取毛蕊异黄酮-7-0-β -D-葡萄糖苷、党参炔苷、黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含毛蕊异黄酮-7-0-β -D-葡萄糖苷O. 02mg、党参炔苷O. 05mg、黄芪甲苷O. 06mg的混合对照品溶液。对以上对照品溶液按前述方法检测得到对照品溶液的色谱图。对样品的前处理是运用双泵双梯度高效液相色谱仪，通过阀切换系统实现样品的在线自动净化。所述色谱柱包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的预柱和分析柱，通过柱切换技术，实现对参苗扶正注射液样品的自动化前处理及分析。所述流动相的洗脱梯度如下，其中O 40分钟为指纹图谱采集及分析时间，40 60分钟为洗柱时间,记录40分钟色谱图
权利要求
1.一种参芪扶正注射液的指纹图谱的构建方法，其特征包括取参芪扶正注射液样品经O. 45 μ m微孔滤膜滤过，精密吸取75 μ 1，注入双泵双梯度高效液相色谱仪测定；色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温30°C ;以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，流速为O. 6ml/min ;以紫外检测器与蒸发光散射检测器串联检测，且紫外检测波长由266nm /208nm切换的方式检测；理论塔板数按毛蕊异黄酮-7-0-β-D-葡萄糖苷峰计应不低于3000。
2.根据权利要求书I所述参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是，所述色谱柱包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的预柱和分析柱，样品的前处理是运用双泵双梯度高效液相色谱仪，通过阀切换系统，实现样品的在线自动净化；阀切换系统由两个泵，一根预柱、一根分析柱通过高压回路转换阀连接而成，样品从进样器进样后，由装载泵将预处理流动相2%乙腈带入预处理柱，被测化合物被保留在预柱上，而水溶性杂质随预处理流动相排入废液中，之后将阀切换至与分析柱相接状态，分析泵用分析流动相将被测组分正冲入分析柱分离分析。
3.根据权利要求书I所述参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是，采用乙腈-水为流动相进行梯度洗脱0min — 5min,乙腈由2% — 5% ；5min 一 30min,乙腈由5% —30% ；30min — 40min,乙臆由 30% — 60% ；40min — 40. 5min,乙臆由 60% — 90% ；40. 5min —50min,乙臆保持 90% ；50min — 50. 5min,乙臆由 90% — 2% ；50. 5min — 60min,乙臆由保持2% ;其中0 40分钟为指纹图谱采集及分析时间，40 60分钟为洗柱时间，记录O 40分钟的色谱图。
4.根据权利要求书4所述参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是，以紫外检测器与蒸发光散射检测器先后串联检测，且紫外检测波长由266nm /208nm切换的方式检测，共检测出21个共有峰，以[9]号峰毛蕊异黄酮-7-0-β-D-葡萄糖苷为参照，各峰的保留时间与[9]号峰保留时间的比值分别为O. 14,0. 18,0. 25,0. 27,0. 33,0. 41,0. 66、O.75、I. 00、I. 08、I. 10、I. 12、I. 21、I. 29、I. 31、I. 37、I. 41、I. 53、I. 59、I. 63、I. 69 ;其中I 9号共有峰，采用266nm检测得到；10 17号共有峰采用208nm检测得到；18 21号共有峰采用蒸发光散射检测器检测得到。
5.根据权利要求书5所述参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是，对10批参芪扶正注射液进行检测，用指纹图谱相似度评价软件分析得到参芪扶正注射液HPLC标准指纹图谱，具有21个共有峰；其中，归属于党参的特征峰为[I]、[5]、[7]、[10]、[13]号峰，共5个峰；归属于黄芪的特征峰为[3]、[8]、[9]、[11]、[12]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]号峰，共13个峰；两者共有的有[2]、[4]、[6]号峰，共3个峰。
6.根据权利要求书5所述参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是利用对照品对照法确证3号峰为腺嘌呤、5号峰5-羟甲基糠醛、9号峰为毛蕊异黄酮-7-0-β -D-葡萄糖苷、13号峰为党参炔苷、14号峰为芒柄花苷、20号峰为黄苗甲苷；利用UFLC-DAD-MS/MS技术手段对共有峰进行色谱峰归属及峰纯度检查，紫外吸收曲线的比较，并通过质谱中分子离子峰、碎片离子峰的精确分子量匹配、保留时间匹配、同位素峰匹配信息的比较指证 266nml号峰为胞苷、2号峰为尿嘧啶、3号峰为腺嘌呤、4号峰为鸟苷、5号峰为5-羟甲基糠醛、6号峰腺苷、7号峰为党参苷II、9号峰为毛蕊异黄酮-7-0-β -D-葡萄糖苷；208nm 10号峰为党参炔-二-葡萄糖苷、11号峰为异微凸剑叶莎醇_2'，7- 二 -O-葡萄糖苷、12号峰为樱花苷、13号峰为党参炔苷、14号峰为芒柄花苷、15号峰为5-羟基-4' -甲氧基-二氢黄酮-2- a -L-鼠李糖-β -D-葡萄糖苷、16号峰为9，10- 二甲氧基紫檀烷_3_O-β-D-葡萄糖苷、17号峰为异微凸剑叶莎醇-7-0-葡萄糖苷； ELSD 18号峰为黄芪皂苷VI、19号峰为黄芪皂苷ΥΠ、20号峰为黄芪甲苷、21号峰为黄芪皂苷II。
7.根据权利要求书I 权利要求7所述参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法在参芪扶正注射液生产或质量检测中的应用
全文摘要
本发明公开了一种参芪扶正注射液HPLC指纹图谱的构建方法及其应用。包括利用双泵双梯度高效液相色谱仪进行样品的在线自动前处理；采用DAD-ELSD检测器串联、266nm/208nm紫外检测波长切换的检测方式进行测定，得到参芪扶正注射液HPLC指纹图谱。由此方法所得到的参芪扶正注射液HPLC标准指纹图谱检出21个共有色谱峰，并采用UFLC-DAD-MS/MS技术指证指纹图谱中20个化学成分，所述图谱的图形如说明书附图中的

图1所示。本发明的方法能准确地反映参芪扶正注射液的整体质量特征，可以全面监控原料药材、半成品和成品的质量，通过色谱指纹特征相似程度的比较，对其进行质量控制和防伪。
文档编号G01N30/02GK102621244SQ201210083789
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者彭维, 曹晖, 王永刚, 童欣, 苏薇薇 申请人:中山大学